Introduction
Metastaz malignitesi olan hastalarda önemli bir ölüm nedenidir. kanser hücrelerinin metastaz yayılması işlemi tam olarak bilinmemektedir, ancak metastaz, adaptasyon yerinde damar komşu dokulara yayılması, intravasation lenfatiklerin ve damar sistemi, yaşam süresinde ve translokasyon dolaşım sistemi içinde, ekstravazasyonu dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir gözükeceği çoğalması ve ikincil tümörlerin oluşumu ile yeni yerinde yeni yeni sitenin mikroçevresinin ve kolonizasyon. 1 bu biyolojik olayların her metastatik tümör hücrelerinin dönüşümü, yayılmasını ve hayatta kalma içerir. Örneğin, hücre dışı matris ile başarılı bir etkileşim ile birlikte mezenkimal fenotip tümör hücresi epitel fenotipinin dönüşüm, invazyon ve vücudun diğer bölgelerinde metastaz olanak tanımaktadır. 2,3 Ayrıca, bu metastatik hücrelerbünyesinde bir uzak yerinde implante edildiğinde dolaşan kan içinde hayatta ve ev sahibi bağışıklık gözetim kaçınmak gerekir. 4,5 Nihayet, tümör hücreleri ikincil tümörler çoğalmaya ve oluşturmak için kendi mikroçevresinin uyum sağlamak zorundadır. 6,7 nedenle metastaz kanser hastaları arasında yaygın bir olgu olmasına rağmen, metastatik tümör hücrelerinin terapötik müdahale için uygun olan açığına birden alanlar var.
Melanom immünojenik doğası ve immunoterapi son faiz göz önüne alındığında, melanom için modeller. Gittikçe yararlıdır yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde 8, melanom yılda yaklaşık 9.000 ölüm nedenidir. Melanom metastazı 9 Ortak yerleri, beyin kemikler , karaciğer ve akciğer. uzak bölgelere metastaz çoğunluğu kan yoluyla ortaya çıkar. Kandaki dolaşan tümör hücrelerinin bağışıklık açıklığını kaçmasına distal organ bir kılcal yatak ulaşmalıdır vebaşarılı bir şekilde kendilerini oluşturulması için kan damarı endotel hücreleri ile işgal. 4-7,10, 11
metastaz yaygın ve öldürücü olayları taklit etmek, fare B16-BL6 hücre hattı oluşturuldu. Ebeveyn C57BL / 6 melanom hücre hattı B16-F0 bir decedent, B16-BL6 mesane membran penetrasyonu 6 arda seçimleri ve ardından (B16-F10 sonuçlanır) damar içi enjeksiyon ile ilgili akciğer metastazı 10 birbirini takip eden seçimleri, son ürünüdür. Bu nedenle 12, bu da özellikle damar içine enjekte edildiği zaman farelerde metastaz odakları kurulması için güvenilir bir melanom hücre hattıdır. 13
implantasyon ve B16 / BL6 hücrelerinin büyümesini sağlamak için iki veya daha fazla hafta ardından B57BL / 6 fare kuyruk venine B16-BL6 hücrelerinin yeterli miktarda, enjeksiyonundan sonra, metastatik odaklar akciğerlerde oluşturacaktır. Diseksiyon mikroskobu ile ötanazi ve incelenmesi üzerine, sayısıBireysel odaklar mevcut belirlenebilir. enjekte B16-BL6 hücrelerinin sayısı akciğer yüzeyi üzerinde oluşturulmuş odaklarının sayısı ile ilişkilidir gibi bu da, bir doz-metastazı etkisi oluşturmak için de kullanılabilir. Bu model bilinmektedir metastatik hücrelerin soruşturma akciğer, karaciğer veya başka bir organda hızlı ve öngörülebilir yayılmasını ve kurulmasını kolaylaştırmak, kan dolaşımına doğrudan tanıtıldı "deneysel metastaz" olarak bilinir. Bu tümör hücreleri genellikle deri altına implante edilir "spontane metastaz," aksine, ve organik kanser hücrelerini döken gelen metastaz kaynaklanmaktadır. 14,15
Farelerin kuyruk venleri içine B16 / BL6 hücrelerinin, uygun bir miktarı enjekte edilmesi önemlidir. Çok sayıda ve akciğer metastazları ile ele alınacaktır ve komşu odaklar birbirinden ayırt olacaktır. Çok az ve terapötik bir maddenin etkisi nedeniyle doğal değişkenlere ayırt edilemez olacakenjeksiyonlar arasında ations. C57BL / 6 farelerinin akciğerlerinde üzerine odaklar optimal sayısı elde etmek için, hesaba bireyin ayırt edilebilirliğini çekerken akciğer yüzeyine yerleşik metastatik odaklarının miktarı ile enjekte edilen hücrelerin sayısı ilişkilendirmek için gerekli olan odaklar. Bu protokol, C57BL / 6 fareleri için metastatik kemirgen melanoma modeli gösterecektir.
