Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

in-the-alanın uygulamaları için küçük moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık kolorimetrik testinin tasarım ve geliştirme incelenmiştir. Buna ek olarak, akıllı aygıt kolorimetrik bir uygulama (uygulama) doğrulandı ve analiz uzun süreli depolama alanında kullanım için kurulmuştur.

Abstract

in-the-alanın uygulamaları için küçük moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanopartikülüne (AuNP) kolorimetrik tahlil tasarım ve geliştirme incelenmiştir. Hedef seçici AuNP bazlı renk deneyleri kontrollü proof-of-concept laboratuvar ortamlarında geliştirilmiştir. Ancak, bu planlar laboratuvar ortamlarında ötesinde pratik kullanımını belirlemek için başarısızlık bir noktaya uyguladığı edilmemiştir. Bu çalışma küçük molekül analit ve in-the-alanın ayarları için deney kullanılarak bir aptamer-AuNP kolorimetrik tahlil tasarlamak, geliştirmek ve sorunları gidermek için genel bir yaklaşım açıklanmaktadır. Adsorbe aptamerler nanoparçacık yüzeyleri pasifleştirilmesi ve azaltmak ve hedef olmayan analitlerle yalancı pozitif ortadan kaldırmak için bir yol sağlar, çünkü deney avantajlıdır. pratik kullanımları için bu sistem aptamer-AuNP testinin sadece raf ömrünü tanımlayan gerekli geçiş, ancak uzun süreli depolama Capabil uzatmak için yöntem ve prosedürlerin oluşturulmasıities. Ayrıca, kolorimetrik okuma ile tanınan kaygılardan biri doğru renk genellikle ince değişiklikleri belirlemek için analistler yerleştirilen yüktür. alanda analistlerin sorumluluk azaltmak için, bir renk analizi protokolü laboratuar sınıfı ekipman bu görevi gerçekleştirmek için gerek kalmadan renk tanımlama görevlerini yerine getirmek üzere tasarlanmıştır. Veri analizi protokolü ve test edilmek üzere bir yöntem tarif edilmektedir. Ancak anlamak ve adsorbe aptamer deneyleri tasarımını etkilemek için, etkileşimler aptamer hedef ile ilişkili ve AuNPs daha fazla çalışmaya ihtiyaç. Elde edilen bilgi işlevsellik sağlamak için aptamers terzilik yol açabilir.

Introduction

Renkölçüm analitik kimyada kullanılan en eski tekniklerden biridir. Bu teknik için, analitin niteliksel ve niceliksel belirlenmesi renkli bir bileşik 1 'in üretimi göre imal edilmektedir. Tipik haliyle, renk deneyleri, görülebilir ışık spektrumunun gözlenebilir bir ya da saptanabilir bir renk değişimi ile sonuçlanan, analit türlerinin varlığında, bir renk değişimine deneyim reaktif maddeleri. Kolorimetre örneğin deoksiribonükleik asitler (DNA), peptidler ve proteinler 2-4 gibi kompleks biyolojik moleküllere Atomlar, iyonlar, moleküller ve küçük arasında değişen hedeflerin tespiti kullanılmıştır. Son iki yıldır, nanomateryaller özellikle renk tabanlı deneyleri 5-6 ile, algılama deneyleri alanında devrim var. bu antikorların, oligonükleotid aptamers veya peptid aptamers gibi bir hedef seçici tanıma elemanı ile nanomateryallerin benzersiz kimyasal ve fiziksel özelliklerini birleştiren, diriliş yol açmıştır iTasarım ve kolorimetrik tespit deneyleri 7 gelişimi n.

Metal nanopartiküller sayısız kolorimetrik testlerin tasarımında istismar edilmiş bir gösterdi boyut bağımlı renk değişimi özelliği var. Altın nano parçacıklar (AuNPs) nedeniyle parçacıkların dağılmış çözeltisi, tipik olarak tuz hassas eklenmesiyle, 8 toplamak için uyarılan bir Kırmızı-to-mavi renk kayması, özellikle ilgi konusudur. Birleştirilmiş (mavi) Devletlere dağılmış (kırmızı) geçişi kontrol etme yeteneği, iyonik, düşük moleküler, peptid, protein için kolorimetrik sensörler ve hücresel hedeflerle, 2-4,9 yaratılmasına yol açmıştır. Bu sensörlerin çoğu hedef tanıma motifi olarak aptamers kullanır.

Aptamerler 10 12 -10, 15 farklı dizileri 10-11 rastgele olarak seçilen DNA veya ribonükleik asit (RNA) moleküllerdir. Seçim süreci hedef yeniden tanımlarbiliş düşük nanomolar rejiminde bağlanma afiniteleri ile elementler ve üstel zenginleşme (SELEX) ile ligandların Sistematik Gelişimi en çok bilinen işlem 12-13. Algılama için oligonükleotid bazlı aptamers avantajları sentez kolaylığı, kontrol kimyasal modifikasyonunu ve kimyasal stabilitesini 14-15 içerir.

kolorimetrik tahlil oluşturmak için bir yaklaşım, tanıma elemanları ile nanomalzemeleri birleştiren AuNP yüzeylere DNA aptamer moleküllerinin fiziksel adsorpsiyon yoluyla bu iki tür birleştirme oluşur. Hedef aptamerin bağlanarak, aptamer tuzu eklenmesi ile bir uyarılabilir kırmızıdan mavi renk tepki 19 neden AuNP yüzeyi ile aptamer etkileşimini değiştiren bir yapısal değişim 16-18 karşılaşır. AuNPs bu şaşırtıcı özelliği de kullanılabilir aptamer tabanlı cihazlar için gözlemlenebilir kolorimetrik tepki mekanizması sağlarFarklı analitler için kolorimetrik tahlilleri imzalamak.

