Design och utveckling av aptamer-guld nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser för in-the-fältet Program

Summary

Design och utveckling av en aptamer-guld nanopartiklar kolorimetrisk analys för detektion av små molekyler för in-the-fältet applikationer undersöktes. Dessutom var en smart-anordning kolorimetrisk applikation (app) validerade och långsiktig lagring av analysen fastställdes för användning i fält.

Abstract

Design och utveckling av en aptamer-guld nanopartiklar (AuNP) kolorimetrisk analys för detektion av små molekyler för in-the-fältet applikationer undersöktes. Mål selektiv AuNP baserade färganalyser har utvecklats i kontrollerade proof-of-concept laboratoriemiljö. Emellertid har dessa system inte utövas på en punkt av misslyckande att fastställa deras praktiska användning utanför laboratoriemiljö. Detta arbete beskriver en generisk metod för att designa, utveckla och felsöka en aptamer-AuNP kolorimetrisk analys för småmolekylära analyter och använder analysen för in-the-fältet inställningar. Analysen är fördelaktigt eftersom adsorberade aptamers passivera nanopartiklar ytor och ger ett medel för att minska och eliminera falska positiva svar på icke-målanalyter. Övergång detta system till praktisk användning krävs definierar inte bara hållbarheten av aptamer-AuNP analys men om fastställande av metoder och rutiner för att förlänga långtidsförvaring capabilsamhet. Dessutom är en av de erkända problem med kolorimetrisk avläsning den börda analytiker att exakt identifiera ofta subtila förändringar i färg. För att minska ansvaret på analytiker inom området, var en färganalysprotokoll konstruerad för att utföra färgidentifierings arbetsuppgifter utan att behöva för att utföra denna uppgift på laboratoriekvalitet utrustning. Metoden för att skapa och testa den dataanalys protokoll beskrivs. Men för att förstå och påverka utformningen av adsorberade aptamer analyser interaktioner i samband med aptamer, mål och AuNPs kräver ytterligare studier. Den kunskap kan leda till att skräddarsy aptamers för förbättrad funktionalitet.

Introduction

Kolorimetri är en av de äldsta tekniker som används inom analytisk kemi. För denna teknik, är en kvalitativ eller kvantitativ bestämning av analyten som gjorts baserat på produktion av en färgad förening ^1. Typiskt färganalyser använder reagenser som upplever en färgskiftning i närvaro av analytarter, vilket resulterar i en observerbar eller detekterbar färgförändring i det synliga ljusspektrumet. Kolorimetri har använts vid detektion av mål som sträcker sig från atomer, joner och små molekyler till komplexa biologiska molekyler, såsom deoxiribonukleinsyror (DNA), peptider och proteiner ^2-4. Under de senaste två decennierna har nanomaterial revolutionerat området för detektionsanalyser, särskilt med färg baserade analyser ^5-6. Kombinera de unika kemiska och fysikaliska egenskaperna hos nanomaterial med ett mål selektiv igenkänningselement, såsom antikroppar, oligonukleotid-aptamerer eller peptid aptamerer, har lett till återkomsten in design och utveckling av kolorimetriska detektionsanalyser ^7.

Metallnanopartiklar har en påvisad storleksberoende färgförändring egendom, som har utnyttjats i utformningen av många kolorimetriska analyser. Guldnanopartiklar (AuNPs) är av särskilt intresse på grund av en distinkt röd-till-blå färgskiftning, när den dispergerade lösningen av partiklar induceras att aggregera ^8, typiskt genom den exakta tillsatsen av salt. Möjligheten att styra övergången från spridda (röd) den aggregerade (blå) stater har lett till skapandet av kolorimetriska sensorer för joniska, små molekylära, peptid, protein och cellulära mål ^2-4,9. Många av dessa sensorer anställa aptamers som måligenkännande motiv.

Aptamerer är DNA eller ribonukleinsyra (RNA) -molekyler valda från ett slumpmässigt pool av 10 ¹² -10 ¹⁵ olika sekvenser ^10-11. Urvalsprocessen identifierar mål rekognition element med bindningsaffiniteter i låga nanomolära regimen, och systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) är den mest kända process ^12-13. Fördelar med oligonukleotid baserade aptamers för analystillämpningar inkluderar enkel syntes, kontrollerbar kemisk modifiering och kemisk stabilitet ^14-15.

Ett sätt att skapa en kolorimetrisk analys kombinerar nanomaterial med igenkänningselement, består av att kombinera dessa två arter genom fysikalisk adsorption av DNA-aptamer molekyler till AuNP ytor. Genom mål-aptamer-bindning, upplever aptameren en strukturell förändring ^16-18 som förändrar interaktionen av aptameren med AuNP yta, vilket leder till en inducerbar röd-till-blå färg respons ¹⁹ med tillsats av salt. Denna häpnadsväckande inslag i AuNPs ger ett observer kolorimetrisk svarsmekanism för aptamer-baserade enheter som kan användas för att frånunderteckna kolorimetriska analyser för olika analyter.

Färg analyser utformade med hjälp av icke-kovalenta, fysiskt adsorberade DNA aptamerer på AuNP ytor har det stigma av att vara en svag sensorplattform på grund av problem med robusthet, en benägenhet för fel utanför kontrollerade laboratoriemiljö, och bristen på information som finns tillgänglig för användning i praktisk inställningar. Emellertid den aptamer-AuNP kolorimetrisk analys var av intresse på grund av enkelheten i drift och observerbar färgrespons. Målet med detta arbete är att tillhandahålla ett protokoll för konstruktion, utveckling, drift, minskning av ytan i samband falska positiva svar, och långtidslagring av DNA-AuNP baserade kolorimetriska analyser som använder kokain som representant analyt. Dessutom föreslog vi denna adsorberat aptamer analys strategi (Figur 1) som fördelaktigt på grund av enkelhet och användarvänlighet som resulterade i färre steg än det konventionella tillvägagångssättet för dessa aptamer-AuNP assays. För denna analys var aptameren först till de AuNPs, som tilläts att adsorbera till ytan under en längre tidsperiod. En ytterligare fördel med detta tillvägagångssätt var minskningen av svaret på icke-målanalyt molekyler rör AuNP ytinteraktioner. Emellertid en minskning i falska positiva svar var på bekostnad av analyskänsligheten. Därför är en balans mellan ytskydd och analyt tillgänglighet är nödvändig för att upprätthålla god analysfunktion. Dessutom en stor brist att analysera färganalyser genom andra medel än med instrument är att resultaten är ofta subjektiva och öppet för tolkning från analytiker till analytiker, i synnerhet när man försöker skilja subtila skillnader i färg. Omvänt finns det ett antal problem med att göra laboratorium baserade instrument som kan användas utanför labbet, såsom tillgång till makt, praktiska med bärbarhet, etc. I detta arbete har en färganalys protokoll som utvecklats för more bärbarhet och att eliminera en del av gissningar som vanligen förknippas med färg baserad analys tolkning ^20-21. Jämfört med tidigare metoder, strävade denna ansträngning att driva dessa analyser till sina gränser för applikationer utanför laboratoriemiljö.

Protocol

1. Syntes via Citrate Reduction of Gold nanopartiklar (AuNP) och karakterisering

1. Rengöra en Erlenmeyer-kolv (500 ml) och stora omrörarstav med 5 ml koncentrerad salpetersyra och 15 ml koncentrerad klorvätesyra i kemikaliesäkerhetshuven.
   1. Väta hela ytan av kolven med syratvätt, skölj kolven med nukleasfritt vatten, och låt kolven torka.
2. Tillsätt 100 ml 1 mM guld (III) klorid; använda ett ark med aluminiumfolie för att täcka toppen av syran rengöras Erlenmeyerkolv och värme med kontinuerlig omrörning på en het platta tills kokning.
3. Tillsätt 10 ml av 38,8 mM natriumcitrat. Färgen ändras från klar / grå, till mörkblå / svart, och slutligen mörkröd under flera minuter. Fortsätt omrörningen med värmen av för 10 min.
4. Tillåta AuNP suspensionen svalna till rumstemperatur och tillsätt 110 | il av dietylpyrokarbonat (DEPC) under kontinuerlig omröring.
5. Täck hela kolven medaluminiumfolie och låt DEPC behandlingen inkubera över natten. Förvara alla AuNPs i mörker, i bärnsten förvaringsbehållare eller täckt med aluminiumfolie.
6. Autoklavera AuNP suspensionen, kyl till rumstemperatur och filtrera genom ett 0,22 | j, m por cellulosaacetatmembran. Lagra den filtrerade, autoklaverade AuNP stamlösning i mörker vid 4 ° C.
   OBS: Behandling med DEPC, sterilisering via autoklaven och lagring vid 4 ° C kommer att förbättra hållbarheten av aptamer-AuNP analys. Lagring på detta sätt kommer att möjliggöra för analysen att de fungerar i mer än 2 månader.
7. Beräkna AuNP koncentrationen genom att erhålla Ultra Violet-Visible absorption vid 520 nm, och använda extinktionskoefficienten (ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^-1 med Beers lag genom att beräkna koncentrationen (c). Koncentrationen bestämdes vara 10 nM med en storlek av 15 nm bestämd genom dynamisk ljusspridning.
   OBS: Halterna varierar frOm sats till sats. Späd AuNP lager med nukleasfritt vatten som behövs för att upprätthålla den önskade 10 nM AuNP suspension.