Protocol
Etik Beyanı: Araştırmaya farelerin kullanımı, temel biyoloji veya hastalığın nihai tedaviye yönelik insan anlayışı ilerletmek olabilir durumlarda kabul edilebilir.
1. Sipariş
- Satın alma dişi C57BL / 6 fareleri (6 yaş - 8 hafta), grup başına 5 fare. fareler için birkaç gün ayarlamak için izin ver.
B16-BL6 hücrelerinin 2. Hazırlık
- steril bir başlık 37 derecelik kuvöz ve yerden hücre kültür plakaları çıkarın. Plakalar, B16-BL6 murin melanom hücreleri ile yaklaşık% 70 konfluent olmalıdır. Daha büyük bir izdiham hücreleri metastatik potansiyeli değiştirebilir.
- 1 dakika boyunca bekletin, plaka başına 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve sonra tripsin-medya çözümü aspire.
- plaka başına tripsin 1 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca inkübatör plakaları döndürür.
- Steril kaput inkübatör plakaları hareket sonra serumsuz Rosewell Park Memorial Institute Mediu'nun 4 ml eklemekHer plaka için M (RPMI).
- steril, motorlu pipetle hücreler toplanır. Hücreleri yukarı kırmak için, çok hafif bir açıyla basılı ucu, plakanın alt karşı hücreleri çıkarın. Aksi takdirde çıkarma iğne tıkanmasına neden olabilecek hücre kümeleri, yeterli ayrılmasını sağlamak amacıyla birkaç kez tekrarlayın. Hatırlamak ve 50 ml konik tüp aktarın.
- Hücre yoğunluğu belirlemek için bir hemasitometre kullanarak. Sabit B16-BL6 hücrelerinin toplam sayısını tutulması, serumsuz RPMI miktarını belirlemek 0, 0.065, 0.015, 0.25 ve 0.5 milyon hücre / ml nihai konsantrasyonları elde etmek için gerekli.
- Eşit 15 ml konik tüpler 50 ml tüp medya bölmeyin. 5 dakika boyunca 2,250 x g'de konik tüpler santrifüjleyin. medya süzün. serumsuz RPMI uygun bir hacmi ilave edin ve hemasitometre ile arzu edilen hücre yoğunluğu teyit etmektedir. Ek RPMI ekleme veya iplik ve buna göre daha küçük bir düzeyde hacim içinde yeniden süspanse edilerek densities- ayarlayın.
- Kısım 500 ulbuz üzerinde etiketli 1.8 ml tüpler içine her bir hücre süspansiyonu.
3. Kuyruk Ven Enjeksiyon
- kuyruk tarafından düzenlenen bir fare, alın ve fare süzgeç içine arka önce onu yönlendirir. Bunun dışında kuyruk ile sabitleyicinin ana odasındaki gövde ile, süzgeç sonuna doğru fareyi çekin. Fare güvenli olana kadar itmeye devam süzgeç-piston yerleştirin.
- yanal kuyruk venleri bir yukarı baktığından emin 90 derece gibi fare döndürün. bir alkol takımını kullanarak, şiddetle kuyruk ven en görünür olduğu durumlarda, fare kuyruğunun tarafını temizlemek.
Not: İyi bir aydınlatma B57BL / 6J fareler üzerinde etkili kuyruk ven görünüm için esastır. Isı lambaları ya da ısıtılmış ameliyat yastıkları, gerekli olmasa da, aynı zamanda kuyruk ven hacmini arttırarak yardımcı olacaktır. - Bir steril kültür kaput, 2.000.000 hücre / ml'lik bir tüp hücre kültür ortamında 300 ul toplar. s Flicking, iğne ters çevirinide ve şırınga kabarcıklar çıkarmak için, dalgıç bastırıyor. 250 ul son hacim elde etmek için kültür-RPMI çıkarın.
- baskın olmayan el ile fare kuyruğu uzatın. baskın olmayan el işaret parmağı ile yükseltilmiş kuyruk yakın ucuna, ve başparmak ile depresif kuyruk distal kısmı ile kuyruk tutun.
Not: Bu şekilde, kuyruk damarından, lateral bir pozisyonda tutulur, kuyruk daha uzak kısmında mümkün olan bir uyumlu girişle, engelleyicinin yüzeyine paraleldir. - ile başlayan bir dakika aşağı doğru bir açıyla, distal ucuna doğru, kuyruk damar içine iğne takın ve daha sonra (iğne şırınga göreli piston ucunu düşürücü) daha fazla ekleme üzerine kuyruk damarından açısını maç için iğne ayarlamak .
- kuyruk damar içine iğne yaklaşık 1 cm yerleştirin. yerleştirildikten sonra iğne sabit tutarak, pistonu itmek başlar.
Not: iğne kuyruk ven ise ve iğne ucu not medya damar içine engellenmeden akması gerektiğini engel. Etkili enjeksiyonu, damar kan açıklık ile karakterize edilir. Orada direnç, ya da bir kabarcık enjeksiyon yerinde oluşturmak için başlarsa, iğne kaldırmak ve kuyruk damarından boyunca daha yakın bir yerde tekrar deneyin. - damardan iğne çıkarın ve atın. herhangi bir kanamayı durdurmak için giriş sitesine karşı gazlı bez tutun.
- süzgeç pistonu çıkarın ve alıcı kafese fareyi koyun.
- Diğer tüm konsantrasyonları için tekrarlayın.
Not:. Akciğer odak kuruluş yaklaşık 2 alır - değişkenlik hücre hattı ve odaklar istenen boyutuna bağlı olarak, 3 hafta 9 Bu arada, fareler aşırı nefes nefese gibi, erken ötenazi garanti verebilir belirtiler açısından takip edilmelidir.
4. Akciğer Foci Sayma
- CO2 bir CO2 odası içinde yerleştirilmesi ve% 100 açığa fare Euthanize
- Strafor fareyi splay. cerrahi makas kullanarak, sternum boyunca bir cerrahi kesi oluşturun.
- sternum kesi üstünden ve kaburga kafesinin açığa fare omuzlara doğru dallanma, hem iki ek kesiler olun.
- akciğer ve kalp açığa gövde gelen göğüs kafesini kaldırmak için, iki kesim, sternum yan kenarları boyunca her olun.
- cerrahi cımbız ile kalbi Holding, fare kalbi ve akciğerleri serbest, yemek borusu ve soluk borusunu kesti. Daha iyi görünüm için, 10X büyütme, bir mikroskop altında yerleştirin.
- Sadece iki akciğerleri bırakarak, akciğerlerden kalbin parçalara ayır ve timus çıkarın.
- Diseksiyon kapsamı altında akciğerler ile, akciğer odakları saymak başlar. Her odakları akciğerlerin yüzeyinde dairesel, kahverengi sırnaşma olarak görünmelidir.
- İçinfareler arasındaki tutarlılık, bir lobun yüzeyinde odaklarının sayısını ve o lob ters çevirin. Dört lobların her yapıyor ayrı ayrı kolay sayım için izin verir.
- kalıntılarını atmak, aksi halde, Kaydet ve IHC performans eğer akciğerlere düzeltmek.
Representative Results
görsel inceleme üzerine, yüzey odaklarda varyasyonu görülmektedir. bir mikroskop altında tümörlerin sayısını sayma enjekte tümör hücrelerinin sayısı ve elde edilen sayısı ve sayılabilir odaklar arasındaki doğrusal bir ilişki verim gerekir. Enjekte edilebilir hücrelerin optimal numarasını kullanarak, hedef, 62.500 hücre / ml 125.000 hücreleri onlar / Şekil 1A 500,000 hücre / ml'de, ve çok seyrek kapsamadığı şekilde, akciğerler tamamen kapalı olmayan bir olup mi. Bu, doğrusal bir korelasyon (Şekil 1B) nicelleştirilebilmektedir.
Kuyruk Ven Kaynaklanan Şekil 1. Akciğer Foci B16 / BL6 Hücreleri Enjekte. (A) Akciğer odakları (oklar altında temsili odaklar) kahverengi dairesel kitleler olarak C57BL / 6 farelerden alınan akciğerlerin yüzeyinde görülebilir. dens olarak(Her görüntünün üzerinde) enjekte hücre kültürü lık yani (her görüntünün altında) akciğer odaklar ortaya çıkan karşılık gelen sayıda yapar artırır. enjekte edilen hücrelerin en yüksek yoğunlukta fareden akciğerler, akciğer odaklarının en büyük görsel kapsama sahiptir. Ölçek çubukları 20 mm temsil etmektedir. Hücre kültürü yoğunluğunun akciğer odakları nisbetle (B) Numaralama. Hemasitometre tarafından belirlenen 125,000 hücre / ml'nin üzerinde yaklaşık doğrusal bir ilişki vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Uzak yerlere kılcal yatak kendilerini kurarak bazen, birincil büyüme siteleri kaçmasına metastaz temsil ve kan ya da lenf sistemi gibi yollarla göç bir kuyruk damar enjeksiyonu gelen dolaşan tümör hücrelerinin. 14 protokol yukarıda açıklanan ikincil bir model olarak hizmet vermektedir metastaz. Enjekte B16-BL6 hücrelerinin ideal bir sayıda, deneyci kanser hücre metastazı üzerinde uygulanan ilaç veya bağışıklık hücre nüfus, post-nötralizasyon göreceli etkisini belirlemek olabilir.
Bu protokol sınırlamaları vardır. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin özellikleri için seçilmiş ve majör histokompatibilite kompleks sınıfı 1 moleküllerinin düşük düzeylerine sahip, bu yüzden imünojenik olan edilmiştir. 12 ayrıca, metastaz sayıda ani ve kümelenmiş bir giriş hastalarda normal senaryosunda aksine nerede metastatik tümör hücrelerinin küçük numaralarprimer tümör konumundan uzun bir zaman süresi içinde dağıtır. Buna ek olarak, intravenöz olarak ortaya tümör hücreleri doku kültüründen ve bir primer tümör kökenlidir. Bu nedenle, bu hücreler, hücre yapışması, göçü, bağışıklık tanıma ve alıcı organı kurulması değişiklikler sonucu ikincil metastazlar benzemez. 15,16
Alternatif bir protokol primer tümörlerin üretimi ve elde edilen "kendiliğinden" pulmoner metastazların analizi için B16 / BL6 deri altından enjeksiyonu olabilir. Bu "kendiliğinden" metastaz kendi "deneysel" muadillerine göre daha heterojenitesini ihtiva bulunmuştur, daha yakından insan hastaların bu bulundu. protokol metastaz üzerinde deneysel bir bileşiğin etkisini belirlemek için onun yetenek kısıtlamaktadır. bir yanal kuyruk damarı enjeksiyonu ile, kan dolaşımına enjekte melanom hücrelerinin sayısı saat ile yaklaşık olarak hesaplanabiliremocytometer. "Spontane" metastaz ile, ancak, akciğer odakları ortaya çıkan sayısında ek değişken ekleyerek, tümörler arasında daha farklılıklar bulunmaktadır. 16
Sonuç olarak, kuyruk ven B16-BL6 fare melanom modeli metastaz bir tedavi veya immünoterapi etkisini belirlemek için basit bir modeli temsil etmektedir. intravenöz dolaşımdaki tümör hücrelerini enjekte ederek, araştırmacılar bir ölçüde, hastalar sonrası metastaz için, çoğaltabilirsiniz. Kanser hastalarında metastatik tümör hücrelerinin yıkıcı etkilerini göz önüne alındığında, bu model metastaz çok adımlı süreci anlamak için güçlü bir araçtır.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Ulusal Kanser Enstitüsü hibe 1R03CA172923 kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A.
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M.
- Elkin, M., Vlodavsky, I.
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