AuNP yüzeylerde kovalent olmayan, fiziksel olarak adsorbe DNA aptamers kullanılarak tasarlanmış renk deneyleri nedeniyle sağlamlığı, kontrollü laboratuvar ortamlarında dışında başarısızlık için bir eğilimi ve pratik kullanıma hazır bilgi eksikliği ile ilgili sorunlar için zayıf sensör platformu olma stigma var ayarlar. Ancak, aptamer-AuNP tabanlı kolorimetrik tahlil nedeniyle çalışma ve gözlemlenebilir renk yanıtı basitlik ilgi oldu. Bu çalışmanın amacı, temsilcisi analit olarak kokain kullanan DNA AuNP bazlı kolorimetrik testlerin tasarımı, geliştirilmesi, işletilmesi, yüzeyin azalması ile ilgili yanlış pozitif yanıt ve uzun süreli depolama için bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, nedeniyle bu aptamer-AuNP eşek için geleneksel yaklaşıma göre daha az adımda sonuçlandı kullanım kolaylığı ve kullanım kolaylığı avantajlı olarak bu adsorbe aptamer tahlil yaklaşımı (Şekil 1) önerdiays. Bu tahlil için, aptamer ilk kez bir süre için yüzeye adsorbe bırakıldı AuNPs ilave edildi. Bu yaklaşıma ilave bir avantajı AuNP yüzey etkileşimleri ile ilişkili olmayan bir hedef analit molekülleri yanıtın bir azalma oldu. Ancak, yanlış pozitif yanıt azalma tahlil duyarlılık pahasına oldu. Bu nedenle yüzey koruma ve analit erişilebilirlik arasında bir denge Uygun test fonksiyonunu korumak için gereklidir. Dahası, içinden renk deneyleri analiz önemli bir kusur renkte ince farklılıkları ayırt etmek için çalışırken, özellikle enstrümantasyon, sonuçlar genellikle sübjektif ve analist-to-analisti yoruma açıktır olmasıdır ile başka anlamına gelir. Tersine, bu işin vb güç durumu, taşınabilirlik ile pratiklik gibi, laboratuar dışında kullanılabilir laboratuar tabanlı enstrümantasyon yapma konularında bir dizi vardır, bir renk analizi protokolü mor için geliştirilene taşınabilirlik ve yaygın renk bazlı analiz yorumlanması 20-21 ile ilişkili bazı tahminler ortadan kaldırmak için. Bir önceki yöntemlere göre, bu çaba laboratuvar ortamlarında ötesinde uygulamalar için kendi sınırları bu testlerin itmek için gayret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sitrat Altın Nanopartiküller Azaltılması (AuNP) ve Karakterizasyonu üzerinden 1. Sentezi

  1. 5 ml bir Erlenmeyer şişesi (500 mi) ve büyük karıştırma çubuğu temizleme, nitrik asit, konsantre edildi ve 15 mi kimyasal güvenlik başlığı içinde hidroklorik asit konsantre edildi.
    1. asit yıkama ile balonun tüm yüzeyini ıslak nükleaz içermeyen su ile şişesi durulayın ve şişeyi kurumasını bekleyin.
  2. 1 mm altın (III) klorid, 100 ml ilave edilir; kaynayana kadar bir sıcak plaka üzerinde sürekli karıştırılarak asit temizlenmiş bir Erlenmeyer şişesine ve ısı üst kapağı alüminyum folyo tabakası kullanımı.
  3. 38.8 mM sodyum sitrat, 10 ml ekleyin. Renk birkaç dakika boyunca koyu mavi / siyah ve nihayet koyu kırmızı, açık / gri değişecektir. 10 dakika süre ile ısı ile kapalı karıştırmaya devam edin.
  4. AuNP süspansiyon oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve sürekli karıştırılarak dietilpirokarbonat (DEPC) 110 ul ilave izin verin.
  5. ile tüm şişeyi Kapakalüminyum folyo ve DEPC tedavi gece inkübe izin verin. sarı saklama kapları karanlıkta her AuNPs saklayın veya alüminyum folyo ile kaplanmıştır.
  6. Oda sıcaklığına soğutun AuNP süspansiyon, otoklav, ve 0.22 mikron gözenek selüloz asetat zardan geçirerek filtre et. 4 ° C'de karanlıkta, süzüldü otoklava AuNP stok solüsyonu saklayın.
    Not: DEPC ile muamele, 4 ° C'de otoklav ile sterilize ve depolama aptamer-AuNP tahlilinde raf ömrünü geliştirecektir. Bu şekilde depolama 2 aydan fazla işlevsel kalmasını tahlil için izin verir.
  7. 520 nm Ultra Violet-Görünür emilimini alarak AuNP konsantrasyonunu hesaplamak ve konsantrasyonu (c) hesaplanarak sönüm katsayısı (ɛ) 2.4 x 10 8 L mol -1 cm -1 Beer Kanunu ile kullanın. konsantrasyonu, dinamik ışık saçılımı ile belirlenir 15 nm büyüklüğü 10 nM olduğu tespit edilmiştir.
    Not: Konsantrasyonlar fr değişirom parti-parti. istenen 10 nM AuNP süspansiyon korumak için gerekli olarak nükleaz içermeyen su ile AuNP stokları seyreltiniz.

2. DNA aptamer, Tampon, Çözüm ve Tahlili Hazırlık

  1. Satın almak veya standart fosforamidit kimyası 22 kullanılarak aptamer bağlama dizileri aşağıdaki kokain sentez:
    MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
    MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
  2. Standart tuzsuzlaştırma 23 kullanarak aptamers arındırın. 100 um veya 1 mM stok çözeltiler, ya da nükleaz içermeyen su içinde oligonükleotidleri sulandırın. Birkaç ay boyunca -20 ° C'de kısım ve mağaza.
  3. Satın alma veya steril 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 stok hazırlama, 100 mM magnezyum klorür (MgCI2) ve 1 M sodyum klorür (NaCI).
  4. nükleaz içermeyen su wi tampon 50 ml hazırlamakay boyunca oda sıcaklığında inci 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.4 konsantrasyonu saklayın.
  5. Oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca hazır AuNP çözeltisi (10 nM) ile DNA inkübe ve ışıktan koruyunuz. testleri (2,5-7,5 ml) yapılması için yeterli bir örnek sağlamak için arzu edildiği gibi AuNPs hacmini değişir.
    1. Burada, bu çalışmada 90, 120, 150 ve 180 DNA molekülü / AuNP yükleme yoğunluğu kullanın. hacmini ve buna bağlı olarak, DNA konsantrasyonları, değişebilir. Dinle hedef olmayan analitlerin istenmeyen AuNP yüzeyi ile ilgili renk yanıtları azaltmak için DNA kapsama.
      NOT: DNA kapsama artırılması tahlil duyarlılığını azaltacaktır. Yükleme yoğunlukları AuNP stok konsantrasyonu bilmek ve deneylerde kullanılmak üzere arzu edilen hacimde AuNPs toplam sayı hesaplanır. Kaplama yoğunluğu isteniyorsa, protokoller bu değerleri 7 elde etmek için mevcuttur. DNA kapsama 50 kDa m kullanılarak tespit edildiolecular ağırlıklı akış kesici spin kolon serbest DNA AuNP bağlanmış DNA ayrılması için. serbest DNA, kolayca geçecek ise AuNPs, spin sütunu içinden geçmek için çok büyüktür. Bir sonraki adım, absorbans ölçümleri ya da bir tek şeritli DNA floresan boya kullanılarak toplanmıştır serbest DNA ölçümüdür.
  6. 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.4 tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve gece boyunca karanlıkta 4 ° C de numuneyi. Aptamer AuNP deneyi, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.4 (tahlil tamponu) olmuştur.

3. Tuz titrasyonu ve Deney Kur

  1. Körün ile tuz titrasyonu ile tahlil renk tepkisini uyarmak için gerekli olan ilk tuz konsantrasyonunu belirlemek. 96 oyuklu bir plaka içerisinde aptamer-AuNP tahlilinde 180 ul alikotları metanol (boşluk) 20 ul ekle. Eşdeğerlik noktasına stok NaCl çözeltisi (1 M veya 2 M) hacimleri artan örnekleri titre ve belirlemek (Şekil 2 NOT: Tahlil aynı aptamer-AuNP tahlil için boş metanol (ya da çözünmüş analitin) oranını tutarak küçük birimlere ölçeklendirilebilir.
    1. Burada, görsel gözlem ile küçük bir renk değişikliğine neden olmak için gerekli olan NaCI hacim belirler. Deney için başlangıç ​​yoğunluğu 60 DNA molekülü / AuNP kapsamı yoğunlukta sırasıyla mM MN4 130 mM MN6 75 idi.
      Not: ilk bir tuzu konsantrasyonu için kantitatif belirlenmesi için, titrasyon eğrisinin orta noktası iyi bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet eder. Ayrıca, kullanılan konsantrasyonlar gün-gün performansı ve toplu-to-partiden aptamer DNA kapsama yoğunlukları, göre değişir.
  2. Deney yanıtı en iyi duruma getirme, oda sıcaklığında 96 oyuklu bir plaka içerisinde aptamer-AuNP tahlilinde 180 ul hacimde metanol içerisinde seyreltilmiş analit moleküllerinin 20 ul ekle. Hemen tahlil renk tepkisini başlatmak için önceki adımda belirlenen NaCI konsantrasyonunu ekleyin.
    YOK HAYIRTE: Aynı anda birden fazla deneyler gerçekleştirmek için bir çok kanallı pipet yararlanın.
  3. artan ya da NaCI konsantrasyonunu azaltmak ve boş yanıt hedef yanıtı karşılaştırarak olası büyük renk değişimi edinin. en büyük tepki farkını sağlayan NaCl konsantrasyonu kullanın.
  4. Dikkat ya da NaCI ilave edildikten sonra, deney yanıtı 150 saniye ölçer. Bir spektrometresi kullanılarak 650 nm ve 530 nm'de absorbansı analiz veya tahlil yanıt (fotoğraf analiz protokolü için Bölüm 4'e bakınız) bir dijital fotoğraf makinesi fotoğraf edinin.
    NOT: mikro-plaka okuyucu, bu iş için ölçümler elde etmek için kullanılmıştır.
  5. Analit konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak 650 nm ve 530 nm (E 650 / E 530) olarak elde edilen absorbans oranı olarak sonuçlar çizilir. Bu çalışmada yapıldığı gibi boş sinyale tahlil yanıtını normalleştirmek.

4. Fotoğraf ve Dijital Görüntü Renk Analizi Protokol Analizi

  1. prepartarif edildiği gibi (bölümler 3.2-3.3) ve deney örnekleri e. Bir transilluminator'de 96-plaka koyun.
    NOT: Standart laboratuar transillüminator genellikle bu analiz için kullanılabilir dijital görüntüler elde etmek için çok parlak. Bu transilluminators düzenli nedeniyle ışık kaynağının yoğunluğu dijital görüntü görünmesini "koyu çizgiler" aralıklı neden olur. Bir ışık yayan diyot (LED) tabanlı ışık kutusundan bir transilluminator yapma ve opak plastik bir parça iyi çalışıyor.
  2. Denklem 1 24 'de gösterildiği gibi, bir artımlı ortalama tekniği kullanılarak, NaCI ilave edildikten sonra 150 saniye 96 oyuklu plakanın resimler elde görüntü analizi yazılımı görüntüleri almak ve ortalama kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) değerlerini hesaplamak:
    (1) denklem 1
  3. Aşağıdaki denklemler 24 kullanılarak, standart RGB (sRGB) renk alanından kromatikliğini diyagramı (CIExyY) renk uzayına RGB değerlerini dönüştürmek:
    (2) denklem 2
    (3) denklem 3
    (4) denklem 4
  4. Denklem 2. Denklem 3'te belirtilen matris kullanılarak doğrusal RGB değerlerine üstel RGB değerleri dönüştürmek CIE renk alanı 24 X, Y ve Z değerlerini hesaplamak için kullanılır.
  5. Analiz 24 için seçilen alandaki piksellerin ortalama rengi temsil denklem 4 kullanılarak x ve y kromatiklik değerlerini hesaplayın.
  6. Iyi her analizi gerçekleştirmek ve bir kalibrasyon eğrisi (Şekil 4) üretmek için kromatikliğini değerlerini çizmek. Aynı kuyu farklı alanlarda rengini analiz ederek standart hata edinin.

Uzun vadeli depolama için Aptamer-AuNP Testi Donma 5.

  1. bölümler 2.4 ve 2.5 de tarif edildiği gibi aptamer-AuNP tahlil bileşenlerinin hazırlanması. Kriyojen Çözüm oluşturmak için nükleaz içermeyen su içinde 1 ug / ml, trehaloz ve 1 ug / ml sukroz içeren ayrı bir çözüm sağlayın.
    Not: trehaloz ve sakaroz yüksek konsantrasyonlarda dondurma tahlil hazırlarken dilüsyon faktörü azaltmak için kullanılmıştır. Kullanmadan önce iyice şekerler eritmek için su bir beher içinde sıcak bir plaka üzerinde şeker solüsyonları ısıtın.
  2. 19.2 mg / ml, trehaloz ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 200 ul nihai hacimde 60 MN4-DNA / AuNP testi ile 4.8 mg / ml sükroz içeren bir solüsyonun hazırlanması. Nihai soğutucu çözelti konsantrasyonları, DNA kapsama değişecektir.
    Not: Örnekler 300 ul geçmemelidir dondurulacak. Büyük hacimli düzgün donma olabilir.
  3. Flash -146 ° C dondurucu veya sıvı azot kullanarak örnekleri dondurma. kullanılıncaya kadar donmuş numune saklayın. Depolama -80 ° C olabilir veya -20 ° dondurma tamamlandıktan flaş bir kez C.
  4. Bu iş için, üzerinde -146 ° C derin dondurucuda örnekleri bırakıngece ve daha sonra uzun süreli depolama için -20 ° C derin dondurucuda transfer.
    NOT: Flaş dondurma aptamer-AuNPs agrega neden olabilir. absorbans profili izlenmesi ve bir donmamış numune karşılaştırarak donma sürecinin bütünlüğünü test edin. toplama görülürse, bu konuda telafi etmek için soğutucu çözeltisinin miktarını artırmak.
  5. Oda sıcaklığında örnekleri çözülme ve deney için sadece yeterli numuneleri gerekli kullanın. çözülmüş örneklerin absorbans spektrumları elde ve bir donmamış soğutucu çözümü işlenmiş numunenin başlangıç ​​spektrumları karşılaştırın. 400 nm ila 700 nm absorbansı ölçülür.
  6. tahlili (bölüm 3.2) test tuz titrasyonu (bölüm 3.1) gerçekleştirmek ve daha önce açıklandığı gibi sonuçları (bölümler 3.3 ve 3.4) arsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmanın temel amacı geliştirmek ve bu alanda kullanılmak üzere AuNP kolorimetrik testlerin dayalı istikrar ve aptamer sağlamlığını araştırmaktır. Bir önceki yayında vurgulandığı gibi, tahlil oluşturmak için iki farklı stratejiler 7 incelendi. deneyler Aptamer Testi ve emilen Aptamer Assay olarak adlandırılır. Adsorbe Aptamer Deneyi Bir ​​fieldable saptama sistemi (Şekil 1) açısından daha cazip.

Şekil 1
. Adsorbe Aptamer Assay Şekil 1. şematik temsili aptamer AuNPs ile karıştırılır ve bir gece boyunca inkübe edildi; metanol içinde çözüldü analit moleküllerinin hemen hedef eklendiğinde AuNP agregasyonu başlatmak için sodyum klorid (NaCl) eklenmiş, ardından emilir Aptamer tahlile eklenir.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu durum, hedef olmayan analitler, bağıl basitlik ve emilen Aptamer Deney kullanım kolaylığı için yanlış pozitif oranlar azalma oldu. Adsorbe Aptamer Testi hazırlanması için, DNA aptamer AuNPs ile karıştırılır ve deney tamponu içinde gece boyunca inkübe edildi. Bu aptamer kolaylıkla böyle maskeleme veya maddeleri kesme gibi nontarget analit molekülleri yanlış pozitif tepkiler için testin duyarlılığı azalır AuNP yüzeyinde adsorbe izin verdi. Bununla birlikte, MN4 kokain aptamer yalnızca önceden oluşturulmuş bir yapı, bu deney tasarımı kokain (hedef) varlığında etkindi. Tahlil NaCl uygun konsantrasyonda hemen akabinde analit çözümleri ekleyerek tarafından istihdam edildi. Tuz çözeltileri gözlemlenebilir ve mea başlatmak için kullanıldıDeneyin surable renk değişimi. Tahlil 2-3 dakika içinde idam edildi. analit çözeltisinin ilave edilmesinden sonra.

Bu fiziksel adsorbe DNA bazlı kolorimetrik testleri yürütülmesinde kritik eylem tuz uygun konsantrasyonda eklenmesi suretiyle oluşturulan renk yanıttır. tuzların eklenmesi AuNPs stabilize ve parçacıklar arası elektrostatik etkileşimleri azaltır sitrat tabakasının negatif yük maskeleyerek parçacıkların toplanmasının sonucu AuNP süspansiyonlar destabilize bilinmektedir. Sonuç gözlemlenebilir kırmızı-to-mavi renk değişikliğidir. Aynı etki, DNA tedavi AuNPs ile görülmektedir. DNA aptamers durumunda, analisti az gözlemlenebilir AuNP destabilizasyonuna (mavi bir renk) neden olmak için gerekli olan bir tuzu konsantrasyonunu belirlemek. hedef eklenmesi ile, DNA aptamer tarafından AuNPs stabilizasyonu önemli ölçüde Obse elde azalırrvable, ölçülebilir bir hedef doz tepki renk değişimi. Bu renk değişimi, sadece tuz, uygun, önceden belirlenmiş bir miktarda eklenmesi ile algılanabilir.

Aynı şekilde önemli bir tuzunun uygun bir konsantrasyonu tespit edildiği bir süreçtir. Bu deney, boşlukları, bir dizi (Şekil 2) bir sodyum klorür çözeltisi, artan konsantrasyonlarda eklenmesi ile bir titrasyon eğrisini performans ile gerçekleştirildi.

şekil 2
Şekil 2. Tuz kaynaklı titrasyon eğrisi. Sitrat stabilize (kırmızı), MN4 kokain bağlama aptamer (yeşil) ve MN6 kokain bağlama aptamer (mor) ile muamele AuNP örnekleri sodyum klorid (NaCl) ile titre edilmiştir. görsel elde edilen ilk tuz konsantrasyonları her eğri için renkli oklar karşılık gelen belirtilmiştir. Hata çubukları, standart sapma ile tanımlanırölçümleri üçlü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Burada, kullanılan başlangıç ​​tuz konsantrasyonu, görsel muayene ile belirlendi ve analiz bir kapak ile gözlemlenebilir ufak mavi rengi neden tuz konsantrasyonu olarak alındı. Ancak daha nicel bir yaklaşım için, araştırmacılar bir başlangıç ​​tuz konsantrasyonu olarak titrasyon eşdeğerlik noktasının orta noktası kullanabilirsiniz araştırma bu alanda yeni. Bu noktadan sonra renk tepkisi hızla artmaya başlar. Ayrıca, tahlil yürütülmesinde kullanılan tuz konsantrasyonu, deney boş ve kokain yanıtları arasındaki renk farkı maksimuma ayarlanmıştır. Giderek artan ve titrasyon ile belirlenen miktarda tuz konsantrasyonunun azaltılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Tuz titrasyon işlemi günlük gerçekleştirilditayini ile gün-gün değişkenlik oluşturmaktadır. Deney için gerekli tuz konsantrasyonundaki seri değişkenliği en fazla% 20. Şekil 2, üç farklı AuNP örnekleri, sitrat stabilize (Resim DNA) MN4 (DNA aptamer stabilize edilmiş) ve MN6 (DNA aptamer stabilize edilmiş) yer alır. MN4 ve MN6 örnekleri için, DNA kapsama / AuNP 60 DNA molekülleri, ve her titrasyon eğrisi yüzey işlemi ile sağlanan stabilite seviyesine göre farklı bir titrasyon eşdeğerlik noktası ve orta nokta bulunur. Sitrat (tek yapı gibi telli) daha fazla istikrar ve MN6 sağlanan (çift yapı gibi telli) küçük istikrar, MN4 sağlanan AuNPs en istikrar sağladı. Bu çalışmada kullanılan başlangıç ​​tuz konsantrasyonu 50 mM, ~ 90 mM ve görsel olarak ~ 130 mm olarak tespit edilmiştir. Eğilim DNA yapısının geleneksel anlayış ve AuNPs 24-25 üzerindeki dengeleyici etkisi ile kabul eder. görsel Bu testi yaparken, tahlil boş hafif mavi Colora gösterdi tartışıldığı gibi orta noktalarında yakın oklarla Şekil 2'de tanımlandığı gibi tuz konsantrasyonlarında, bir üne sahiptir. önceki tezler noktalarına tuz konsantrasyonları çok az veya hiç gözlenebilir renk değişimi sağlamak ve bu noktaların ötesinde renk hızlı bir artış gözlenmektedir. Bu iş için, başlangıç ​​tuz konsantrasyonu görsel belirlendi ve daha sonra tahlil boş ve kokain örneklerinin mikroplaka okuyucu ölçüm karşılaştırmalar kullanarak ince ayar.

Aptamer Testi yaklaşımı ile, yanlış pozitif tepkiler bir sorun vardı. Bir önceki yayın 7 de tarif edildiği gibi analit moleküllerinin yüzey etkileşimleri, bu sorun için bir kaynaktır. Nedeniyle nonspesifik AuNP yüzey etkileşimleri kasıtsız renk yanıtları önlemek için, hedef bağlayıcı aptamer DNA kapsama yoğunlukları (Şekil 3) kontrol edildi.

jpg "/>
Değişen bir DNA kapsama yoğunluğu Şekil 3. Adsorbe aptamer deney tepkisi. Kokaine toplama yanıtı (kırmızı, hedef), iş makineleri (yeşil, kontrol) ve prokain (mavi), bir AuNP yüzey aktif molekül, 90 için, 120, 150, ve 180 DNA / AuNP kapsama yoğunlukları sergilendi. Analiz edilen tüm örnekler, 1 mg / ml metanol içinde çözüldü. Hata çubukları üç ölçümden standart sapma ile tanımlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Genel olarak, AuNP etkileşimleri nedeniyle hedef olmayan analit moleküllerinin yanlış pozitif yanıt oranı, DNA kapsamı arttıkça ile indirgendi. Bununla birlikte, deney hassasiyeti artırılır, DNA içerisinde bir sonucu olarak indirgendi. Bu çalışmada, 60, 90, 120, 150, 180 ve 300 DNA / AuNP edildi araştırılmak DNA yoğunluklarıTed. 60 ve 300 yoğunlukları üzerinde geniş çaplı 7'de tarif edilmiştir. 3 çalışılan ilave DNA yoğunlukları temsil etmektedir Şekil. Prokain Ankete daha çok yüzey aktif nontarget analitlerin biriydi. Bireysel DNA kapsam alanlarının her biri için, deney yanıtı tarif edildiği gibi tuz konsantrasyonunun ayarlanmasıyla maksimize edilmiştir. DNA kapsama arttıkça genel olarak, kontrol (EME) ve kokain tepki arasındaki yanıt farkı azaltır. Benzer şekilde, prokain mevcudiyetinde deney yanıtı artırmak sigortaların arka plan seviyelerine azaltır. yüksek bir hedef yanıtı koruyarak 180 DNA / AuNP yoğunluk ortadan yüzey, prokain için yalancı pozitif tepki ile ilgili. Bu değerlendirme, mümkün olduğu kadar çok bir hedef yanıtı korurken, yüzey ile ilgili yalancı pozitif azaltmak için bu renk deneyleri ayarlama yapmak için bir işlemi tarif etmektedir. Geliştirilmiş hassasiyetleri, DNA içerisinde indirgenmesi ile elde edilebilir. Bununla birlikte, yanlış positif tepkiler uygulamaya bağlı olarak bir sorun haline gelebilir.

Kolorimetrik analizler genellikle hızlı, basit çoğunlukla olası nitel ve nicel hatta testler için kullanılır. kolorimetrik tespitler ile ortak sorunlar, özellikle ince ve sınırda renk farklılıkları, renk muhakeme öznel doğası vardır. analizci tarafından yapılmalıdır yargı aramaları verinin yanlış yorumlanmasına neden olabilir. laboratuar ekipman Ölçümler tahlil sonuçları değerlendirilirken ile ilgili belirsizliği ve kararsızlık azaltır. Ancak bu çalışmada, niyet analisti anında sonuçlar sağlanan bir alan hazır tahlil sağlamak oldu. Bunun gibi, bir fotoğraf görüntü analizi tekniği daha kararlı bir renk sonucu (Şekil 4) sağladığı kuruldu.

Şekil 4,
Şekil 4. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

kokain artan konsantrasyonları ile, deney renkli artan bir mavi renk ile sonuçlanmıştır. kalibrasyon eğrilerinin Dijital fotoğraflar, iki farklı akıllı telefon kullanılarak elde edilen ve ImageJ yazılımı kullanarak analiz için bir standart dizüstü bilgisayar ithal edildi. chromaticity değerleri c çizmek için kullanılanolarak alibration eğrileri, Şekil 4'te gösterilmiştir. görüntü analiz R2 değerleri ile gösterildiği gibi, akıllı telefon görüntülerin her iki set kokain konsantrasyonlarına yönelik doğrusal bir tepki sağladı. Bu yöntem alanında analistin yardımcı olmak için bir Smart-cihaz uygulamasına geçiş oldu. Uygulamanın detaylı değerlendirilmesi önceki yayın 7 yapıldı. Uygulamanın en düşük kokain konsantrasyonlarının ince renk değişikliği sonuçları ile ilgili belirsizlik ve kararsızlık çok ortadan kaldırmıştır.

Bu tip fiziksel adsorbe DNA testlerinin uzun süreli depolama çok ayrıntılı olarak incelenmemiştir ve bu çalışmanın amaçlarından biri tahlil raf ömrünü uzatmak için koşulları bulmak oldu. 4 ° C'de depolama için tahlil bileşenlerinin tedavisi önceki yayında 6'da detaylı. Bu iş için, hazırlanan deney bileşenlerinin liyofilizasyon uzun süreli kullanımı ve depolama için o kabul edilditahlilinde f. tahlil bileşenlerinin liyofilize tutmak ve buzdolabı ya da derin dondurucu ihtiyacını da ortadan kaldıracaktır, oda sıcaklığında örnekleri, depolama belirgin bir avantajı vardır. liyofilize sürecinde birincil adım ilk örneği dondurmak etmektir. AuNP örnekler dondurma işlemi hayatta kontrol etmek için, önce çözülebilir numunesininkine donma tahlilinde absorbans spektrumları bir karşılaştırma. taramalar tam olarak uymalıdır. Numuneler dondurma işlemini hayatta yoksa, çözülmüş örnek spektrumu 525 nm yukarıdaki bölgede absorbans artmış olacak. Bu AuNPs dondurma sırasında toplanabilir ve çözülmüş örnek ele olduğunu gösterir. Çözülmüş testin canlılığı kokain ve EME (Şekil 5) ile test edilmiştir.

Şekil 5,
Şekil 5. Adsorbe Aptamer Deneyi yanıt raf ömrü çalışma. Quantificabir yon EME (yeşil, kontrol), kokain (kırmızı, hedef) tahlil yanıtı dondurulmuş ile gerçekleştirildi ve daha sonra dört haftalık bir süre boyunca Adsorbe Aptamer Deneyi örnekleri eritildi. Hata çubukları üç ölçümden standart sapma ile tanımlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

çözülmüş tahlil boş örnekleri yapılmış ve kullanılan hemen (hayır depolama) örneklerde olduğu gibi çalışma süresi boyunca aynı değerde kaldı. kokain ve EME örnekleri yanıtları hemen yaptı ve kullanılan numuneler (hiçbir depolama) ile gözlenen tipik tepkiler ile uyumlu idi. Deney numuneleri imal edilmiş ve immediatel veya kullanılmış zaman 7 aynı süre boyunca, 4 ° C'de saklanan numunelerde karşılaştırıldığında Donmuş numuneler deney performansı değişiklik ile 4 hafta süreyle izlendiY. Kokain tepkileri de 4 ° C Numuneleri 7 için gözlendi 4 haftalık bir süre boyunca nispeten sabit idi. 2. hafta haftada 1 EME sinyalindeki bir azalma genellikle hem oda sıcaklığında ve 4 ° C'de depolama ile görülmektedir. Bir fenomen ilk haftasında tahlil olgunlaşması atfedilen. Bu yaklaşım adsorbe DNA kolorimetrik testlerin uzun süreli depolama için kullanılabilir seçenekleri artar ve ek uzun vadeli depolama seçenekleri, yani liyofilizasyon için bir ağ geçidi sağladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Geçtiğimiz on yıl içinde, nanopartikül bazlı kolorimetrik analizler hedeflerin saptanması için geliştirilmiştir küçük moleküller, DNA, proteinler ve hücreler 2-4 içerir. nanopartiküller ile DNA aptamers kullanmak Tahliller ilgi kazanmaktadır. Tipik haliyle, bu kolorimetrik analizler AuNPs 9-10'a ilave edilir analit molekülleriyle DNA aptamer karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ancak, bu analizler kontrollü bir laboratuar ayarları ile proof-of-concept gösterilere ve sınırlı, seçilmiş kontrolleri ile faydalanılmıştır. Son gelişmeler alana bu teknoloji 7 yapılmıştır geçiş. Bu yaklaşımda, AuNP adsorbe edildi DNA aptamer analit moleküllerinin ilave edilmeden önce (Şekil 1) Test edilecek olan yüzeyler. ya aptamer-altın nanoparçacık tabanlı kolorimetrik tahlillerin gelişimi üretim / analiz sürecinin çeşitli aşamalarında optimizasyon gerektirir. diske Böylece, bu yeniipline rafineri ve bu deneyleri sorun giderme başarılı olmak için ilişkili nüansları farkında olmalıdır.

adsorbe aptamer-altın nanoparçacık deneyleri her aptamer / hedef çifti için dikkatli optimizasyon gerektirir. Ancak bu adımları burada açıklanan aşağıdaki bu kolorimetrik testlerin optimizasyonu gerçekleştirmek için tutarlı bir protokol sunar. Hedef ve deney boş arasındaki maksimum gözlemlenebilir veya ölçülebilir bir renk değişimi ile sonuçlanan bir tuzu konsantrasyonunun belirlenmesi ve ayar daha kritik optimizasyon adımları (Şekiller 2 ve 3) biridir. Bazı aptamer / hedef çiftleri için, titrasyon eğrisinin uç noktasının yakınında yüksek tuz konsantrasyonları kullanılarak mavi-to-kırmızı renk kayması 18 sonuçlanmıştır olduğunu gözlemledik. Bu hedef ve tuz ilave edilmesi üzerine aptamer tarafından AuNPs bir sabitleme gösterir.

Tahlil pe etkileyebilir diğer faktörlerrformance (tampon bileşenleri ve konsantrasyonları, DNA aptamer içerisinde miktarı, kullanılan çözücülerin, sıcaklık, aptamer sekansı ve yapısının, hedef deney kuluçkalama süresi (hedef önce tuzu ilave edilmeden, tahlile eklenir süre) ve renk gelişimi, zaman dahil zaman rengi geliştirmek için tuz ilave edildikten sonra gerekli). 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.4 tampon maddesi çalışmalarımızda kullanılan hedef / aptamer çiftlerinin birçok tercih edilen deney tamponu. Ancak, bu tampon tüm aptamers için ideal olmayabilir. aptamer doğru katlanmasına elde edilmesi için, deney tamponu bileşenleri uygun olması gerekir ve aptamer seçimi tamponu içinde kullanılan bileşime mümkün olduğu kadar yakın muhafaza edilebilir. AuNPs sahip bir tampon kullanılarak zaman, tampon komponentler ve konsantrasyonları, özellikle iyonik maddeler ile, dikkate alınmalıdır. iyonik bileşiklerin yüksek konsantrasyonlarda AuNPs erken toplanmasına neden olabilir. DNA / AuNP kapsamı, Şekil 3'te gösterilmiştir. DNA olarak90-180 DNA / AuNP kapsama arttıkça, hedef analit yanıtı azalır deney duyarlılığı neden azalmıştır. Bu nedenle, bir kapalı nedeniyle özellikle katlama ve AuNP yüzeyi ile etkileşim derecesi, her bir aptamer bağlıdır gereklidir.

Buna ek olarak, analit molekülleri çözünmesi için gerekli çözücü maddeler AuNPs istenmeyen toplanmasının neden olabilir. Su, deney tamponu ve metanol her sorunu olmadan kullanılmıştır. seyreltme, asetonitril ve dimetilsülfoksit olmadan kullanılabilir (DMSO) istenmeyen agregasyonu neden AuNP yüzeye adsorbe. Asetonitril da% 1'den daha düşük (nihai hacim) seyreltilerde bir konudur. Çözücüler kolorimetrik deney ile kullanımdan önce AuNPs ile test edilmesi gerekir. Deney yapıldığı sıcaklık yanıt tahlili ile gözlenmiştir olup üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu daha belirli bir sıcaklıkta aptamer yapısı ve ergime sıcaklığı, ya da aptamer yapısının istikrarı ile ilgisi vardırnanopartiküller ile. Çalışmalarımızın, biz bir katlanmış biçimde DNA ile önceden hazırlanmış bir yapıda aptamer olan arasında hassas bir denge olduğunu tespit ve sahip de değil tamamen bir tek şeritli yapıda. Bu durum, bu kolorimetrik analizler adsorbe aptamer deneyi şeklinde (Şekil 1) için de geçerlidir. yapısı göz önüne alındığında aptamer yapılarının çoğunu bağımsız oligonükleotid dizilerinin bir sonucu olduğundan, aptamer sekansı da düşünülebilir gerekir. Ancak, bu yönüyle içine daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulmaktadır.

Genel olarak, bir aptamer-AuNP göre kolorimetrik tahlil geliştirme kullanımı yaklaşım, bütün aptamer / hedef çiftleri için de geçerlidir. İlk olarak, ilgilenilen bir hedef için bir aptamer elde. Bu edebiyat veya ilgi bir molekülün bir aptamer seçimi arama yoluyla elde edilebilir. Bu aşamada, aptamer bir kolorimetrik oluşturmak için iyi bir aday olup olmadığını bilmenin bir yolu yokturdeneyi. Bu yalnızca deneylerle tespit edilebilir. Daha sonra, aptamer adsorbe aptamer deneyi (Şekil 1) imal etmek için gece boyunca AuNPs ile inkübe edilir. standart yaklaşım 60 aptamers / AuNP ile test başlayacak; Bununla birlikte, birden fazla Kapsamlı test sonraki aşamada hazırlanır. Tahliller test için hazır olduğunuzda, tarif (Şekil 2) olarak titrasyon eğrisi araştırmaları gerçekleştirmek. titrasyon eğrisinin orta noktası güvenilir bir başlangıç ​​hedef için kullanılacak tuz konsantrasyonunda, deney boş ve kontrol testleri olarak hizmet vermektedir. tuz konsantrasyonu hedef ve tahlil boş örnekler arasında maksimum renk farkını sağlamak için ince ayar edilir. yanıtı, gerçek ve bağlayıcı aptamer hedefe neden ve non-spesifik bir hedef / çözücü etkileşimleri nedeniyle değil test etmek için, kontrol grubu ile tahlil gerçekleştirin. Aynı zamanda, deney renk geliştirme süreleri 5 dakika aralıklarla incelenmiştir. 5 dk inte hedef-tahlil inkübasyon sürelerinde izlediBu adım optimize kadar rvals, başlangıçta 15+ dakika inkübasyon süreleri kullanılmıştır. Sonuçlarına bağlı olarak, tuz konsantrasyonu, aptamer kapsamı, inkübasyon süresi ve renk geliştirme zamanı daha fazla optimizasyon gerekli (Şekil 3) olabilir. Bu yaklaşım, bir hedef / aptamer çifti için tasarım ve aptamer-AuNP kolorimetrik testlerin geliştirilmesi için bir protokol açıklamaktadır. adsorbe aptamer kolorimetrik testlerin geliştirilmesi üzerinde aptamer dizisi ve yapısal etkileri içine Başka araştırmalar büyük bir ilgi vardır. aptamer, hedef ve AuNPs ile bağlantılı etkileşim anlamak için bir ihtiyaç vardır. Bu bilgi daha fazla işlevsellik için aptamers terzilik ve hatta aptamers emdirilmiş aptamer tahlil formatında etkin olacağı tahmin yol açabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
  2. Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
  3. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  4. Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
  5. Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
  6. Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
  7. Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  8. Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
  9. Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
  10. Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
  11. Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
  12. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  13. Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
  14. Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
  15. Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
  16. Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
  17. Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
  18. Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
  19. Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  20. Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  22. Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
  23. Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  24. Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
  25. Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).

Tags

Biyokimya Sayı 112 kolorimetrik altın nanopartiküller aptamer kolorimetrik uygulaması nükleik asitler nanoteknoloji biyosensörler optik sensörler
In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, J. E., Chávez, J. L.,… More

Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter