Проектирование и разработка аптамеров-Gold наночастицу Based колориметрического анализа для В полевых условиях приложений

Summary

Дизайн и разработка анализа наночастиц колориметрического аптамеры золота для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Кроме того, смарт-устройство колориметрический приложение (приложение) было подтверждено и была создана для использования в полевых условиях длительного хранения анализа.

Abstract

Дизайн и разработка аптамеров-наночастиц золота (AuNP) колориметрического анализа для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Целевая селективный AuNP цвета Анализы, основанные были разработаны в контролируемых доказательство правильности концепции лабораторных условиях. Тем не менее, эти схемы не оказывали до точки отказа, чтобы определить их практическое использование вне лабораторных условиях. Эта работа описывает общий подход для проектирования, разработки и устранения неисправностей в колориметрического анализа аптамеров-AuNP для малых аналитов молекулы и с использованием анализа для установки в полевых условиях. Анализ является предпочтительным, так как адсорбированные аптамеры пассивации поверхности наночастиц и обеспечивают средства для уменьшения и устранения ложных положительных ответов на нецелевых аналитов. Переходить эта система для практического использования требуется определения не только срок годности анализа аптамеров-AuNP, но создание методов и процедур для расширения долгосрочного хранения capabilностями. Кроме того, один из признанных проблем с колориметрического считывания является нагрузку на аналитиков, чтобы точно определить, часто тонкие изменения в цвете. Чтобы уменьшить ответственность на аналитиков в области, протокол цветовой анализ был разработан для выполнения цветовой идентификации обязанностей без необходимости выполнения этой задачи по лабораторным оборудованием класса. Способ создания и тестирования протокола анализа данных описан. Однако, чтобы понять и влиять на разработку адсорбированных аптамеров анализов, взаимодействия, связанные с аптамеров, цели и AuNPs требуют дальнейшего изучения. Полученные знания могут привести к покрой аптамеры для улучшенной функциональности.

Introduction

Колориметрия является одним из старейших методов, используемых в аналитической химии. Для реализации этой технологии, качественное или количественное определение аналита производится на основании производства окрашенного соединения ^1. Как правило, цветные анализы используют реагенты, которые испытывают сдвиг цвета в присутствии вида аналита, что приводит к наблюдаемому или обнаруживаемое изменение цвета в спектре видимого света. Колориметрические был использован в обнаружении целей , начиная от атомов, ионов и малых молекул до сложных биологических молекул , таких как дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), пептидов и белков ^2-4. За последние два десятилетия, наноматериалы революцию в области анализов обнаружения, особенно в анализах на основе цвета ^5-6. Сочетание уникальных химических и физических свойств наноматериалов с элементом целевой селективного распознавания, такие как антитела, олигонуклеотидных аптамеров или пептидные аптамеры, привело к всплеску яп проектирование и разработка колориметрических анализов обнаружения ^7.

Наночастицы металлов имеют подтвержденную зависящее от размера, свойство изменения цвета, которое было использовано при разработке многочисленных колориметрических анализов. Наночастицы золота (AuNPs) представляют особый интерес из - за отличительного красного к синему сдвига цвета, когда дисперсный раствор частиц индуцируется агрегировать ^8, как правило , за счет точного добавления соли. Способность контролировать переход от дисперсного (красный) с совокупными (синий) государств привело к созданию колориметрических датчиков для ионной, небольшой молекулярной, пептидов, белков и клеточных мишеней ^2-4,9. Многие из этих датчиков используют аптамеров в качестве мотива цель распознавания.

Аптамеры представляют собой ДНК или рибонуклеиновой кислоты (РНК) , молекулы , выбранные из случайного пула 10 ¹² -10 ¹⁵ различных последовательностей ^10-11. Процесс отбора определяет целевые повторнокогнитивные элементы с аффинностью связывания в режиме низкой наномолярной, и Систематическое выделение лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) является наиболее широко известным процессом ^12-13. Преимущества аптамеры на основе олигонуклеотидных для приложений зондирования включают в себя простоту синтеза, управляемую химическую модификацию и химическую стабильность ^14-15.

Один из подходов к созданию колориметрического анализа сочетает в себе наноматериалы с элементами распознавания, состоит из сочетания этих двух видов через физической адсорбции ДНК-аптамеров молекул до AuNP поверхностей. С помощью связывания мишень-аптамеров, аптамер испытывает структурные изменения , которые изменяют ^16-18 взаимодействие аптамеров с поверхностью AuNP, что приводит к индуцируемым красного к синему цвета реакции ¹⁹ с добавлением соли. Эта удивительная особенность AuNPs обеспечивает наблюдаемый колориметрического механизм реагирования для устройств аптамеров основе, которые могут быть использованы для снятиязнак колориметрических анализов для различных аналитов.