2. DNA-aptamer, buffert, lösning, och analys Förberedelse

1. Köp eller syntetisera följande kokain bindande aptamer sekvenser med användning av standard fosforamiditkemi ^22:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Rena aptamers använder standard avsaltning ^23. Rekonstituera oligonukleotider i nukleasfritt vatten vid antingen 100 | iM eller 1 mM förrådslösningar. Alikvot och förvara vid -20 ° C under flera månader.
3. Inköp eller förbereda lager av steril 1 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) pH 7,4, 100 mM magnesiumklorid _(MgCl2), och ett M natriumklorid (NaCl).
4. Förbered 50 ml av buffert i nukleasfritt vatten with koncentrationer av 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 och förvara vid rumstemperatur i månader.
5. Inkubera DNA med aktie AuNP lösning (10 nM) under 3-4 timmar vid rumstemperatur och skydda från ljus. Variera volymen av AuNPs som önskas för att ge tillräckligt med prov för tester som skall utföras (2,5-7,5 ml).
   1. Här använder beläggningsgrader på 90, 120, 150, och 180 DNA-molekyler / AuNP i detta arbete. Variera volymen och koncentrationerna av DNA därefter. Tune DNA täckning för att minska oavsiktliga AuNP ytrelaterade färg svar icke-målanalyter.
      OBS: En ökning av DNA-täckning kommer att minska analyskänsligheten. De beläggningsgrader beräknas från att känna av koncentrationen av AuNP lager, och beräkning av det totala antalet AuNPs närvarande i den önskade för användning i experiment volym. Om de faktiska täckning tätheter önskas, finns protokoll för att erhålla dessa värden ^7. DNA täckningen bestämdes genom användning av en 50 kDa molecular viktsgräns spinnkolonn för att separera AuNP bundet DNA från fritt DNA. De AuNPs är för stora för att passera genom rotationskolonn, medan fritt DNA passerar igenom lätt. Nästa steg är att kvantifiera den fritt DNA uppsamlades med användning av absorbansmätningar eller en enkelsträngad DNA-fluorescerande färgämne.
6. Tillsätt en lika volym av 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 buffert och placera provet vid 4 ° C i mörker över natten. Aptameren-AuNP analysen var i en 10 mM HEPES, 1 mM _MgCl2, pH 7,4 (analysbuffert).

3. Salt Titrering och analys Setup

1. Kontrollera den initiala saltkoncentrationen som krävs för att inducera analysfärgrespons genom salt titrering med analysämnet. Tillsätt 20 | il metanol (blank) till 180 | il alikvoter av aptamer-AuNP analys i en 96-brunnsplatta. Titrera proverna med ökande volymer av lager NaCl-lösning (1 M eller 2 M) och bestämma ekvivalenspunkten (Figur 2 OBS: Analysen kan skalas till mindre volymer genom att hålla förhållandet mellan metanol tom (eller löst analyt) till aptamer-AuNP analysen densamma.
   1. Här, fastställa vilken NaCl volym som krävs för att orsaka den minsta färgförändringen genom visuell observation. Utgångs koncentration för analysen var 75 mM och 130 mM för MN4 och MN6, respektive på en 60 DNA-molekyl / AuNP täckning densitet.
      OBS: För en kvantitativ bestämning för den initiala saltkoncentrationen, mittpunkten av titreringskurvan tjänar som en bra utgångspunkt. Dessutom kommer koncentrationer som används varierar beroende på aptamer, täckning täthet DNA, från dag till dag prestanda och sats till sats.
2. Optimera testsvaret, tillsätt 20 | il av analytmolekyler utspädda i metanol till 180 | j, l alikvoter av aptamer-AuNP analys i en 96-brunnars platta vid rumstemperatur. Omedelbart lägga NaCl-koncentrationen bestämdes i föregående steg för att initiera analysen färgrespons.
   NEJTE: Använd en flerkanalspipett att utföra flera experiment samtidigt.
3. Erhålla den största färgförändring möjlig genom ökning eller minskning av NaCl-koncentrationen, och jämförelse av målsvaret på den tomma svar. Använda NaCl-koncentrationen som ger den största svarsskillnad.
4. Observera eller mäta testsvaret 150 sek efter NaCl tillägg. Analysera absorbansen vid 650 nm och 530 nm med hjälp av en spektrometer eller få en digitalkamera foto av analyssvar (se avsnitt 4 för fotoanalysprotokoll).
   OBS: En mikroplattläsare användes för att erhålla mätningarna för detta arbete.
5. Plotta resultaten som förhållandet mellan absorbansen erhölls vid 650 nm och 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ som en funktion av analytkoncentrationen. Normalisera testsvaret till den tomma signal som gjordes i detta arbete.

4. Foto och Digital Image Color Analysis protokollanalys

1. prepare analysprover som beskrivits (avsnitt 3,2-3,3). Placera 96-brunnar på en transilluminator.
   OBS: En standard laboratorie transilluminator är typiskt för ljus för att erhålla användbara digitala bilder för denna analys. Dessa transilluminators orsakar regelbundet fördelade "mörka linjer" att visas i den digitala bilden på grund av intensiteten av ljuskällan. Att göra en transilluminator från en Ijusemitterande diod (LED) baserat ljuslåda och en bit av opak plast fungerar bra.
2. Erhålla bilder av 96-brunnar vid 150 sek efter NaCl dessutom importera bilder till mjukvara för bildanalys, och beräkna den genomsnittliga röda, gröna och blå (RGB) värden, med hjälp av en inkrementell medelvärdesteknik, som visas i ekvation 1 ^24:
   (1)
3. Konvertera RGB-värdena från standard RGB (sRGB) färgrymd till kromaticitetsdiagrammet (CIExyY) färgrymd, med hjälp av följande ekvationer ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Konvertera de exponentiella RGB-värden till linjära RGB-värden med hjälp av ekvation 2. Matrisen anges i ekvation 3 för att beräkna X-, Y- och Z-värden av CIE-färgrymd ^24.
5. Beräkna x och y kromatiska värden med hjälp av ekvation 4 representerar den genomsnittliga färgen på pixlarna i området som valts ut för analys ^24.
6. Utföra analysen i varje brunn och plotta kromatiska värdena för att generera en kalibreringskurva (figur 4). Erhålla standardfelet genom att analysera färgen på olika områden av samma brunn.

5. Frysning aptamer-AuNP analys för Långsiktig lagring

1. Förbered aptamer-AuNP analyskomponenter som beskrivs i avsnitt 2.4 och 2.5. Göra separata lösningar innehållande 1 g / ml trehalos och 1 g / ml sackaros i nukleasfritt vatten för att göra det kryogena medlet Solution.
   OBS: Höga koncentrationer av trehalos och sackaros användes för att minska spädningsfaktorn när de förbereder analysen för frysning. Värm de sockerlösningar på en het platta i en bägare med vatten för att grundligt lösa upp socker före användning.
2. Göra en lösning som innehåller 19,2 mg / ml trehalos och 4,8 mg / ml sackaros med 60 MN4-DNA / AuNP analysen vid en slutlig volym av 200 pl i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Slutliga kryogen lösningskoncentrationer varierar med DNA täckning.
   OBS: Prover skall frysas bör inte överstiga 300 l. Större volymer kan inte frysa ordentligt.
3. Flash frysa proverna med användning av en -146 ° C frys eller i flytande kväve. Lagra proverna frysta fram till användning. Lagring kan vara i en -80 ° C eller -20 ° C en gång flash frysning är klar.
4. För detta arbete, lämna prover i -146 ° C frys övernatten och sedan överföra till en -20 ° C frys under långtidslagring.
   OBS: Flash frysning kan orsaka aptamer-AuNPs att aggregera. Testa integriteten av frysprocessen genom att övervaka absorbansen profil och jämföra den med en ofrusen prov. Om aggregering observeras, öka mängden kryogen lösning för att kompensera för denna fråga.
5. Tina proverna vid rumstemperatur och använder endast tillräckligt prover som behövs för experiment. Skaffa absorbansspektra av tinade prover och jämföra baslinjen spektra av en ofrusen kryogen lösning behandlat prov. Mät absorbansen från 400 nm till 700 nm.
6. Utför salt titrering (avsnitt 3.1), testa analysen (avsnitt 3.2), och plotta resultaten (avsnitt 3.3 och 3.4) som tidigare beskrivits.

Representative Results

Det primära syftet med detta arbete var att utveckla och undersöka stabiliteten och robusthet aptamer baserad AuNP kolorimetriska analyser för användning i fält. Som framhålls i en tidigare publikation, var två skilda strategier för att skapa analysen undersöktes ^7. Analyserna kallas Free aptamer-analys och de adsorberade aptamer-analys. De adsorberade aptamer-analys var mer tilltalande när det gäller en fieldable detektionsanalys (Figur 1).

. Figur 1. Schematisk representation av de adsorberade aptamer-analys Den aptamer blandades med AuNPs och inkuberades över natt; analytmolekyler lösta i metanol sattes till den Absorberad aptamer-analys, omedelbart följt av tillsats av natriumklorid (NaCl) för att inducera AuNP aggregation när målet tillsattes.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Detta berodde på minskningen av falska positiva värden till nontarget analyter, relativa enkelhet och användarvänlighet av de adsorberade aptamer-analys. För att framställa de adsorberade aptamer-analys, DNA-aptamer blandas med AuNPs och inkuberades över natt i analysbufferten. Detta gjorde det möjligt för aptamer att lätt adsorberas på AuNP yta, vilket minskade känsligheten hos analysen för falska positiva svar på nontarget analytmolekyler såsom maskering eller skärmedel. Men endast den förformade strukturen för MN4 kokain aptamer var aktiv i närvaro av kokain (mål) i denna analys design. Analysen användes genom att tillsätta analytlösningar följt av omedelbar tillsats av lämplig koncentration av NaCl. Saltlösningar användes för att initiera observer och measurable färgförändring av analysen. Analysen utfördes inom 2-3 minuter. efter tillsatsen av analytlösningen.

En kritisk åtgärd vid utförandet av dessa fysikaliskt adsorberade DNA baserade kolorimetriska analyser är den inducerade färgrespons, genom tillsats av den lämpliga koncentrationen av salt. Tillsatsen av salter är kända för att destabilisera AuNP suspensioner resulterar i aggregering av partiklarna genom att maskera de negativa laddningarna i citrat skiktet som stabilisera AuNPs, och sedan minskar de interpartikulärt elektrostatiska interaktioner. Resultatet är den observerbara röd-till-blå färgförändring. Samma effekt observeras med DNA-behandlade AuNPs. När det gäller DNA-aptamerer, analytiker bestämma koncentrationen av salt som krävs för att orsaka minimal observerbar AuNP destabilisering (blåfärgning). Med tillägg av målet är att stabilisera de AuNPs av DNA-aptamer minskat betydligt vilket resulterar i en observable, mätbara mål dos-responsfärgförändring. Denna färgändring kan endast uppfattas med tillsats av den lämpliga förutbestämd mängd av salt.

Lika viktigt är den process i vilken lämplig koncentration av salt bestämdes. Detta åstadkoms genom att utföra en titreringskurva genom tillsats av ökande koncentrationer av natriumkloridlösning till en serie av analysämnen (Figur 2).

Figur 2. Salt-inducerad titrerkurvan. Citrat stabiliserad (röd), MN4 kokain bindande aptamer (grön), och MN6 kokainbindnings aptamer (lila) behandlade AuNP prover titrerades med natriumklorid (NaCl). De initiala saltkoncentrationer erhållna visuellt angavs med motsvarande färgade pilar för varje kurva. Felstaplar definieras av standardavvikelsen itredubbla mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Här var den initiala saltkoncentrationen som används bestäms genom visuell inspektion, och fördes till vara saltkoncentrationen som orsakade minsta blåfärgning observer med analysämnet. Men för en mer kvantitativ metod, forskare ny på detta forskningsområde kan använda mittpunkten av titreringen ekvivalenspunkten som utgångssaltkoncentration. Bortom denna punkt färgrespons börjar öka snabbt. Vidare har saltkoncentrationen som används i utförandet av analysen justeras för att maximera färgskillnaden mellan analys tomma och kokainsvar. Detta åstadkoms genom att öka och minska saltkoncentrationen från det belopp som fastställs genom titrering. Saltet titrering proceduren utfördes dagligen tillredogöra för dag-till-dag variation med analysen. Satsen variabilitet i saltkoncentration som behövs för analysen var inte mer än 20%. Figur 2 har tre distinkta AuNP prover, citrat stabiliserad (ingen DNA), MN4 (DNA-aptamer stabiliserats), och MN6 (DNA-aptamer stabiliserade). DNA-täckningen för MN4 och MN6 prover var 60 DNA-molekyler / AuNP, och varje titreringskurva har en annan titrering ekvivalenspunkten och mittpunkten baserat på den nivå av stabilitet som tillhandahålls av ytbehandlingen. Citrat förutsatt lite stabilitet, MN4 (dubbelsträngad liknande struktur) gav mer stabilitet och MN6 (enkelsträngad liknande struktur) som mest stabilitet till AuNPs. De initiala saltkoncentrationer som används i detta arbete hade bestämt sig för att vara ~ 50 mM, ~ 90 mM, och ~ 130 mM visuellt. Trenden håller med konventionell förståelse av DNA-struktur och dess stabiliserande effekt på AuNPs ^24-25. När du utför detta test visuellt analys tom visade en liten blå Colora tion med saltkoncentrationer som identifierats i fig 2 med pilar, som ligger nära mittpunkterna som diskuteras. Saltkoncentrationer före avhandlingar punkter ger lite eller ingen observerbar färgförändring, och bortom dessa punkter färg ökar snabbt. För detta arbete var den initiala saltkoncentrationen bestämdes visuellt och sedan finjusteras med hjälp av mikro läsare mätning jämförelser av analys tomma och kokainprover.

Med Free aptamer analys strategi falska positiva svar var ett problem. Ytinteraktioner analyt molekyler är en källa för denna fråga, som beskrivs i en tidigare publikation ^7. För att förhindra att oavsiktliga färg svar på grund av ospecifika AuNP ytinteraktioner ades DNA-täckning tätheter av målbindande aptamer kontrollerad (Figur 3).

jpg "/>
Figur 3. Adsorberat aptamer testsvaret med varierande DNA täckningsdensiteten. Aggregation svar på kokain (röd, mål), EME (grön, kontroll), och prokain (blå), en AuNP yta aktiv molekyl, för 90, 120, 150, och 180 DNA / AuNP täckningsdensiteterna visas. Alla de analyserade proven löstes i metanol vid 1 mg / ml. Felstaplar definieras av standardavvikelsen i tredubbla mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I allmänhet var det falska positiva svarsfrekvens på nontarget analytmolekyler på grund av AuNP interaktioner reduceras med ökande DNA täckning täthet. Emellertid var analyskänsligheten reduceras som en konsekvens av ökad DNA-täckning. I detta arbete, DNA-densiteter av 60, 90, 120, 150, 180, och 300 DNA / AuNP var UNDERSÖKNINGted. Tätheter av 60 och 300 var beskrivs utförligt i tidigare arbete ^7. Figur 3 representerar ytterligare DNA-densiteter studerade. Prokain var en av de mer höggradigt ytaktiva nontarget undersökta analyter. För var och en av de enskilda DNA-omfattningar, var testsvaret maximeras genom att justera saltkoncentrationen som beskrivs. I allmänhet som täcknings ökar DNA, skillnaden svar mellan kontroll (EME) och kokain svar minskar. På liknande testsvaret i närvaro av prokain minskar till bakgrundsnivåer med ökande omfattningar. 180 DNA / AuNP densitet elimineras yta relaterade falskt positivt svar för prokain, samtidigt som man behåller en hög målsvaret. Denna bedömning beskriver ett förfarande för avstämning av dessa färg analyser för att minska ytrelaterade falska positiva svar, samtidigt som målsvaret så mycket som möjligt. Förbättrade känslighet kan uppnås genom en minskning av DNA-täckning. Men falska positiva svar kan bli ett problem beroende på användningsområde.

Kolorimetriska analyser används vanligen för snabba, enkla ofta presumtiva kvalitativa och även kvantitativa tester. Vanliga problem med kolorimetriska bestäm är subjektiva karaktär färg urskiljning, särskilt med subtila och borderline färgskillnader. Domen samtal som måste göras av den som utför analysen kan resultera i felaktig tolkning av data. Mätningar på laboratorieutrustning minska osäkerheten och obeslutsamhet i samband med bedömningen av analysresultaten. Men i detta arbete, avsikten var att ge ett fält redo analys som gav omedelbara resultat till analytikern. Som sådan var ett foto bildanalysteknik etablerad som gav en mer avgörande färgresultat (Figur 4).

Figur 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Med ökande koncentrationer av kokain, analys färgen resulterade i ett ökande blå färg. Digitala bilder av kalibreringskurvor erhölls genom att använda två olika smartphones, och importeras till en vanlig bärbar dator för analys med hjälp av ImageJ programvara. De kromatiska värdena användes för att rita calibration kurvor som visas i Figur 4. Den bildanalys tillhandahålls ett linjärt svar på ökande kokainkoncentration med båda uppsättningarna av smartphone bilderna som anges av R ² värden. Denna metod överflyttades till en Smart-enhet app för att hjälpa den som utför analysen i fält. En detaljerad utvärdering av appen utfördes i en tidigare publikation ^7. Appen elimineras mycket av osäkerhet och obeslutsamhet i samband med subtila färgförändring resultaten av de lägsta kokainkoncentrationer.

Långsiktig lagring av fysiskt adsorberade DNA-analyser av denna typ har inte studerats i detalj och ett av målen med detta arbete var att hitta förutsättningar för att utvidga analysen hållbarhetstid. Behandling av analyskomponenterna för lagring vid 4 ° C i detalj i en tidigare publikation ^sex. För detta arbete har frystorkning av de preparerade analyskomponenterna övervägas för långtidsanvändning och lagring of analysen. Lyofilisera analyskomponenterna har den klara fördelen av att hålla och lagra proverna vid rumstemperatur, vilket skulle eliminera behovet av ett kylskåp eller frys. Det första steget i frystorkning processen är att först frysa provet. Att kontrollera de AuNP prover överlever frysprocessen, utför en jämförelse av absorbansspektra av analysen före frysning med den hos det tinade provet. Skannar ska matcha exakt. Om proverna inte överlever frysning processen kommer den tinade provspektrumet har ökat absorbans i området över 525 nm. Detta tyder på att AuNPs samman under frysning och tinade provet äventyras. Livskraft tinade analysen testades med kokain och EME (Figur 5).

Figur 5. Adsorberat aptamer testsvar hållbarhetstid studie. Quantificaning av testsvaret till EME (grön, kontroll) och kokain (röd, mål) utförs med fryst och sedan tinas Absorberade aptamer Analysprover under en period av fyra veckor. Felstaplar definieras av standardavvikelsen i tredubbla mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De tinade analysblankprov kvar på samma värde under studieperioden som prov som gjordes och användas omedelbart (ingen lagring). Svaren från de kokain och EME prover överensstämde med typiska reaktioner som observerats med prover som gjorts och användas omedelbart (ingen lagring). De frysta proverna övervakades under perioden 4 veckor utan ändring av analysprestanda jämfört med prov lagrade vid 4 ° C under samma tidsperiod ⁷ eller analysprover som gjorts och som används immediately. Kokain svar var relativt konstant under fyra veckor, som också observerades för 4 ° C prover ^7. Minskningen i EME signal från vecka 1 till vecka 2 observeras ofta med rumstemperatur och 4 ° C lagring samt. Ett fenomen vi hänföras till mognaden av analysen under den första veckan. Detta tillvägagångssätt förstärkt tillgängliga alternativ för långtidslagring av de adsorberade DNA kolorimetriska analyser, och som en inkörsport till ytterligare långfristiga lagringsalternativ, nämligen frystorkning.

Discussion

Under det senaste årtiondet har nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser utvecklats för detektering av mål innefattar små molekyler, DNA, proteiner och celler ^2-4. Analyser som använder DNA-aptamerer med nanopartiklar har vunnit intresse. Normalt är dessa kolorimetriska analyser utförs genom att blanda DNA-aptamer med analytmolekyler följt av tillsats till AuNPs ^9-10. Emellertid har dessa analyser använts i proof-of-concept demonstrationer med kontrollerad laboratoriemiljö och med begränsade, utvalda kontroller. Nya framsteg att övergången denna teknik i området har gjorts ^7. I detta tillvägagångssätt det DNA-aptamer adsorberades till AuNP ytorna före tillsats av analytmolekylerna som skall testas (figur 1). Utvecklingen av antingen aptamer-guld nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser kräver optimering i olika stadier av tillverkningen / analysprocessen. Således, de nya till skivanipline måste vara medvetna om nyanserna i samband med förädling och felsökning dessa analyser för att lyckas.

De adsorberade aptamer-guld nanopartiklar analyser kräver noggrann optimering för varje aptamer / target par. Men genom att följa stegen som beskrivs här ger en jämn protokoll att utföra optimering av dessa kolorimetriska analyser. Fastställandet och justering av saltkoncentrationen som ger maximal observer eller mätbar färgförändring mellan målet och analys tomt är en av de mer kritiska optimeringssteg (figur 2 och 3). För vissa aptamer / mål par, har vi observerat att användning av höga saltkoncentrationer i närheten av slutpunkten titrerkurvan har resulterat i en blå-till-röd färgskiftning ^18. Detta tyder på en stabilisering av AuNPs av aptamer vid tillsats av målet och salt.

Andra faktorer som kan påverka analys performance inkluderar buffertkomponenter och koncentrationer, mängden DNA-aptamer täckning, lösningsmedel som används, temperatur, aptamer sekvens och struktur, mål-assay inkubationstid (tid då målet sätts till analysen, före salttillsats), och färgutvecklingstiden ( tid som behövs för färgen utvecklas, efter salttillsats). En 10 mM HEPES, 1 mM _MgCl2 pH 7,4 buffert var analysbufferten val i många av de mål / aptamer par som används i vårt arbete. Dock kan denna buffert inte vara perfekt för alla aptamers. För att få korrekt vikning av aptamer, kan analysbuffertkomponenter måste anpassas och hållas så nära som möjligt till den komposition som används i buffert aptamer val av. Vid användning av en buffert med AuNPs måste buffertkomponenter och koncentrationer övervägas, särskilt med joniska ämnen. Höga koncentrationer av joniska föreningar kan orsaka för tidig aggregering av AuNPs. DNA / AuNP täckning visades i Figur 3. Eftersom DNAtäckning ökar från 90 till 180 DNA / AuNP minskade målanalyten svaret orsakar minskad analyskänslighet. Därför behövs en kompromiss som beror på varje aptamer, på grund av dess speciella vikning och graden av interaktion med AuNP ytan.

Dessutom kan lösningsmedel som behövs för att lösa analytmolekyler resulterar i oavsiktlig sammanläggning av AuNPs. Vatten, analysbuffert, och metanol har alla använts utan problem. Användas utan spädning, acetonitril och dimetylsulfoxid (DMSO) adsorbera till AuNP ytan orsakar oavsiktlig aggregering. Acetonitril var problematiskt även vid spädningar av mindre än 1% (slutlig volym). Lösningsmedel bör testas med AuNPs före användning med kolorimetrisk analys. Den temperatur vid vilken analysen utförs kan ha en inverkan på huruvida en respons observeras med analysen. Detta har mer att göra med aptamer struktur och smälttemperaturen, eller stabiliteten av aptamer strukturen vid en given temperatur, änmed nanopartiklar. I vårt arbete har vi fastställt att det är en känslig balans mellan att ha aptamer i en förformad struktur med DNA i en vikt form, och inte heller helt i en enkelsträngad struktur. Detta är fallet för den adsorberade aptamer analys formen av dessa kolorimetriska analyser (Figur 1). När man överväger struktur måste aptamer sekvensen också övervägas eftersom mycket av aptamer struktur är resultatet av de enskilda oligonukleotidsekvenser. Det behövs dock ytterligare utredning denna aspekt.

I allmänhet, är det tillvägagångssätt som vi använder för att utveckla en aptamer-AuNP kolorimetrisk analys densamma för alla aptamer / mål-par. Först få en aptamer för ett mål av intresse. Detta kan uppnås genom att söka i litteraturen eller val av en aptamer för en molekyl av intresse. I detta skede finns det inget sätt att veta huruvida den aptamer är en bra kandidat för att skapa en kolorimetriskanalysera. Detta kan endast fastställas genom experiment. Därefter aptamer inkuberas med AuNPs över natten för att fabricera den adsorberade aptamer-analys (figur 1). Standardförfarandet är att börja testa med 60 aptamers / AuNP; dock flera omfattningar förberedda för nästa steg av tester. När analyserna är klara för testning, utföra titrerkurvan undersökningar som beskrivs (figur 2). Mittpunkten av titreringskurvan fungerar som en pålitlig start saltkoncentration som skall användas för målet, assay tom och kontrolltester. Saltkoncentrationen är finjusteras för att ge en maximal skillnad färg mellan målet och analysblankprov. För att testa svaret är verkliga och orsakas av aptamer-målbindande och inte på grund av icke-specifika mål / lösningsmedel interaktioner utföra analysen med kontroller. Samtidigt är analysfärgutvecklingstider undersöktes vid 5 minuters intervall. Följt av mål-analys inkubationstider vid 5 min Intervals är initialt 15+ min inkubationstider användas förrän detta steg är optimerad. Beroende på resultaten, kan ytterligare optimering av saltkoncentrationen, aptamer täckning, inkubationstid och färgutvecklingstiden vara nödvändigt (Figur 3). Detta tillvägagångssätt beskriver ett protokoll för konstruktion och utveckling av aptamer-AuNP kolorimetriska analyser för ett mål / aptamer par. Ytterligare undersökningar av aptamer-sekvensen och strukturella effekter på förbättring av adsorberat aptamer kolorimetriska analyser är av stort intresse. Det finns ett behov av att förstå samspelet i samband med aptamer, mål och AuNPs. Denna kunskap kan leda till att skräddarsy aptamers för bättre funktionalitet och även förutsäga vilka aptamers kommer att vara aktiv i den adsorberade aptamer analysformatet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy	Bio-TEK	HT	Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized	Amresco	J848	Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate	Fisher	430767	Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98% any brand will work
DNA	IDT	Custom	DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml	VWR	10011-722	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol