Summary
インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー - 金ナノ粒子の比色アッセイの設計および開発を検討しました。さらに、スマートデバイス測色アプリケーション（アプリ）が検証された、アッセイの長期保存は、フィールドでの使用のために設立されました。
Abstract
インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー - 金ナノ粒子（AuNP）比色アッセイの設計および開発を検討しました。ターゲット選択AuNPベースのカラーアッセイが制御さ、概念実証実験室の設定で開発されてきました。しかし、これらの方式は、実験室の設定を超えて、その実用化を決定するために、障害発生時点に発揮されていません。この作品は、小分子検体とインフィールドの設定のためのアッセイを使用するためのアプタマー - AuNP比色アッセイを設計、開発、およびトラブルシューティングするための一般的なアプローチについて説明します。吸着されたアプタマーは、ナノ粒子表面を不動態化し、低減し、非標的分析物に偽陽性反応を排除するための手段を提供するので、アッセイが有利です。実用的な用途にこのシステムを移行することはアプタマー-AuNPアッセイの貯蔵寿命だけでなく、を定義するが、長期保存capabilを拡張するための方法および手順を確立する必要ities。また、比色読み取りと認識懸念事項の一つは、正確に色で頻繁に微妙な変化を識別するために、アナリストの負担です。フィールドのアナリスト上の責任を軽減するには、色分析プロトコルは、実験室グレードの機器でこのタスクを実行するための必要なく、色識別職務を行うために設計されました。データ分析プロトコルを作成し、テストするための方法が記載されています。しかし、理解し、吸着したアプタマーアッセイの設計に影響を与えるために、相互作用は、アプタマー、ターゲットに関連付けられている、とAuNPsは、さらなる研究が必要です。得られた知識は、機能向上のためのアプタマーを仕立てにつながる可能性があります。
Introduction
測色は、分析化学で使用される最も古い技術の一つです。この技術については、検体の定性的または定量的決意着色化合物1の製造に基づいて行われます。典型的には、色アッセイは、可視光スペクトルにおいて観察または検出可能な色の変化をもたらす検体種の存在下で色ずれが発生する試薬を使用します。測色は、デオキシリボ核酸（DNA）、ペプチド、およびタンパク質2-4のような複雑な生物学的分子の原子、イオン、および小分子の範囲の標的の検出に使用されてきました。過去20年間では、ナノ材料は、特にカラー基づくアッセイ5-6と、検出アッセイの分野に革命をもたらしてきました。このような抗体、オリゴヌクレオチドアプタマーまたはペプチドアプタマーとして、標的選択的認識要素とナノ材料の固有の化学的および物理的特性を組み合わせ、復活につながっている私比色検出アッセイ7の設計と開発をn個。
金属ナノ粒子は、多数の比色アッセイの設計に利用されている実証サイズ依存色変化特性を有します。金ナノ粒子（AuNPs）が原因で、粒子の分散液は、通常、塩の正確な添加して、8を集約するように誘導された特徴的な赤から青へのカラーシフトに特に重要です。凝集（青）の状態に分散（赤）からの移行を制御する能力は、イオン、小分子、ペプチド、タンパク質、および細胞標的2-4,9ための比色センサーの作成 につながっています。これらのセンサの多くは、標的認識モチーフとしてアプタマーを使用します。
アプタマーは、10 12 -10 15の異なる配列10-11のランダムプールから選択されたDNA又はリボ核酸（RNA）分子です。選択プロセスは、ターゲットの再を識別する認知低ナノモル領域における結合親和性を持つ要素、および指数関数的濃縮（SELEX） によって、リガンドの系統的進化は、最も一般的に知られているプロセス12-13です。アプリケーションを検出するためのオリゴヌクレオチドベースのアプタマーの利点は、合成の容易さ、制御可能な化学的修飾、および化学的安定性14-15が含まれます。
比色アッセイを作成するための1つのアプローチは、認識要素とナノ材料を組み合わせたAuNP表面へのDNAアプタマー分子の物理吸着を介してこれらの二つの種を組み合わせで構成されています。標的アプタマーの結合を介して、アプタマーは、塩の添加により誘導可能な赤から青への色応答19につながるAuNP表面とアプタマーとの相互作用を変化させる構造変化16-18を経験します 。 AuNPsのこの驚くべき特徴は、解除するのに使用することができるアプタマーベースのデバイスのための観察、比色応答機構を提供します異なる分析物のための比色アッセイに署名。
AuNP表面上の非共有結合、物理吸着DNAアプタマーを用いて設計されたカラーアッセイが原因で堅牢性、制御された実験室の設定の外の故障の傾向、および実用的に使用するための利用可能な情報の不足の問題に弱いセンサープラットフォームであることの汚名を持っています設定。しかし、アプタマーAuNP基づく比色アッセイがあるため、操作や観察可能な色反応を簡単に興味深かったです。この研究の目的は、代表的な検体としてコカインを使用したDNA-AuNP基づく比色アッセイの設計、開発、運用面の減少に関連する偽陽性反応、および長期保存のためのプロトコルを提供することです。さらに、我々は、これらのアプタマー-AuNPのお尻のための従来のアプローチよりも少ないステップで得られた使いやすさと使いやすさに有利で あるとして、この吸着されたアプタマーアッセイ法（ 図1）を提案しましたAYS。このアッセイでは、アプタマーは、最初に長期間の表面に吸着させたAuNPsに添加しました。このアプローチのさらなる利点は、AuNP表面相互作用に関連する非標的分析物分子に対する応答の減少でした。しかし、偽陽性反応の減少は、アッセイ感度を犠牲にしました。したがって、表面保護と検体アクセス性とのバランスが適切なアッセイの機能を維持するために必要です。また、経由色アッセイを分析する主要な欠陥が計測器を用いた場合よりも、他の意味色の微妙な違いを区別しようとしている場合は特に結果は、しばしば主観的でからアナリスト・ツー・アナリストの解釈に開いていることです。逆に、本 研究では電力等の利用可能性、携帯性と実用性、として、ラボ外で使用可能な実験室ベースのインスツルメンテーションを行うことで多くの問題があり、色解析プロトコルは、MORのために開発されました電子移植性と一般的に色ベースのアッセイの解釈20-21に関連した当て推量のいくつかを排除します。従来のアプローチと比較すると、この努力は、実験室の設定を超えたアプリケーションのための彼らの限界にこれらのアッセイをプッシュする努力しました。
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Protocol
クエン酸の金ナノ粒子（AuNP）の削減と特性を経由して1合成
- 5mlで三角フラスコ（500ml）および大型攪拌棒をきれいには、硝酸を濃縮し、15 mlの化学物質安全フード内濃塩酸しました。
- 酸洗浄とフラスコの表面全体を濡らし、ヌクレアーゼを含まない水でフラスコをすすぎ、そしてフラスコを乾燥させます。
- 1 mMの金（III）塩化物の100ミリリットルを追加します。酸の上面を覆うようにアルミホイルのシートを使用し、沸騰するまでホットプレート上で連続的に攪拌しながら三角フラスコと熱を掃除。
- 38.8 mMのクエン酸ナトリウムの10ミリリットルを追加します。色は黒/ダークブルーに、クリア/グレーから変更し、数分間にわたって最終的に暗赤色になります。 10分間の加熱をオフにして攪拌し続けます。
- AuNP懸濁液を室温まで冷却し、連続的に攪拌しながらジエチル（DEPC）の110μLを追加することができます。
- フラスコ全体をカバーでアルミ箔とはDEPC処理を一晩インキュベートすることができます。琥珀色の貯蔵容器に、暗所ですべてのAuNPsを保存またはアルミホイルで覆った。
- 室温まで冷却AuNP懸濁液を、オートクレーブし、孔径0.22μmのセルロースアセテート膜でろ過します。 4℃で暗所で濾過し、オートクレーブしAuNP原液を保管してください。
注：DEPCを用いた治療、4℃でオートクレーブを介して滅菌、およびストレージは、アプタマー-AuNPアッセイの貯蔵寿命を改善します。このように、ストレージは2ヶ月以上のための機能を維持するためのアッセイを可能にします。 - 濃度（c）を計算することによって8に Lモル-1 cm -1 でベールの法則とを520 nmで紫外可視吸収を得ることによってAuNP濃度を計算し、吸光係数（ここでε）を使用して2.4×10。濃度は、動的光散乱によって決定さ15nmの大きさの10 nMであると決定されました。
注：濃度はFRを変化しますオムバッチ間。希望の10 nMのAuNPサスペンションを維持するために必要なヌクレアーゼを含まない水でAuNPストックを希釈します。
2. DNAアプタマー、バッファ、ソリューション、およびアッセイの準備
- 標準的なホスホルアミダイト化学22を使用してアプタマー配列を結合後のコカインを購入するか合成します：
MN4 19：5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
MN6 19：5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 ' - 標準的な脱塩23を使用してアプタマーを精製します。 100μMまたは1 mMのストック溶液のいずれかでヌクレアーゼフリー水にオリゴヌクレオチドを再構成します。数ヶ月のために-20℃で小分けし、店舗。
- 購入または滅菌1Mの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pHが7.4、100mMの塩化マグネシウム（MgCl 2）、および1M塩化ナトリウム（NaCl）でのストックを調製します。
- ヌクレアーゼフリー水のwi内のバッファの50ミリリットルを準備ヶ月間室温で第20 mMのHEPES、2mMのMgCl 2を、pHが7.4の濃度とストア。
- 室温で3-4時間、在庫AuNP溶液（10 nM）を用いてDNAをインキュベートし、光から保護します。試験は、（2.5〜7.5 ml）を実行するために十分なサンプルを提供することが望まれるようAuNPsの容積を変化させます。
- ここで、この作品では90、120、150、および180 DNA分子/ AuNPのローディング密度を使用します。それに応じてDNAの量と濃度を変化させます。非標的分析物の意図しないAuNP表面に関連するカラー応答を減少させるためのチューニングDNAカバレッジ。
注：DNAカバレッジを増加させると、アッセイ感度を低下させます。ローディング密度がAuNPストックの濃度を知ること、そして実験に使用するための所望の量で存在AuNPsの総数を計算から計算されます。実際のカバレッジ密度が所望される場合、プロトコルは、これらの値7を得るために存在します。 DNA被覆率は50 kDaのMを用いて決定しました。遊離DNAからAuNP結合したDNAを分離するolecular量カットオフスピンカラム。 AuNPsは、遊離DNAを容易に通過する一方、スピンカラムを通過するには大きすぎます。次のステップは、吸光度測定、または一本鎖DNAの蛍光色素を使用して収集した遊離DNAを定量することです。
- ここで、この作品では90、120、150、および180 DNA分子/ AuNPのローディング密度を使用します。それに応じてDNAの量と濃度を変化させます。非標的分析物の意図しないAuNP表面に関連するカラー応答を減少させるためのチューニングDNAカバレッジ。
- 20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を、pH7.4の緩衝液の等量加え、暗所で一晩中4℃でサンプルを配置します。アプタマーAuNPアッセイは、10mMのHEPES、1mMのMgCl 2、pH7.4の（アッセイ緩衝液）でした。
3.塩滴定およびアッセイのセットアップ
- アッセイブランクとの塩滴定によるアッセイの色応答を誘導するために必要な初期の塩濃度を決定します。 96ウェルプレート中のアプタマーAuNPアッセイ180μlのアリコートにメタノール20μlの（空白）を追加します。 （ 図2のストックNaCl溶液（1 M又は2 M）の増加する容積を有するサンプルを滴定し、当量点を決定します注：このアッセイは、同じアプタマー-AuNPアッセイに空白メタノール（または溶解した分析物）の比率を維持することによってより小さなボリュームにスケーリングすることができます。
- ここでは、目視によるわずかな色の変化を引き起こすために必要なNaClの量を決定します。アッセイの開始濃度はそれぞれ60 DNA分子/ AuNPカバレッジ密度で、MN4およびMN6のために75ミリ、130 mmでした。
注：初期の塩濃度の定量決意については、滴定曲線の中点は良い出発点として機能します。また、使用した濃度は、日常的な性能、およびバッチ間からアプタマー、DNA被覆密度に基づいて変化します。
- ここでは、目視によるわずかな色の変化を引き起こすために必要なNaClの量を決定します。アッセイの開始濃度はそれぞれ60 DNA分子/ AuNPカバレッジ密度で、MN4およびMN6のために75ミリ、130 mmでした。
- アッセイ応答の最適化、室温で96ウェルプレート中のアプタマー-AuNPアッセイ180μlのアリコートにメタノールで希釈した検体分子の20μlを添加します。直前のステップで決定されたNaCl濃度がアッセイの色応答を開始するために追加します。
NOTE：同時に複数の実験を行うためにマルチチャンネルピペットを活用。 - 増加またはNaCl濃度を減少させ、ブランク応答に対する目標応答を比較することにより、可能な最大の色変化を得ます。最大の応答差を与えるNaCl濃度を使用してください。
- NaClを添加後、アッセイ応答150秒を観察または測定します。分光計を用いて650 nmおよび530 nmでの吸光度を分析したり、分析応答（写真解析プロトコルのセクション4を参照）のデジタルカメラの写真を入手。
注記：マイクロプレートリーダーは、この作業のために測定値を得るのに使用しました。 - 分析対象物濃度の関数として650 nmおよび530 nmの（E 650 / E 530）で得られた吸光度の割合として結果をプロットします。この仕事で行ったように、ブランク信号に対するアッセイ応答を正規化します。
4.写真やデジタル画像色解析プロトコル分析
- Prepar電子に記載のアッセイサンプル（セクション3.2から3.3）。トランスイルミネーター上で96ウェルプレートを置きます。
注：標準的な実験ネーターは、典型的には、この分析のために使用可能なデジタル画像を得ることが明るすぎます。これらのtransilluminatorsが原因光源の強度にデジタル画像に表示されるように等間隔「ダークライン」を引き起こします。発光ダイオード（LED）ベースライトボックスからネーターを作ると、不透明なプラスチックの部分はうまく動作します。 - 式1〜24に示すように、増分の平均化技術を用いて、NaClを添加後150秒で96ウェルプレートの写真を取得し、画像解析ソフトに画像をインポートし、そして平均、赤、緑、青（RGB）の値を計算します。
（1）
- 標準のRGB（sRGBの）色空間からRGB値は、以下の式24を用いて、色度図（CIExyY）色空間に変換します。
（2）
（3）
（4）
- 式2、式3で指定された行列を用いて線形RGB値に指数関数RGB値に変換するCIE色空間24のX、Y及びZ値を計算するために使用されます。
- 分析24のために選択された領域内のピクセルの平均色を表す式（4）を使用して、xおよびy色度値を算出します。
- すべてのウェルに分析を行い、検量線（ 図4）を生成する色度値をプロットします。同一ウェルの異なる領域の色を分析することによって、標準エラーを取得します。
長期保存のためのアプタマー-AuNPアッセイを凍結5.
- セクション2.4および2.5に記載されているようにアプタマー-AuNPアッセイ成分を準備。寒剤ソリューションを作るためにヌクレアーゼフリー水に1グラム/ mlのトレハロースと1グラム/ mlのスクロースを含む別々の溶液を作ります。
注：トレハロースとスクロースの高濃度の凍結のためのアッセイを調製する際の希釈率を減少させるために使用しました。使用前に完全に糖を溶解するために水の入ったビーカーにホットプレート上の糖液を加熱します。 - 19.2 mg / mlでトレハロース、1.5 mlマイクロチューブ中200μlの最終容量で60 MN4-DNA / AuNPアッセイで4.8 mg / mlでのショ糖を含む溶液を作ります。最終的な寒剤溶液濃度は、DNAカバレッジによって異なります。
注：凍結するサンプルは300μLを超えてはなりません。より大きなボリュームが正しくフリーズしない場合があります。 - Flashは-146℃の冷凍庫または液体窒素中でを使用してサンプルを凍結します。使用するまで凍結したサンプルを保管してください。フラッシュ凍結が完了すると、ストレージはC°-80℃または-20であることができます。
- この作業のために、オーバー-146℃の冷凍庫にサンプルを残しますその後、夜と長期保存のために-20℃の冷凍庫に移します。
注：フラッシュ凍結はアプタマー-AuNPsが凝集することがあります。吸光度プロファイルを監視し、凍結していないサンプルと比較することにより、凍結プロセスの整合性をテストします。凝集が観察された場合、この問題を補償するために、冷媒液の量を増加させます。 - 室温でサンプルを解凍し、実験のために必要なだけの十分なサンプルを使用。解凍したサンプルの吸光度スペクトルを取得し、凍結していない寒剤液処理したサンプルのベースラインスペクトルと比較します。 400から700nmに吸光度を測定します。
- 塩滴定（セクション3.1）を実行し、アッセイ（セクション3.2）をテストし、前述したように結果（セクション3.3および3.4）をプロットします。
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Representative Results
この作業の主な目的は、フィールドでの使用のためにAuNP比色アッセイをベースアプタマーの安定性と堅牢性を開発し、調査することでした。前の公報に強調されているように、アッセイを作成するための2つの明確な戦略が7調べました。アッセイは、無料のアプタマーアッセイおよび吸着アプタマーアッセイと名付けました。吸着アプタマーアッセイfieldable検出アッセイ（ 図1）の目的のために、より魅力的でした。
吸着アプタマーアッセイの 図1 略図アプタマーはAuNPsと混合し、一晩インキュベートしました。メタノールに溶解した検体分子は直ちにターゲットが追加されたときにAuNP凝集を誘導するために、塩化ナトリウム（NaCl）で、続いて、吸収アプタマーアッセイに添加しました。EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
これは、非標的検体に対する偽陽性率の減少、相対的なシンプルさ、および吸着アプタマーアッセイの使いやすさによるものでした。吸着アプタマーアッセイを準備するために、DNAアプタマーはAuNPsと混合し、アッセイ緩衝液中で一晩インキュベートしました。これは、このようなマスキング剤や切削などの非標的検体分子への偽陽性反応のためのアッセイの感受性を減少する、アプタマーは容易にAuNPの表面に吸着させました。しかし、MN4のコカインアプタマーの唯一の予備成形された構造は、このアッセイ設計におけるコカイン（ターゲット）の存在下で活性でした。アッセイは、NaClの適切な濃度の即時添加した検体溶液を添加することによって、採用されました。塩溶液は、観察とMEAを開始するために使用しました。アッセイのsurable色の変化。アッセイは、2-3分以内に実行されました。検体溶液を加えました。
これらの物理吸着DNAに基づく比色アッセイの実行における重要な作用は、塩の適切な濃度の添加により、誘導された色応答です。塩の添加はAuNPsを安定化し、次いで粒子間の静電相互作用を減少させるクエン酸層の負の電荷をマスキングすることによって、粒子の凝集をもたらすAuNP懸濁液を不安定化することが知られています。結果は、観測可能な赤から青への色の変化です。同様の効果は、DNA処理しAuNPsと観察されます。 DNA-アプタマーの場合には、アナリストは最小限に観察AuNPの不安定化（青色着色）を引き起こすのに必要な塩の濃度を決定します。ターゲットの追加により、DNAアプタマーによってAuNPsの安定化が著しくOBSE、その結果削減されますrvable、測定可能な目標線量応答色の変化。この色の変化は、塩の適切な所定量を添加して知覚することができます。
同様に重要な塩の適切な濃度を決定したプロセスです。これは、アッセイブランクのシリーズ（ 図2）への塩化ナトリウム溶液の増加する濃度を添加することにより滴定曲線を実行することによって達成されました。
図2 塩に誘発される滴定曲線。クエン酸安定化（赤）、MN4コカイン結合アプタマー（緑）、MN6コカイン結合アプタマー（紫色）で処理AuNPサンプルは、塩化ナトリウム（NaCl）で滴定しました。視覚的に得られた初期の塩濃度は、各曲線のための色の矢印を対応して示しました。エラーバーは、標準偏差内で定義されています測定を三重。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ここで、使用される初期の塩濃度は、目視検査によって決定し、アッセイブランクで観察わずかな青色の着色を引き起こし、塩濃度としました。しかし、より定量的なアプローチのために、研究のこの分野への新たな研究者は、出発塩濃度として滴定当量点の中点を使用することができます。この点を超える色反応は急速に増加し始めます。さらに、アッセイの実行に使用される塩の濃度は、アッセイブランクおよびコカインの応答との間の色差を最大にするように調整しました。これは、滴定によって決定された量の塩濃度を増加させ、減少させることによって達成されました。塩滴定手順は、毎日行いましたアッセイと日々の変動を占めています。アッセイに必要な塩濃度のバッチばらつきが20％以下であった。 図2は、（DNA-アプタマーが安定化された）三つの異なるAuNPサンプル、クエン酸安定化（DNAなし）、MN4（DNA-アプタマーが安定化）、およびMN6を持っています。 MN4及びMN6サンプルについてDNAカバレッジは60 DNA分子/ AuNPし、各滴定曲線は、表面処理によって提供される安定性のレベルに基づいて異なる滴定の当量点と中間点を有しています。クエン酸は少し安定性を提供し、MN4（二重構造のような二本鎖）は、より安定性を提供し、MN6（単一の構造のような一本鎖）はAuNPsに最も安定性を提供します。この研究で使用される初期の塩濃度は、約50ミリメートル、約90ミリメートル、及び視覚〜130ミリモルであると決定されました。傾向は、DNA構造の従来の理解とAuNPs 24-25への安定化効果と一致します。視覚的にこのテストを実行する場合、アッセイブランクはわずかに青coloraを示しました説明したように中間点に近い矢印で図2で識別される塩濃度、とる。前論文ポイントへの塩濃度は、ほとんど又は全く観察可能な色変化を提供し、これらの点を超えて、色が急激に上昇。この作業のために、初期の塩濃度は、視覚的に測定し、次いで、アッセイブランク及びコカインのサンプルのマイクロプレートリーダーの測定比較を使用して微調整します。
無料アプタマーアッセイアプローチでは、偽陽性反応が問題でした。以前の刊行物7に記載のように分析物分子の表面の相互作用は、この問題の一つのソースです。非特異的AuNP表面相互作用に意図しない色反応を防止するために、標的結合アプタマーのDNA被覆密度は（ 図3）を制御しました。
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様々なDNAの被覆密度図 3. 吸着アプタマーアッセイ応答。コカインに集約応答（赤、ターゲット）、EME（緑、制御）、およびプロカイン（青）、AuNP表面活性分子、90のための、120、150、 180 DNA / AuNPカバレッジ密度が表示されていました。分析すべてのサンプルを、1mg / mlのメタノールに溶解しました。エラーバーは、3回の測定の標準偏差で定義されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
一般に、AuNP相互作用に起因する非標的分析物分子の偽陽性反応率は、DNA被覆密度の増加とともに減少しました。しかしながら、アッセイ感度を増加DNAカバレッジの結果として減少しました。この作業では、60、90、120、150、180、および300 DNA / AuNPのDNA密度はinvestigaましたテッド。 60と300の濃度は、広範囲に前作7で説明した。 図3、追加のDNA濃度が検討さを表します。プロカインは、調査対象のより高度に界面活性非標的分析物の一つでした。個々のDNAカバレッジのそれぞれについて、アッセイ応答は、説明したように塩濃度を調整することによって最大化されました。 DNA被覆率が増加すると、一般的に、コントロール（EME）およびコカインの応答との間の応答の差が小さくなります。同様に、プロカインの存在下でアッセイ応答が増加カバレッジとバックグラウンドレベルまで減少します。高い目標応答を維持しながら180 DNA / AuNP密度は、プロカインために表面に関連する偽陽性反応を排除しました。この評価は、できるだけターゲット応答を維持しながら、表面に関連する偽陽性反応を低減するためのこれらの色アッセイを調整するための方法が記載されています。改善された感度はDNAカバレッジの減少を介して達成することができます。しかし、偽のポジ的な応答は、用途に応じて問題になる可能性があります。
比色アッセイは、一般的に、迅速、簡単なことが多い推定定性的および定量的であっても試験に使用されています。比色の決定に関する一般的な問題は、特に微妙な境界線の色の違いで、色の識別の主観的な性質です。アナリストによって行われなければならない判断の呼び出しは、データの誤った解釈につながることができます。実験装置での測定は、分析結果の評価に伴う不確実性および優柔不断を減らします。しかし、この作品では、その意図は、アナリストへの即時の成果を提供し、フィールド準備アッセイを提供することでした。このように、写真画像解析技術は、より決定的な色の結果（ 図4）が設けられ、その確立されました。
図4。
コカインの濃度を増加させ、アッセイの色は増加して青色になりました。検量線のデジタル写真は、二つの異なったスマートフォンを使用して得られ、そしてImageJソフトウェアを使用して、分析のための標準的なラップトップコンピュータにインポートしました。色度値は、cをプロットするために使用されましたR 2値によって示されるように、図4に示すようにalibration曲線。画像解析は、スマートフォンの画像の両方のセットを増加コカイン濃度に対する線形応答を提供しました。このメソッドは、フィールドでアナリストを支援するためにスマートデバイスアプリに移行しました。アプリの詳細な評価は、以前の出版物7で行いました。アプリは最低のコカイン濃度の微妙な色の変化の結果に伴う不確実性および優柔不断の多くを排除しました。
このタイプの物理吸着DNAアッセイの長期保存は、非常に詳細に研究されておらず、この研究の目的の一つは、アッセイの貯蔵寿命を延長する条件を見出すことでした。 4℃での貯蔵のためのアッセイ成分の処理は、前の公開6に詳述しました。この作業のために、準備されたアッセイ成分の凍結乾燥は、長期使用およびストレージOのために考慮されましたアッセイF。アッセイ成分を凍結乾燥すると、冷蔵庫や冷凍庫の必要性を排除するであろう、周囲温度でサンプルを維持し、保存の明確な利点を有します。凍結乾燥プロセスの主要なステップは、最初のサンプルを凍結することです。 AuNPサンプルが凍結プロセスを生き残る確認するには、解凍した試料のものに凍結する前に、アッセイの吸光度スペクトルの比較を行います。スキャンは正確に一致する必要があります。サンプルは凍結過程に耐えない場合は、解凍したサンプルのスペクトルは、525 nmを超える領域の吸光度が増加しているだろう。これはAuNPsは凍結中に凝集し、解凍したサンプルが危険にさらされていることを示します。解凍したアッセイの生存率は、コカインとEME（ 図5）を用いて試験しました。
図5. 吸着アプタマーアッセイ応答の貯蔵寿命の研究。Quantificaの化 EME（緑、対照）、及びコカイン（赤、ターゲット）に対するアッセイ応答は、凍結して行い、その後、4週間の間に吸着アプタマーアッセイサンプルを解凍しました。エラーバーは、3回の測定の標準偏差で定義されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
解凍したアッセイのブランクサンプルがすぐに行われ、使用されたサンプルとして研究期間（なしストレージ）上に同じ値のままでした。コカインとEMEサンプルの応答がすぐに行われ、使用されたサンプル（なしストレージ）で観察された典型的な反応と一致しました。アッセイサンプルが作られ、immediatelを使用したりする時間7の同じ期間に4℃で保存したサンプルと比較して、凍結したサンプルは、アッセイ性能に変化がない4週間の期間にわたってモニターしましたY。コカインの応答も4℃のサンプル7のために観察された4週間の期間中に比較的一定でした。週2週1からEME信号の減少は、多くの場合、同様に室温と4℃の保存で観察されています。現象は、我々は最初の週の間にアッセイの成熟化に起因します。このアプローチは、吸着DNA比色アッセイの長期保存のために利用可能なオプションを増強し、追加の長期保存オプション、すなわち凍結乾燥へのゲートウェイを提供しました。
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Discussion
過去10年間、ナノ粒子ベースの比色アッセイは、小分子、DNA、タンパク質、細胞2-4を含む標的の検出のために開発されています。ナノ粒子とDNA-アプタマーを使用するアッセイは、関心を集めています。典型的に、これらの比色アッセイはAuNPs 9-10に加え、続いて、分析物分子と、DNAアプタマーを混合することによって行われます。しかし、これらのアッセイは、制御された実験室の設定で、限られた、選択されたコントロールで概念実証のデモに利用されてきました。フィールドにこの技術を移行するための最近の進歩は7なされてきました。このアプローチでは、AuNPに吸着されたDNA、アプタマーは、検体分子を添加する前に（ 図1）試験される表面。どちらアプタマー金ナノ粒子ベースの比色アッセイの開発は、製造/分析プロセスの様々な段階での最適化を必要とします。ディスクにこのように、これらの新しいですiplineは精錬と成功するためにこれらのアッセイのトラブルシューティングに関連したニュアンスを認識する必要があります。
吸着されたアプタマー金ナノ粒子アッセイは、各アプタマー/ターゲット・ペアのための慎重な最適化が必要。しかし、手順を実行すると、これらの比色アッセイの最適化を実行することに一貫性のあるプロトコルを提供していますここで説明します。ターゲットおよびアッセイブランクの間の最大観察可能または測定可能な色の変化をもたらす塩濃度の決意と調整がより重要なの最適化ステップ（ 図2および3）の一つです。いくつかのアプタマー/標的対のために、我々は、滴定曲線の終点の近傍に高い塩濃度を使用すると、青色〜赤色カラーシフト18をもたらしたことを観察しました。これは、ターゲットと塩を添加してアプタマーによってAuNPsの安定化を示しています。
アッセイPEに影響を与える可能性のあるその他の要因緩衝成分および濃度、DNAアプタマーカバレッジ、使用される溶媒、温度、アプタマーの配列および構造の量は、対象アッセイインキュベーション時間（ターゲットは前の塩添加と、アッセイに添加されたとき）、カラー現像時間（rformance含みます塩の添加後に開発する色に必要な時間）。 10mMのHEPES、1mMのMgCl 2 pH7.4の緩衝液は、私たちの仕事で使用されるターゲット/アプタマーペアの多くで、選択したアッセイ緩衝液でした。しかし、このバッファは、すべてのアプタマーのために理想的ではないかもしれません。アプタマーの適切な折り畳みを得るために、アッセイ緩衝液成分を調整する必要があり、アプタマーの選択緩衝液中で使用される組成物のできるだけ近くに維持することができます。 AuNPsでバッファを利用する場合、緩衝液成分と濃度は、特にイオン性物質で、考慮しなければなりません。イオン性化合物の濃度が高いAuNPsの早期凝集を引き起こす可能性があります。 DNA / AuNPカバレッジは、図3に示された。DNAとして90-180 DNA / AuNPからカバレッジ増加は、標的分析物の応答が減少アッセイ感度を引き起こす減少しました。そのため、トレードオフは、その特定のフォールディングおよびAuNP表面との相互作用の程度に、各アプタマーに依存することが必要です。
また、検体分子を溶解するために必要な溶媒はAuNPsの意図しない凝集をもたらすことができます。水、アッセイ緩衝液、及びメタノールが全て問題なく使用されてきました。希釈、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなしで使用（DMSO）は、意図しない凝集を引き起こすAuNP表面に吸着します。アセトニトリルはあっても1％未満（最終体積）の希釈で問題がありました。溶媒は、比色アッセイで使用する前にAuNPsでテストする必要があります。アッセイが行われる温度は、反応は、アッセイで観察されているかどうかに影響を与えることができます。これはより、所定の温度でのアプタマー構造と融解温度、またはアプタマー構造の安定性に関係する複数を有しますナノ粒子と。私たちの研究では、折り畳まれた形態のDNAと予め形成された構造で、アプタマーを有するともない、完全に一本鎖構造内の微妙なバランスがあると判断しています。これは、これらの比色アッセイの吸着アプタマーアッセイ形態（ 図1）の場合です。構造を考慮すると、アプタマーの構造の多くは、個々のオリゴヌクレオチド配列の結果であるので、アプタマーの配列も企図されなければなりません。しかし、この側面へのさらなる調査が必要とされています。
一般的に、我々はアプタマー-AuNP基づく比色アッセイの開発に使用するアプローチは、すべてのアプタマー/標的対についても同様です。まず、目的の標的に対するアプタマーを得ます。これは、文献又は目的の分子に対するアプタマーの選択を検索によって達成することができます。この段階では、アプタマーは、比色を作成するための良い候補であるかどうかを知る方法はありませんアッセイ。これは、実験によって決定することができます。次に、アプタマーは、アプタマー吸着アッセイ（ 図1）を製造するために一晩AuNPsとインキュベートします。標準的なアプローチは、60アプタマー/ AuNPでテストを開始することです。しかしながら、複数のカバレッジは、試験の次の段階のために準備されます。アッセイは、試験のための準備ができたら説明したように、（ 図2）滴定曲線の調査を行います。滴定曲線の中点は、信頼性の出発ターゲットに使用する塩濃度、アッセイブランク、及び対照試験として働きます。塩濃度は、標的およびアッセイのブランクサンプル間の最大色差を提供するために微調整されます。応答が本物と結合アプタマー - ターゲットによって引き起こされると非特定のターゲット/溶媒の相互作用によるものではないテストするには、コントロールとのアッセイを行います。同時に、アッセイ発色時間は、5分間隔で調べました。 5分INTEでターゲットアッセイインキュベーション時間が続きますこのステップが最適化されるまでrvals、最初は15+分のインキュベーション時間が使用されています。結果に応じて、塩濃度、アプタマー被覆、インキュベーション時間と発色時のさらなる最適化が必要（ 図3）であってもよいです。このアプローチは、ターゲット/アプタマーのペアのためのアプタマー-AuNP比色アッセイの設計および開発のためのプロトコルについて説明します。吸着されたアプタマー比色アッセイの改善にアプタマー配列および構造的効果へのさらなる調査は非常に興味深いです。アプタマーは、標的、およびAuNPsに関連付けられた相互作用を理解する必要があります。この知識は、より良い機能のためのアプタマーを調整、さらには吸着アプタマーアッセイフォーマットで有効にするアプタマーの予測につながる可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
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