Цветные анализы, разработанные с использованием нековалентных, физически адсорбированных аптамеры ДНК на AuNP поверхностях имеют клеймо быть слабым датчик платформы из-за проблем с надежностью, склонность к недостаточности вне контролируемых лабораторных условиях, а также отсутствие информации, доступной для использования в практической настройки. Тем не менее, на основе аптамеров-AuNP колориметрический анализ представляет интерес из-за простоты эксплуатации и наблюдаемой реакции цвета. Целью данной работы является создание протокола для проектирования, разработки, эксплуатации, уменьшение поверхности, связанных с ложной положительной реакции, а также длительного хранения ДНК-AuNP на основе колориметрического анализа с использованием кокаина в качестве репрезентативного аналита. Кроме того, мы предложили эту адсорбированный аптамеров анализа подход (Рисунок 1) как выгодно благодаря простоте и легкости в использовании , что привело к уменьшению числа стадий , чем при традиционном подходе для этих аптамеров-AuNP попкуAYS. Для этого теста, аптамер впервые был добавлен к AuNPs, которые позволяют адсорбироваться на поверхности в течение длительного периода времени. Дополнительным преимуществом такого подхода является сокращение реакции на нецелевых молекул аналита, связанных с поверхностными взаимодействий AuNP. Тем не менее, снижение ложных срабатываний ответ был за счет чувствительности анализа. Поэтому баланс между защитой поверхности и аналита доступности необходимо для поддержания нормальной функции анализа. Кроме того, основным недостатком анализа цветовых анализов с помощью иных средств, чем при помощи приборов является то, что результаты часто субъективны и открыты для интерпретации от аналитика к аналитику, в частности, при попытке дифференцировать тонкие различия в цвете. С другой стороны , существует целый ряд проблем , с возможностью создания на основе Instrumentation Laboratory полезной вне лаборатории, такие как наличие силы, практичности с портативностью и т.д. В этой работе, протокол анализа цвета был разработан для море портативность и устранить некоторые из догадок , обычно связанных с интерпретацией цвета на основе анализа ^20-21. По сравнению с предыдущими подходами, это усилие стремится подтолкнуть этих анализов в свои пределы для применений, помимо лабораторных условиях.

Protocol

1. Синтез с помощью цитрата Сокращение наночастиц золота (AuNP) и характеристика

1. Очистите коническую колбу (500 мл) и большой мешалку с 5 мл концентрированной азотной кислоты и 15 мл концентрированной соляной кислоты в химическом защитном кожухе.
   1. Влажный всю поверхность колбы с кислотной промывкой, смыва колбы нуклеазой свободной воды, и позволить колбу высохнуть.
2. Добавляют 100 мл 1 мМ золота (III) хлорида; следует использовать лист алюминиевой фольги, чтобы покрыть верхнюю часть кислотной очистке колбу Эрленмейера и тепла при непрерывном перемешивании на горячей плите до кипения.
3. Добавьте 10 мл 38,8 мМ цитрат натрия. Цвет меняется от прозрачного / серого, до темно-синий / черный, и, наконец, темно-красный в течение нескольких минут. Продолжайте перемешивание с помощью тепла от 10 мин.
4. Дать суспензии AuNP остыть до комнатной температуры и добавляют 110 мкл диэтилпирокарбонатом (DEPC) при непрерывном перемешивании.
5. Покройте всю колбуалюминиевая фольга и позволяют лечение DEPC инкубировать в течение ночи. Храните все AuNPs в темноте, в контейнерах для хранения янтарных или покрытые алюминиевой фольгой.
6. Автоклава подвеску AuNP, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через 0,22 мкм поры мембраны из ацетата целлюлозы. Храните фильтрованную, автоклавного маточного раствора AuNP в темноте при 4 ° С.
   Примечание: Лечение с помощью DEPC, стерилизации в автоклаве, и хранение при 4 ° C улучшит срок годности анализа аптамеров-AuNP. Хранение таким образом позволит анализа оставаться функциональным в течение более 2-х месяцев.
7. Вычислить концентрацию AuNP путем получения ультрафиолетовый-видимый поглощение при длине волны 520 нм, и используют коэффициент экстинкции (ɛ) 2,4 × 10 ⁸ л моль ^-1 см ^-1 с законом Бера путем вычисления концентрации (с). Концентрация была определена в 10 нМ с размером 15 нм, определенной методом динамического светорассеяния.
   Примечание: Концентрации будет варьироваться фром от партии к партии. Развести запасы AuNP с нуклеазы свободной воды по мере необходимости для поддержания желаемого 10 нМ AuNP суспензии.

2. ДНК-аптамеров, буфер, раствор и анализа Получение

1. Покупка или синтезировать связывания аптамеров последовательностей с использованием стандартной химии ²² фосфорамидитную следующий кокаин:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT ССТ TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT ССТ TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Очищают аптамеров с использованием стандартных обессоливания ^23. Развести олигонуклеотиды в нуклеазы без воды на скорости либо 100 мкМ или 1 мМ маточных растворов. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
3. Покупка или готовить запасы стерильного 1 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) , рН 7,4, 100 мМ хлорида магния (MgCl _2), и 1 М хлорида натрия (NaCl).
4. Приготовьте 50 мл буфера в нуклеазы без воды Wiй концентрации 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,4 и хранят при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
5. Инкубируйте ДНК с раствором запас AuNP (10 нМ) в течение 3-4 ч при комнатной температуре и защите от света. Изменять объем AuNPs в соответствии с пожеланиями, чтобы обеспечить достаточное количество образца для испытания должны быть выполнены (2,5-7,5 мл).
   1. При этом использовать загрузку плотности 90, 120, 150 и 180 молекул ДНК / AuNP в этой работе. Изменять объем и концентрации ДНК соответственно. Настройтесь охват ДНК, чтобы уменьшить непреднамеренные AuNP связанных с цветом поверхности ответов нецелевых аналитов.
      Примечание: Увеличение охвата ДНК приводит к ухудшению чувствительности анализа. Плотности погрузочные вычисляются зная концентрацию запаса AuNP, и подсчете общего количества AuNPs, присутствующих в объеме, требуемой для использования в экспериментах. Если фактические плотности покрытия желательно, протоколы существуют для получения этих значений ^7. Охват ДНК определяли с использованием 50 кДа-мolecular масса отсечки спин колонки для разделения AuNP связанной ДНК из свободной ДНК. В AuNPs слишком велики, чтобы пройти через ротационную колонку, в то время как свободная ДНК будет проходить через легко. Следующим шагом для количественного определения свободной ДНК, собранной с использованием измерений оптической плотности или одноцепочечной ДНК флуоресцентный краситель.
6. Добавить равный объем 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,4 буфера и поместить образец при 4 ° С в темноте в течение ночи. Анализ аптамеров-AuNP был в 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl _2, рН 7,4 (буфера для тестирования ).

3. Соль титрование и настройка Анализ

1. Определить начальную концентрацию соли, необходимой для индукции анализа ответа цвета солью титрования с анализа пустым. Добавьте 20 мкл метанола (пробел) до 180 мкл аликвоты аптамеров-AuNP анализа в 96-луночный планшет. Titrate образцы с увеличением объемов исходного раствора NaCl (1 М или 2 М) и определить точку эквивалентности (рис 2 Примечание: Анализ можно масштабировать до меньших объемов, сохраняя соотношение количества метанола заготовки (или растворенной анализируемого вещества) к аптамеров-AuNP анализа то же самое.
   1. При этом определить объем NaCl, необходимое, чтобы вызвать малейшее изменение цвета с помощью визуального наблюдения. Исходным концентрации для анализа было 75 до 130 мм для MN4 и MN6 соответственно в / AuNP плотности покрытия 60 молекулы ДНК.
      Примечание: Для количественного определения для начальной концентрации соли, средняя точка кривой титрования служит хорошей отправной точкой. Кроме того, используемые концентрации будут варьироваться в зависимости от аптамеров, плотности покрытия ДНК, изо дня в день работы, и от партии к партии.
2. Оптимизация отклика для анализа, добавить 20 мкл разбавленных молекул аналита в метаноле до 180 мкл аликвоты аптамеров-AuNP анализа в 96-луночный планшет при комнатной температуре. Сразу же добавить концентрацию NaCl, определенный в предыдущем шаге, чтобы инициировать реакцию анализа цвета.
   НЕТTE: Используйте многоканальную пипетку для выполнения нескольких экспериментов одновременно.
3. Получить наибольшее изменение цвета, возможно путем увеличения или уменьшения концентрации NaCl, и сравнение целевого ответа на пустой ответ. Используйте концентрацию NaCl, которая обеспечивает самую большую разницу отклика.
4. Заметим, или измерения отклика анализа 150 сек следующий NaCl дополнение. Анализ оптической плотности при длине волны 650 нм и 530 нм с помощью спектрометра или получить цифровой фотоаппарат ответа анализа (смотри раздел 4 для протокола анализа фото).
   Примечание: микропланшет-ридера использовалась при получении измерения для этой работы.
5. Plot результаты как отношение оптической плотности , полученные при 650 нм и 530 нм (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ в зависимости от концентрации аналита. Нормализовать реакцию анализа на чистый сигнал, как это было сделано в этой работе.

4. Фото и цифрового анализа изображений цвета Анализ протокола

1. ДГОе образцы анализа, как было описано (разделах 3.2-3.3). Поместите 96-луночного планшета на просвечивания.
   Примечание: Стандартная лаборатория трансиллюминатор, как правило, слишком яркий, чтобы получить пригодные для использования цифровых изображений для этого анализа. Эти Трансиллюминаторы вызывают регулярно расположенные "темные линии" появляться в цифровом изображении благодаря интенсивности источника света. Создание просвечивания из светодиодах (LED) на основе светового короба и кусок из матового пластика работает хорошо.
2. Получить фотографии 96-луночный планшет при 150 сек после NaCl Кроме того, импортировать изображения в программное обеспечение для анализа изображений, а также рассчитать средние красного, зеленого и синего (RGB), используя инкрементный метод усреднения, как показано в уравнении 1 ^24:
   (1)
3. Преобразование значения RGB из стандартного RGB (SRGB) цветовое пространство для диаграммы цветности (CIExyY) цветового пространства, с использованием следующих уравнений ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Преобразование экспоненциальные значения RGB для линейных значений RGB с использованием уравнения 2. Матрица указано в уравнении 3 используется для расчета X, Y и Z значения МКО цветового пространства ^24.
5. Вычислить значения х и у , используя уравнение цветности 4 , представляющий средний цвет пикселов в области , выбранных для анализа ^24.
6. Проведение анализа в каждую лунку и построить значения цветности для генерирования калибровочной кривой (рисунок 4). Получить стандартную ошибку, анализируя цвет различных областей той же скважине.

5. Замораживание Аптамер-AuNP Анализ для долгосрочного хранения

1. Подготовьте аптамеров-AuNP компоненты анализа, как описано в разделах 2.4 и 2.5, Сделать отдельные растворы, содержащие 1 г / мл трегалозу и 1 г / мл сахарозы в нуклеазы без воды, чтобы сделать криогенной решение.
   Примечание: Высокие концентрации трегалозы и сахарозы использовались для снижения коэффициента разбавления при приготовлении теста для замораживания. Нагреть сахарные растворы на плитке в стакане воды, чтобы полностью растворить сахар перед употреблением.
2. Приготовьте раствор, содержащий 19,2 мг / мл трегалозы и 4,8 мг / мл сахарозы с 60 MN4-ДНК / AuNP анализа при конечном объеме 200 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Конечные концентрации криогенного решение будет меняться в зависимости от покрытия ДНК.
   Примечание: Образцы должны быть заморожены, не должна превышать 300 мкл. Большие объемы могут не замерзает должным образом.
3. Флэш заморозить образцы с использованием -146 ° C морозильнике или в жидком азоте. Хранить образцы замораживали до использования. Хранение может быть в -80 ° С или -20 ° С, как только вспышка замораживания завершена.
4. Для этой работы, оставьте образцы в -146 ° C морозильнике надночь, а затем передать в морозильной камере -20 C ° для длительного хранения.
   Примечание: Вспышка замораживание может привести к аптамер-AuNPs агрегировать. Проверьте целостность процесса замораживания путем мониторинга профиля оптической плотности и сравнивая его с незамерзшей образца. Если наблюдается агрегация, увеличение количества криогенного раствора, чтобы компенсировать эту проблему.
5. Растаяйте образцов при комнатной температуре и использовать достаточно только по мере необходимости образцы для проведения экспериментов. Получить спектры поглощения образцов талых и сравнить с исходным спектров незамороженном криогенного раствора обработанного образца. Измеряют поглощение от 400 нм до 700 нм.
6. Выполните титрование соли (раздел 3.1), тест анализа (раздел 3.2), и сюжет результатов (разделы 3.3 и 3.4), как описано выше.

Representative Results

Основная цель данной работы заключалась в разработке и исследовать стабильность и надежность аптамеров на основе AuNP колориметрического анализа для использования в полевых условиях. Как было отмечено в предыдущей публикации, две различные стратегии для создания анализа были исследованы ^7. Анализы были названы Свободную аптамеров Пробирной и адсорбированная аптамеров анализа. Адсорбированная Аптамер Анализ был более привлекательным для целей анализа на fieldable обнаружения (рисунок 1).

. Рисунок 1. Схематическое изображение адсорбированная аптамеров Пробирной аптамера смешивали с AuNPs и инкубировали в течение ночи; молекулы аналита, растворенные в метаноле добавляли к Поглощенная аптамеров Assay, сразу же с последующим добавлением хлорида натрия (NaCl), чтобы вызвать агрегацию AuNP при добавлении мишени.эф = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Это было связано с уменьшением ложных срабатываний до нецелевых аналитов, относительной простоте и легкости использования адсорбированного аптамеров анализе. Для приготовления адсорбированная аптамеров анализе ДНК-аптамеров смешивали с AuNPs и инкубировали в течение ночи в буфере для анализа. Это позволило аптамеров к легко адсорбирует на поверхности AuNP, что привело к снижению чувствительности анализа ложных положительных ответов на нецелевых молекул анализируемого вещества, такие как маскировка или режущие средства. Тем не менее, только предварительно сформированный состав аптамеров MN4 кокаина был активен в присутствии кокаина (цель) в этой конструкции для анализа. Анализ был применен путем добавления аналита растворов с последующим немедленным добавлением соответствующего концентрации NaCl. Солевые растворы были использованы для инициирования наблюдаемой и MEAизмеримое изменение цвета анализа. Анализ был выполнен в течение 2-3 мин. После добавления раствора анализируемого вещества.

Критическим действие при выполнении этих физадсорбированных колориметрических анализов на основе ДНК является индуцированный ответ цвет, за счет добавления соответствующей концентрации соли. Добавление солей известны дестабилизировать суспензии AuNP что приводит к агрегации частиц путем маскировки отрицательных зарядов цитрата слоя, стабилизирующих AuNPs, а затем уменьшает агломераты электростатического взаимодействия. Результатом является наблюдаемое изменение цвета красного к синему. Тот же самый эффект наблюдается с ДНК обрабатывали AuNPs. В случае ДНК-аптамеров, аналитик определения концентрации соли, необходимой, чтобы вызвать минимальную наблюдаемую AuNP дестабилизацию (синее окрашивание). С добавлением цели, стабилизация AuNPs по ДНК-аптамеров значительно снижается в результате чего OBSErvable, измеримыми целевая доза изменение цвета реакции. Это изменение цвета может восприниматься только с добавлением соответствующего заранее определенного количества соли.

Не менее важным является процесс, в котором была определена соответствующая концентрация соли. Это было достигнуто путем выполнения кривой титрования, добавляя возрастающие концентрации раствора хлорида натрия в серии анализов заготовок (рисунок 2).

Рисунок 2. сальтационное кривая титрования. Цитрат-стабилизированной (красный), MN4 кокаина связывания аптамеров (зеленый) и MN6 кокаина связывания аптамеров (сиреневые) обработанные образцы AuNP титруют раствором хлорида натрия (NaCl). Начальные концентрации соли, полученные визуально были обозначены с соответствующими цветными стрелками для каждой кривой. Столбики ошибок определяются стандартным отклонениемтройные измерения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

При этом начальная концентрация соли используется определяли путем визуального осмотра, и принималась концентрацию соли, которая вызвала малейшее синее окрашивание наблюдаемое с анализа заготовки. Однако для более количественного подхода, исследователи новых в этой области исследований можно использовать среднюю точку точки титрования эквивалентности в качестве исходной концентрации соли. За этой точкой ответ цвет начинает быстро увеличиваться. Кроме того, концентрация соли используется при выполнении анализа была скорректирована, чтобы максимизировать разницу в цвете между анализа пустых и кокаина ответов. Это было достигнуто за счет увеличения и уменьшения концентрации соли от суммы, определенной путем титрования. Процедура соли титрование проводили ежедневноучета изменчивости изо дня в день с анализом. Изменчивость партии в соленой концентрации , необходимой для анализа было не более чем на 20%. Рисунок 2 состоит из трех отдельных образцов AuNP, цитрат-стабилизированного (без ДНК), MN4 (ДНК-аптамеров стабилизированный) и MN6 (ДНК-аптамеров стабилизированные). Охват ДНК для Мп4 и MN6 образцов были 60 молекул ДНК / AuNP, и каждая кривая титрования имеет другую точку титрование эквивалентности и среднюю точку на основании уровня стабильности, обеспечиваемой обработкой поверхности. Цитрат лишь в незначительной степени стабильности, MN4 (двухцепочечная как структура), при условии большей стабильности и MN6 (одноцепочечной как структура), при условии наиболее стабильность к AuNPs. Начальные концентрации соли, используемые в данной работе были определены как ~ 50 мМ, ~ 90 мМ, и ~ 130 мМ визуально. Тенденция согласуется с обычным пониманием структуры ДНК и его стабилизирующее действие на AuNPs ^24-25. При выполнении этого теста визуально, анализ заготовки показал небольшое синий Colora ции с концентрациями солей , как это определено на рисунке 2 , со стрелками, которые близки к серединам как обсуждалось. Концентрации соли до тезисах точек дают мало или без видимых изменений цвета, и за его пределами этих точек цвет быстро растет. Для этой работы, начальная концентрация соли определяли визуально, а затем доработаны с помощью микропланшет-ридера измерения сравнения анализа чистых и кокаина образцов.

При подходе Free Аптамер пробирной, ложные положительные ответы были проблемой. Поверхностные взаимодействия молекул аналита являются одним источником этой проблемы, как это описано в предыдущей публикации ^7. Для предотвращения непреднамеренных цветовых ответов в связи с неспецифическими AuNP поверхностных взаимодействий, плотность покрытия ДНК связывания аптамеров мишени контролировалось (рисунок 3).

JPG "/>
Рисунок 3. адсорбированная аптамеров анализ с различной реакции плотности покрытия ДНК. Агрегирование ответ на кокаин (красный, мишень), ЕМЕ (зеленый, контроль), и прокаин (синий), A AuNP поверхностно - активные молекулы, по 90, 120, 150, и были показаны 180 плотности покрытия ДНК / AuNP. Все образцы анализировали растворяли в метаноле при концентрации 1 мг / мл. Столбики ошибок определяются стандартное отклонение трех измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В целом, процент ложных срабатываний реакция нецелевых молекул аналита за счет AuNP взаимодействий уменьшается с увеличением плотности охвата ДНК. Тем не менее, чувствительность теста была снижена в результате увеличения охвата ДНК. В этой работе, плотности ДНК 60, 90, 120, 150, 180 и 300 ДНК AuNP были Investiga /Тед. Плотности 60 и 300 были подробно описаны в предыдущей работе ^7. Рисунок 3 представляет дополнительные плотности ДНК изученные. Прокаин был одним из более высоко поверхностно-активным нецелевых аналитов опрошенных. Для каждого из отдельных покрытиях ДНК, реакция анализа максимизируется путем изменения концентрации соли, как описано. В целом по мере увеличения охвата ДНК, разница в ответ между контролем (EME) и ответ кокаина снижается. Аналогичным образом, ответ анализа в присутствии прокаина снижается до фоновых уровней с увеличением покрытиях. 180 ДНК / плотность AuNP устранен поверхности, связанные с ложной положительной реакции на новокаин, сохраняя при этом высокий целевой отклик. Эта оценка описывает способ настройки этих цветовых анализов для уменьшения связанных с поверхности ложноположительных ответов, сохраняя при этом целевой отклик в максимально возможной степени. Улучшение чувствительности может быть достигнуто за счет сокращения охвата ДНК. Тем не менее, ложные Позитивтивные реакции может стать проблемой, в зависимости от применения.

Колориметрические анализы обычно используются для быстрой, простой часто презумптивных качественных и количественных тестов даже. Общие проблемы с колориметрических определений являются субъективный характер цветового различения, в частности, с тонкими и пограничными цветовых различий. Суждение вызовы, которые должны быть сделаны аналитика может привести к неправильной интерпретации данных. Измерения лабораторного оборудования снижают неопределенность и нерешительность, связанные с оценкой результатов анализа. Однако в этой работе, намерение состояло в том, чтобы обеспечить поле готового анализа, который обеспечил непосредственные результаты аналитика. Таким образом , методика анализа фотоизображение было установлено , что обеспечило более решающий результат цвета (рисунок 4).

Рисунок 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

С увеличением концентрации кокаина, цвет анализ привел к увеличению синего цвета. Цифровые фотографии калибровочных кривых были получены с использованием двух различных смартфонов, и импортировать в стандартный портативный компьютер для анализа с помощью программного обеспечения ImageJ. Значения цветность были использованы для построения Calibration кривые , как показано на рисунке 4. Анализ изображения предусмотрен линейный отклик на увеличение концентрации кокаина с обоими наборами смартфонов изображений , как указано значениями R ^2. Этот метод был переведен в приложение смарт-устройств, чтобы помочь аналитику в области. Детальная оценка приложения была выполнена в предыдущей публикации ^7. Приложение устранена большая часть неопределенности и нерешительности, связанной с тонкими результатами изменения цвета самых низких концентраций кокаина.

Длительное хранение физически адсорбированных анализов ДНК этого типа не были изучены в мельчайших подробностях, и одной из целей этой работы было найти условия для расширения анализа срок годности. Лечение компонентов тест для хранения при 4 ° С была подробно описана в предыдущей публикации ^6. Для этой работы, лиофилизации из подготовленных компонентов анализа рассматривалась для долговременного использования и хранения Oе анализа. Лиофилизации компоненты анализа имеет явное преимущество хранения и хранения образцов при температуре окружающей среды, что позволит устранить необходимость в холодильнике или морозильной камере. Основной шаг в процессе лиофилизации должен сначала заморозить образец. Для того, чтобы проверить образцы AuNP пережить процесс замораживания, выполнить сравнение спектров поглощения анализа до замораживания к тому, что из размороженного образца. Сканирование должно точно совпадать. Если образцы не выдерживают процесса замораживания, талая спектр образца будет увеличиваться поглощение в области выше 525 нм. Это указывает на то, что AuNPs агрегированных в процессе замораживания и размораживали образец под угрозу. Жизнеспособность талой анализа был протестирован с кокаином и EME (рисунок 5).

Рисунок 5. адсорбированная ответ годности исследование Аптамер анализа. Quantificaция ответ тест на EME (зеленый, контроль), и кокаин (красный, мишень) выполнена с замороженной и затем оттаивают, адсорбированные образцы Аптамер пробирного в течение в течение четырех недель. Столбики ошибок определяются стандартное отклонение трех измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Талой анализа пустые образцы оставались при том же значении за период исследования в качестве образцов, которые не были получены и использованы непосредственно (без хранения). Ответы кокаина и EME образцов соответствовали типичных реакций, наблюдаемых с образцов, изготовленных и используемых непосредственно (без хранения). Замороженные образцы были проверены на период 4 -х недель без каких - либо изменений в производительности анализа по сравнению с образцами хранили при 4 ° С в течение того же периода времени ⁷ или образцы анализов , сделанных и использованных immediatelу. Кокаин ответы были относительно постоянными в течение 4 - недельного периода, который также наблюдался в течение 4 ° C ⁷ образцов. Уменьшение сигнала EME с 1-й недели до 2-й недели часто наблюдается при комнатной температуре и хранения 4 ° C, а также. Явление, мы приписаны к созреванию анализа в течение первой недели. Такой подход дополнен доступные для долгосрочного хранения адсорбированных ДНК колориметрического анализа вариантов, и при условии, шлюз к дополнительным вариантам долгосрочного хранения, а именно лиофилизации.

Discussion

За последнее десятилетие, на основе наночастиц колориметрические анализы были разработаны для обнаружения целей , включают небольшие молекулы, ДНК, белки и клетки ^2-4. Анализы, которые используют ДНК-аптамеров с наночастицами были все больший интерес. Как правило, эти колориметрические анализы выполняются путем смешивания ДНК-аптамер с молекул аналита с последующим добавлением к AuNPs ^9-10. Тем не менее, эти анализы были использованы в доказательство правильности концепции демонстраций с контролируемых лабораторных условиях и с ограниченными, выбранными элементами управления. Последние достижения перехода этой технологии в области были сделаны ^7. При таком подходе, ДНК-аптамеров адсорбируют на AuNP поверхности перед добавлением молекул аналита испытания (рисунок 1). Развитие либо аптамеров-наночастицы золота на основе колориметрического анализа требует оптимизации на различных этапах процесса изготовления / анализа. Таким образом, эти новые для дискаipline должны знать нюансы, связанные с переработкой и устранения этих анализов, чтобы быть успешным.

Адсорбированные наночастицами анализы аптамеры золота требуют тщательной оптимизации для каждого аптамеры / целевой пары. Тем не менее, следуя указаниям, приведенным здесь предлагает последовательный протокол к выполнению оптимизации этих колориметрических анализов. Определение и регулирование концентрации солей , что приводит к максимальной наблюдаемой или измеримое изменение цвета между мишенью и анализа заготовки является одним из наиболее важных этапов оптимизации ( На рисунках 2 и 3). Для некоторых аптамеры / целевых пар, мы обнаружили , что с использованием высоких концентраций солей вблизи конечной точки кривой титрования привели к сине-к-красного смещения цвета ^18. Это указывает на стабилизацию AuNPs по аптамер при добавлении мишени и соли.

Другие факторы, которые могут повлиять на этот анализ реrformance включают буферные компоненты и концентраций количество охвата ДНК-аптамеров, растворители, используемые, температура, последовательность аптамеров и структуру, время целевой анализ инкубации (время, когда мишень добавляется в анализе, до добавления соли), а также время разработки цвета ( время, необходимое для цвета, чтобы развиваться, после добавления соли). 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl ₂ , рН 7,4 буфер был буфер для анализа выбора во многих из пар мишень / аптамеров , используемых в нашей работе. Тем не менее, этот буфер не может быть идеальным для всех аптамеров. Для того, чтобы получить надлежащее сгибание аптамеров, компоненты буфера для анализа, возможно, должны быть адаптированы, и все как можно ближе к композиции, используемой в буфере выбора аптамеры. При использовании буфера с AuNPs, компоненты буфера и концентрации должны быть рассмотрены, в частности, с ионными веществами. Высокие концентрации ионных соединений может привести к преждевременному агрегацию AuNPs. Охват ДНК / AuNP было показано на рисунке 3. В качестве ДНК ,увеличение охвата от 90-180 ДНК / AuNP, реакция целевой аналит уменьшилась что приводит к снижению чувствительности анализа. Таким образом, компромисс необходим, что зависит от каждого аптамеров, из-за своей особой сворачивания и степени взаимодействия с поверхностью AuNP.

Кроме того, растворители, необходимые для растворения молекул аналита, может привести к непреднамеренной агрегацией AuNPs. Вода, буфер для анализа, и метанол все использовались без проблем. Используется без разбавления, ацетонитрил и диметилсульфоксид (ДМСО) адсорбируются на поверхности AuNP вызывая непреднамеренного агрегацию. Ацетонитрил проблематичным даже при разбавлении менее чем на 1% (конечный объем). Растворители должны быть испытаны с AuNPs перед использованием колориметрического анализа. Температура, при которой выполняется анализ может иметь влияние на ли наблюдается отклик на анализ. Это в большей степени связано со структурой аптамеров и температурой плавления, или стабильность структуры аптамеров при заданной температуре, чемс наночастицами. В нашей работе мы определили, что существует тонкий баланс между наличием аптамера в предварительно сформированной структуре с ДНК, в сложенном виде, а также не полностью в одноцепочечной структуре. Это тот случай , для адсорбционного аптамеров анализа формы этих колориметрических анализов (рисунок 1). При рассмотрении структуры, последовательность аптамеры также должны быть рассмотрены, так как большая часть структуры аптамеров является результатом отдельных олигонуклеотидных последовательностей. Однако дальнейшее расследование этого аспекта требуется.

В целом, подход мы используем при разработке основанного колориметрического анализа аптамеров-AuNP одинакова для всех аптамеров / целевых пар. Во-первых, получить аптамер для мишени, представляющей интерес. Это может быть достигнуто путем поиска литературы или выбор аптамера для представляющей интерес молекулы. На данном этапе, нет никакого способа узнать, является ли аптамеров является хорошим кандидатом для создания колориметрическимАнализ. Это можно определить только экспериментальным путем. Затем аптамеры инкубируют с AuNPs в течение ночи для изготовления адсорбированный анализа аптамеров (рисунок 1). Стандартный подход, чтобы начать тестирование с 60 аптамеров / AuNP; Тем не менее, несколько покрытий готовятся к следующему этапу тестирования. Когда анализы готовы для тестирования, выполнения кривой титрования исследования , как описано (рисунок 2). Средняя точка кривой титрования служит надежной исходной концентрации соли, которые будут использоваться для цели, анализа заготовки и контрольных испытаний. Концентрация соли доработаны, чтобы обеспечить максимальную разницу в цвета между целевыми и анализа чистых проб. Для того, чтобы проверить реакцию реально и вызвано аптамеров-связывания мишени, а не из-за неспецифических мишеней / взаимодействия растворителя, выполнить анализ с элементами управления. В то же время анализа время разработки цвета исследованы с интервалом 5 мин. Далее следуют целевой анализа времени инкубации при 5 мин интеrvals, первоначально 15+ раз мин инкубации используются до тех пор, этот шаг не будет оптимизирован. В зависимости от результатов, дальнейшей оптимизации концентрации соли, охвата аптамеров, времени инкубации и время проявления цвета может быть необходимо (рисунок 3). Этот подход описывает протокол для проектирования и разработки аптамеров-AuNP колориметрического анализа для пары цель / аптамеров. Дальнейшие исследования в последовательности аптамеров и структурных эффектов на улучшение адсорбированная аптамеров колориметрического анализа представляют большой интерес. Существует необходимость для понимания взаимодействия, связанные с аптамеров, цели и AuNPs. Это знание может привести к покрой аптамеры для лучшей функциональности и даже предсказания, которые аптамеры будут активны в формате адсорбированная аптамеров для анализа.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy	Bio-TEK	HT	Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized	Amresco	J848	Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate	Fisher	430767	Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98% any brand will work
DNA	IDT	Custom	DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml	VWR	10011-722	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol