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Biology

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

Der Entwurf und die Entwicklung eines Aptamers-Gold-Nanoteilchen kolorimetrischen Assay für den Nachweis kleiner Moleküle für in-the-Feldanwendungen untersucht. Zusätzlich wird ein Smart-Gerät farbmetrische Anwendung (App) wurde validiert und langfristige Lagerung des Tests wurde für den Einsatz auf dem Gebiet etabliert.

Abstract

Der Entwurf und die Entwicklung eines Aptamers-gold-Nanopartikel (AuNP) kolorimetrischer Assay zum Nachweis von kleinen Molekülen für Im-Feld-Anwendungen untersucht. Ziel selektive AuNP basierte Farb Assays wurden in kontrollierten Proof-of-Concept-Labor-Einstellungen entwickelt. Allerdings haben diese Systeme, die nicht auf einen Punkt des Scheiterns ausgeübt worden, um ihre praktische Anwendung über Labor-Einstellungen zu bestimmen. Diese Arbeit beschreibt einen generischen Ansatz zu entwerfen, zu entwickeln und zu beheben ein Aptamer-AuNP kolorimetrischen Test für kleine Molekül Analyten und mit dem Test für in-the-Feldeinstellungen. Der Test ist vorteilhaft, da adsorbiert Aptamere die Nanopartikeloberflächen zu passivieren und ein Mittel, zu reduzieren und falsch-positive Reaktionen auf Nicht-Ziel Analyten zu beseitigen. Transitioning dieses System praktische Anwendungen erforderlich definieren nicht nur die Haltbarkeit des Aptamers-AuNP Assay, aber Methoden und Verfahren zur Festlegung für die Langzeitlagerung capabil verlaufkeiten. Auch eine der anerkannten Bedenken kolorimetrische Anzeige ist die Belastung für Analysten platziert genau oft subtile Veränderungen in Farbe zu identifizieren. Zur Verringerung wurde die Verantwortung auf Analysten auf dem Feld, eine Farbanalyse-Protokoll entwickelt, um die Farbidentifikationsaufgaben, ohne die Notwendigkeit zur Durchführung dieser Aufgabe auf Laborqualität Ausrüstung durchzuführen. Das Verfahren zum Erzeugen und Testen der Datenanalyse-Protokoll beschrieben. Jedoch zu verstehen und das Design von adsorbiertem Aptamer-Assays beeinflussen, assoziiert die Interaktionen mit dem Aptamer, Ziel- und AuNPs bedürfen weiterer Untersuchungen. Die gewonnenen Erkenntnisse können dazu führen, Aptamere für eine verbesserte Funktionalität zu zuzuschneiden.

Introduction

Kolorimetrie ist eines der ältesten in der analytischen Chemie verwendeten Techniken. Für diese Technik wird eine qualitative oder quantitative Bestimmung des Analyten auf der Herstellung einer farbigen Verbindung 1 , hergestellt basiert. Typischerweise Farb Assays verwenden Reagentien, die eine Farbverschiebung in der Gegenwart der Analyt-Spezies auftreten, die im sichtbaren Lichtspektrum in einer beobachtbaren oder nachweisbare Farbänderung ergibt. Kolorimetrie wurde in der Detektion von Zielen von Atomen, Ionen und kleine Moleküle , um komplexe biologische Moleküle wie Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Peptide und Proteine ​​im Bereich von 2-4 verwendet. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Nanomaterialien auf dem Gebiet der Nachweisassays revolutioniert, insbesondere mit Farbbasierten Assays 5-6. Kombination hat zur Wiederaufleben führte die einzigartige chemische und physikalische Eigenschaften von Nanomaterialien mit einem Ziel-selektiven Erkennungselement, wie beispielsweise Antikörper, Aptamere Oligonukleotid oder Peptid Aptamere in das Design und die Entwicklung von kolorimetrischen Nachweisassays 7.

Metall-Nanopartikel haben eine nachgewiesene größenabhängige Farbänderung Eigenschaft, die bei der Gestaltung von zahlreichen farbmetrischen Assays genutzt wurde. Gold - Nanopartikel (AuNPs) sind von besonderem Interesse aufgrund einer markanten roten zu blauen Farbverschiebung, wenn die verteilte Lösung von Partikeln induziert wird 8 zu aggregieren, in der Regel durch die genaue Zugabe von Salz. Die Fähigkeit , den Übergang von der dispergierten (rot) zu steuern , um die aggregierten (blau) Zustände hat 2-4,9 für ionische, kleine molekulare, Peptid, Protein und zelluläre Ziele zur Schaffung von kolorimetrischen Sensoren geführt. Viele dieser Sensoren verwenden Aptamere als Zielerkennungsmotiv.

Aptamere sind DNA oder Ribonukleinsäure (RNA) Moleküle , die aus einem zufälligen Pool von 10 ausgewählten 12 -10 15 verschiedene Sequenzen 10-11. Der Auswahlprozess identifiziert Ziel reKognition Elemente mit Bindungsaffinitäten im niedrigen nanomolaren Regime und die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist die am häufigsten bekannte Verfahren 12-13. Vorteile von Oligonukleotid basierend Aptamere für Sensoranwendungen schließen die Leichtigkeit der Synthese, steuerbare chemische Modifikation und chemischer Stabilität 14-15.

Ein Ansatz, ein kolorimetrischer Test zur Schaffung kombiniert Nanomaterialien mit Erkennungselementen, besteht aus der Kombination dieser zwei Arten durch die physikalische Adsorption von DNA-Aptamer-Moleküle zu AuNP Oberflächen. Durch ziel Aptamerbindung erfährt das Aptamer eine strukturelle Veränderung 16-18, die die Interaktion des Aptamer mit der AuNP Oberfläche verändert, was zu einem induzierbaren rot nach blau mit dem Zusatz von Salz 19 Farbwiedergabe führt. Diese erstaunliche Eigenschaft AuNPs stellt eine beobachtbare kolorimetrischen Antwortmechanismus für Aptamer-basierte Geräte, die verwendet werden können, um deunterzeichnen kolorimetrische Assays für verschiedene Analyten.

Farbtests unter Verwendung von nicht-kovalente entworfen, physikalisch adsorbiert DNA-Aptameren auf AuNP Oberflächen haben das Stigma einer schwachen Sensorplattform ist aufgrund von Problemen mit Robustheit, eine Neigung zum Versagen außerhalb von kontrollierten Laboreinstellungen und den Mangel an Informationen für den Einsatz in der Praxis Einstellungen. Jedoch war die Aptamer-AuNP basierten kolorimetrischen Assay von Interesse wegen der Einfachheit des Betriebs und der beobachtbaren Farbreaktion. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein Protokoll für den Entwurf, die Entwicklung, den Betrieb, Reduzierung der Oberflächen falsch positive Reaktion im Zusammenhang zu liefern, und die langfristige Speicherung von DNA-AuNP basierten farbmetrischen Assays Kokain als Vertreter Analyten verwendet wird. Darüber hinaus haben wir vorgeschlagen , diese adsorbiert Aptamer - Assay - Ansatz (Abbildung 1) als vorteilhaft ist aufgrund der Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit , die in weniger Schritten als der herkömmliche Ansatz für diese Aptamer-AuNP ass geführtege. Für diesen Test wurde das Aptamer zuerst den AuNPs hinzugefügt, die für einen längeren Zeitraum an die Oberfläche adsorbieren gelassen wurden. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes war die Verringerung des Ansprechens auf die Nicht-Ziel Analytmoleküle bezogen auf AuNP Oberflächen-Wechselwirkungen. Jedoch war die Verringerung falsch positiver Reaktion auf Kosten der Empfindlichkeit des Assays. Daher ist eine Balance zwischen den Oberflächenschutz und Analyt Zugänglichkeit ist notwendig, geeignete Testfunktion aufrecht zu erhalten. Außerdem bedeutet ein großer Fehler zu analysieren Farbtests durch andere als mit Instrumentierung ist, dass die Ergebnisse sind oft subjektiv und auslegungs von Analyst-to-Analyst, vor allem wenn man versucht, feine Unterschiede in der Farbe zu unterscheiden. Umgekehrt gibt es eine Reihe von Problemen mit der Herstellung Labor basierte Instrumente verwendbar außerhalb des Labors, wie die Verfügbarkeit von Leistung, Funktionalität mit der Portabilität sind, usw. In dieser Arbeit wurde ein Farbanalyse - Protokoll wurde für mor entwickelte Portabilität und mit Farbe basierten Assay Interpretation 20-21 verbunden sind einige der Vermutungen häufig zu beseitigen. Im Vergleich zu früheren Ansätzen, strebte diese Bemühung, diese Tests, um ihre Grenzen zu gehen für Anwendungen, die über Labor-Einstellungen.

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Protocol

1. Synthese über Citrate Reduktion von Goldnanopartikeln (AuNP) und Charakterisierung

  1. Reinigen Sie einen Erlenmeyerkolben (500 ml) und großen Rührstab mit 5 ml konzentrierter Salpetersäure und 15 ml konzentrierter Salzsäure in der chemischen Schutzhaube.
    1. Befeuchten Sie die gesamte Oberfläche des Kolbens mit der Säure zu waschen, spülen Sie den Kolben mit Nuklease freiem Wasser und lassen Sie den Kolben zu trocknen.
  2. 100 ml 1 mM Gold (III) chlorid; Verwenden Sie ein Blatt aus Aluminiumfolie die Oberseite der Säure gereinigt Erlenmeyerkolben und Hitze unter ständigem Rühren auf einer heißen Platte zu bedecken bis zum Sieden.
  3. 10 ml 38,8 mM Natriumcitrat. Die Farbe wird von klar / grau zu ändern, zu dunkelblau / schwarz, und schließlich dunkelrot über mehrere Minuten. Fahren Sie mit der Hitze Rühren für 10 min ab.
  4. Lassen Sie die AuNP Suspension auf Raumtemperatur abkühlen und füge 110 & mgr; l Diethylpyrocarbonat (DEPC) unter kontinuierlichem Rühren.
  5. Decken Sie die ganze Flasche mitAluminiumfolie und lassen Sie die DEPC Behandlung über Nacht inkubiert. Speichern Sie alle AuNPs im Dunkeln, in Bernstein Lagerbehälter oder mit Aluminiumfolie abgedeckt.
  6. Autoclave die AuNP Suspension, auf Raumtemperatur abkühlen und filtriert durch ein 0,22 um Poren Celluloseacetat-Membran. Bewahren Sie die gefilterten, autoklaviert AuNP Stammlösung im Dunkeln bei 4 ° C.
    HINWEIS: Die Behandlung mit DEPC, Sterilisation über Autoklaven und Lagerung bei 4 ° C wird die Haltbarkeit des Aptamer-AuNP Assays zu verbessern. Lagerung auf diese Weise wird für den Assay ermöglichen mehr als 2 Monate funktionsfähig zu bleiben.
  7. Berechnen Sie die AuNP Konzentration von Ultra Violet-Vis - Absorption bei 520 nm zu erhalten, und verwenden Sie den Extinktionskoeffizienten (Ɛ) 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 mit Beerschen Gesetz durch Konzentrationsberechnungs (c). 10 nM zu sein mit einer Größe von 15 nm, bestimmt durch dynamische Lichtstreuung, die Konzentration wurde bestimmt.
    HINWEIS: Die Konzentrationen werden fr variierenom von Charge zu Charge. Verdünnen Sie die AuNP Aktien mit nukleasefreiem Wasser als notwendig, um die gewünschten 10 nM AuNP Suspension zu halten.

2. DNA-Aptamer, Puffer, Lösung, und Testvorbereitung

  1. Kauf oder synthetisieren die folgende Kokain Bindung Aptamersequenzen unter Verwendung von Standard - Phosphoramidit - Chemie 22:
    19 MN4: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
    19 MN6: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
  2. Reinige die Aptamere mit Standard - Entsalzung 23. Rekonstitution Oligonukleotide in Nuklease-freies Wasser bei entweder 100 & mgr; M oder 1 mM Stammlösungen. Aliquotieren und bei -20 ° C für mehrere Monate.
  3. Kauf oder bereiten Bestände sterile 1 M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) pH 7,4, 100 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2), 1 M Natriumchlorid (NaCl).
  4. Bereiten Sie 50 ml Puffer in nukleasefreiem Wasser witen Konzentrationen von 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,4 und bei Raumtemperatur lagern für Monate.
  5. Inkubieren der DNA mit dem Lager AuNP-Lösung (10 nM) für 3-4 h bei Raumtemperatur und Schutz vor Licht. Variiert das Volumen der AuNPs als genug Probe bereitzustellen für die Tests gewünschten (2,5-7,5 ml) durchgeführt werden.
    1. Hier verwenden Ladedichten von 90, 120, 150 und 180 DNA-Moleküle / AuNP in dieser Arbeit. entsprechend variieren die Lautstärke und die Konzentrationen der DNA. Tune die DNA-Abdeckung unbeabsichtigte AuNP Oberfläche im Zusammenhang mit Farbantworten von Nicht-Ziel-Analyten zu reduzieren.
      HINWEIS: Um die DNA-Abdeckung erhöhen, wird die Empfindlichkeit des Assays zu reduzieren. Die Ladedichten sind aus dem Wissen um die Konzentration des AuNP Lager berechnet, und die Gesamtzahl der AuNPs in dem Volumen für die Verwendung in Experimenten gewünschte Berechnung. Wenn die tatsächlichen Belegungsdichten gewünscht sind, existieren Protokolle diese Werte 7 zu erhalten. Die DNA Abdeckung wurde unter Verwendung eines 50 kDa m bestimmtMOLEKULARE Gewichts-Cutoff-Spin-Säule zu trennen die AuNP gebundene DNA aus der freien DNA. Die AuNPs sind zu groß, um durch die Spin-Säule zu passieren, während die freie DNA leicht passieren wird. gesammelt unter Verwendung von Absorptionsmessungen oder eine einzelsträngige DNA-Fluoreszenzfarbstoff ist der nächste Schritt die freie DNA zu quantifizieren.
  6. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,4 Puffer und legen Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln. Das Aptamer-AuNP Assay wurde in einer 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, pH 7,4 (Assaypuffer).

3. Salz Titration und Assay-Setup

  1. Bestimmen Sie die anfängliche Salzkonzentration benötigt, um die Assay-Farbreaktion durch Salz Titration mit dem Assay-Rohling zu induzieren. In 20 ul Methanol (leer) bis 180 & mgr; l-Aliquots von Aptamer-AuNP Assay in einer 96-Well-Platte. Daraufhin wird die Proben mit einem Volumen von Lager NaCl - Lösung zu erhöhen (1 M oder 2 M) und bestimmen den Äquivalenzpunkt (Abbildung 2 HINWEIS: Der Test kann, indem das Verhältnis von Methanol leer (oder gelöste Analyt) zu kleineren Volumina skaliert werden, um Aptamer-AuNP Test gleich.
    1. Hier bestimmen die NaCl Volumen benötigt die geringste Farbänderung durch visuelle Beobachtung zu verursachen. Die Ausgangskonzentration für den Assay betrug 75 mM und 130 mM für MN4 und MN6, die jeweils an einem 60-DNA-Molekül / AuNP Belegungsdichte.
      HINWEIS: Für eine quantitative Bestimmung für die anfängliche Salzkonzentration, der Mittelpunkt der Titrationskurve dient als guter Ausgangspunkt. Auch verwendeten Konzentrationen wird auf dem Aptamer variieren, DNA Belegungsdichten, von Tag zu Tag Leistung und von Charge zu Charge.
  2. Die Optimierung der Assay-Response, fügen Sie 20 ul von Analytmolekülen in Methanol zu 180 & mgr; l-Aliquots von Aptamer-AuNP Assay in einem gut 96 Platte bei Raumtemperatur verdünnt. Sofort im der NaCl-Konzentration im vorherigen Schritt bestimmt der Testfarbreaktion zu initiieren.
    NEINTE: Nutzen Sie eine Mehrkanalpipette gleichzeitig mehrere Experimente durchzuführen.
  3. Besorgen Sie sich die größten Farbwechsel möglich durch eine Erhöhung oder der NaCl-Konzentration abnimmt, und Vergleichen der Zielantwort auf die leere Antwort. Verwenden Sie die NaCl-Konzentration, die die größte Ansprechdifferenz zur Verfügung stellt.
  4. Beobachten oder die Assay-Response 150 sec folgende NaCl Zugabe zu messen. Analysieren Sie die Absorption bei 650 nm und 530 nm unter Verwendung eines Spektrometers oder einer Digitalkamera Foto des Assays Antwort erhalten (Abschnitt 4 für die Fotoanalyseprotokoll sehen).
    HINWEIS: Ein Mikrotiterplatten-Lesegerät wurde bei der Beschaffung der Messungen für diese Arbeit eingesetzt.
  5. Plotten die Ergebnisse als Verhältnis von Absorption bei 650 nm und 530 nm (E 650 / E 530) als Funktion der Analytkonzentration erhalten. Normalisieren der Assay Reaktion auf das Austastsignal wie wurde in dieser Arbeit geleistet.

4. Foto- und Digitalbild Farbanalyse Protokollanalyse

  1. preparE der Testproben, wie beschrieben (Abschnitte 3.2-3.3). Legen Sie die 96-Well-Platte auf einem Durchleuchtungs.
    ANMERKUNG: Eine Standard-Labordurchleuchtungs typischerweise zu hell ist verwendbar digitale Bilder für diese Analyse zu erhalten. Diese Trans verursachen regelmäßig "dunkle Linien" Abstand in dem digitalen Bild zu erscheinen aufgrund der Intensität der Lichtquelle. Einen Durchleuchtungs aus einer Leuchtdiode (LED) basierte Lichtkasten und ein Stück aus opakem Kunststoff funktioniert gut.
  2. Erhalten Sie Fotos von der 96-Well - Platte bei 150 sec nach NaCl hinaus importieren Sie die Bilder in der Bildanalyse - Software, und berechnen die durchschnittliche Rot, Grün und Blau (RGB) Werte, eine inkrementelle Lungstechnik verwendet, wie in Gleichung 1 24:
    (1) Gleichung 1
  3. Konvertieren Sie die RGB - Werte von Standard - RGB (sRGB) Farbraum in den Farbtafel (CIExyY) Farbraum unter Verwendung der folgenden Gleichungen 24:
    (2) Gleichung 2
    (3) Gleichung 3
    (4) Gleichung 4
  4. Wandeln die exponentielle RGB - Werte in lineare RGB - Werte unter Verwendung von Gleichung 2. Die Matrix in Gleichung 3 angegeben ist , verwendet , um die X, Y und Z - Werte des CIE - Farbraum 24 zu berechnen.
  5. Berechnen der x- und y - Farbwerte unter Verwendung der Gleichung 4 , die die Durchschnittsfarbe der Pixel in dem Bereich für die Analyse ausgewählt 24.
  6. Führen Sie die Analyse in jeder gut und zeichnen Sie die Farbwerte einer Eichkurve (Abbildung 4) zu erzeugen. Beziehen Sie die Standardfehler durch die Farbe der verschiedenen Bereiche der gleichen gut analysieren.

5. Einfrieren Aptamer-AuNP Assay für die Langzeitlagerung

  1. Bereiten Sie die Aptamer-AuNP Testkomponenten wie in den Abschnitten 2.4 und 2.5. Machen separate Lösungen, die 1 g / ml Trehalose und 1 g / ml Saccharose in Nuklease-freies Wasser, um die Cryogen-Lösung zu machen.
    HINWEIS: Hohe Konzentrationen von Trehalose und Saccharose wurden verwendet, um den Verdünnungsfaktor zu reduzieren, wenn der Test zum Einfrieren vorbereiten. Erhitzen Sie die Zuckerlösungen auf einer heißen Platte in einen Becher mit Wasser gründlich zu den Zucker vor Gebrauch auflösen.
  2. Bilden eine Lösung, die in einem Endvolumen von 200 & mgr; l in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 19,2 mg / ml Trehalose und 4,8 mg / ml Saccharose mit 60 MN4-DNA / AuNP Assay enthält. Endgültige Kryogen Lösungskonzentrationen werden mit DNA-Abdeckung variieren.
    HINWEIS: Die Proben werden eingefroren nicht mehr als 300 & mgr; l nicht überschreiten sollte. Größere Volumina können nicht richtig einfrieren.
  3. Flash die Proben einfrieren einen -146 ° C Gefrierschrank oder in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung eingefroren. Lagerung in einem -80 ° C oder -20 ° C einmal blinken Einfrieren abgeschlossen ist.
  4. Für diese Arbeit, lassen Sie die Proben in der -146 ° C Gefrierschrank überNacht und übertragen dann zu einem -20 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.
    HINWEIS: Flash Einfrieren kann bewirken, dass das Aptamer-AuNPs zu aggregieren. Testen der Integrität des Gefrierprozesses durch das Absorptionsprofil überwachen und an einen nicht gefrorenen Probe vergleicht. Wenn Aggregation beobachtet wird, erhöhen die Menge der kryogenen Lösung für dieses Problem zu kompensieren.
  5. Auftauen der Proben bei Raumtemperatur und verwenden nur genügend Proben für Experimente notwendig. Erhalten Absorptionsspektren von aufgetauten Proben und zu vergleichen, um die Basislinie Spektren einer nicht gefrorenen Kryogen Lösung behandelten Probe. Messen der Extinktion von 400 nm bis 700 nm.
  6. Führen Sie die Salz-Titration (Abschnitt 3.1), testen Sie den Test (Abschnitt 3.2), und zeichnen die Ergebnisse (Abschnitte 3.3 und 3.4), wie zuvor beschrieben.

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Representative Results

Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und die Stabilität und Robustheit von Aptamer für den Einsatz auf dem Gebiet anhand AuNP kolorimetrische Assays untersuchen. Wie in einer früheren Veröffentlichung markiert ist , zwei verschiedene Strategien für die Schaffung des Assays wurden 7 untersucht. Die Assays wurden die Free Aptamer-Assay und die adsorbierte Aptamer-Assay bezeichnet. Die adsorbierte Aptamer Assay wurde attraktiver für die Zwecke eines fieldable Detektionsassay (Abbildung 1).

Abbildung 1
. Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Adsorb Aptamer - Assay Das Aptamer wurde mit AuNPs gemischt und über Nacht inkubiert; Analytmoleküle in Methanol gelöst zur absorbierten Aptamer Assay zugegeben, unmittelbar gefolgt von der Zugabe von Natriumchlorid (NaCl) AuNP Aggregation zu induzieren, wenn das Ziel hinzugefügt.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Dies war aufgrund der Verringerung der falsch positiven Raten auf Nicht-Ziel-Analyten, relative Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit des Adsorb Aptamer-Assay. Zur Vorbereitung wurde das adsorbierte Aptamer-Assay, das DNA-Aptamer mit AuNPs gemischt und über Nacht in dem Testpuffer inkubiert. Dies erlaubt das Aptamer, um leicht auf der AuNP Oberfläche adsorbieren, was die Empfindlichkeit des Assays für falsche positive Reaktionen auf Nicht-Ziel-Analyt-Moleküle wie Maskieren oder Schneidmittel reduziert. Jedoch nur die vorgeformten Struktur des MN4 Kokain Aptamer wurde in Gegenwart von Kokain (Ziel) in diesem Assay-Design aktiv. Der Assay wurde durch Zugabe von Analytlösungen durch die sofortige Zugabe der geeigneten Konzentration von NaCl verwendet. Salzlösungen wurden verwendet, um die beobachtbaren und mea zu initiierensurable Farbänderung des Testsystems. Der Test wurde in 2-3 min ausgeführt. nach der Zugabe der Analytlösung.

Eine kritische Aktion in der Ausführung dieser physikalisch adsorbierten DNA basierten kolorimetrischen Assays ist die induzierte Farbreaktion durch die Zugabe der geeigneten Konzentration von Salz. Die Zugabe von Salzen sind bekannt AuNP Suspensionen wodurch die Aggregation der Teilchen durch Maskieren der negativen Ladungen der Citrat-Schicht, die die AuNPs stabilisieren, und dann verringert sich die interpartikulär elektrostatische Wechselwirkungen zu destabilisieren. Das Ergebnis ist der beobachtbare rot-to-blaue Farbe zu ändern. Der gleiche Effekt wird mit der DNA behandelten AuNPs beobachtet. Im Falle von DNA-Aptameren, Analyst der Konzentration des Salzes bestimmen, die notwendig geringe feststellbare AuNP Destabilisierung (Blaufärbung) zu verursachen. Mit dem Zusatz von Ziel wird die Stabilisierung der AuNPs durch die DNA-Aptamer signifikant resultierende reduzierte in einer Observable, messbare Ziel Dosis-Wirkungs-Farbwechsel. Diese Farbänderung kann nur durch die Zugabe des geeigneten vorbestimmten Salzmenge wahrgenommen werden.

Ebenso entscheidend ist der Prozess, in dem die entsprechende Salzkonzentration wurde bestimmt. Dies wurde durch Durchführen einer Titrationskurve erreicht durch Zugabe von steigenden Konzentrationen von Natriumchlorid - Lösung zu einer Reihe von Assay - Zuschnitten (Abbildung 2).

Figur 2
Abbildung 2. Salz-induzierte Titrationskurve. Citrate stabilisiert (rot), MN4 Kokain Bindung Aptamer (grün) und MN6 Kokain Bindung Aptamer (lila) behandelt AuNP Proben wurden mit Natriumchlorid (NaCl) titriert. Die ersten Salzkonzentrationen erhalten visuell wurden für jede Kurve mit entsprechenden farbigen Pfeilen gekennzeichnet. Die Fehlerbalken sind durch die Standardabweichung definiert inDreifachmessungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hierbei wird die anfängliche Salzkonzentration verwendet wurde, durch visuelle Untersuchung bestimmt und wurde getroffen, um die Salzkonzentration zu sein, der die geringste Blaufärbung beobachtet mit dem Assay Rohling verursacht. Doch für einen quantitativen Ansatz, neue Forscher auf diesem Gebiet der Forschung den Mittelpunkt der Titration Äquivalenzpunkt als Ausgangssalzkonzentration verwendet werden können. Über diesen Punkt beginnt die Farbreaktion schnell zu erhöhen. Weiterhin wurde die Salzkonzentration in der Durchführung des Assays verwendet, eingestellt, um den Farbunterschied zwischen den Testrohling und Kokain Reaktionen zu maximieren. Dies wurde durch Erhöhen und Verringern der Salzkonzentration aus der durch Titration ermittelten Betrag. Das Salz Titrationsprozedur wurde durchgeführt, täglicheinen Anteil von Tag zu Tag Variabilität des Assays. Die Batch - Variabilität in Salzkonzentration für den Assay erforderlich war nicht mehr als 20%. 2 hat drei verschiedene AuNP Proben, Citrat stabilisiertes (keine DNA), MN4 (DNA-Aptamer - stabilisiert) und MN6 (DNA-Aptamer - stabilisiert). Die DNA-Abdeckung für die MN4 und MN6 Proben wurden 60 DNA-Moleküle / AuNP und jede Titrierkurve hat eine andere Titration Äquivalenzpunkt und Mittelpunkt basierend auf der Ebene der Stabilität durch die Oberflächenbehandlung zur Verfügung gestellt. Citrate bot wenig Stabilität, MN4 (Doppelartige Struktur flexibel) mehr Stabilität zur Verfügung gestellt und MN6 (Einzelartige Struktur flexibel) vorgesehen, um die größte Stabilität der AuNPs. Die ersten Salzkonzentrationen in dieser Arbeit verwendet wurden, waren entschlossen, ~ 50 mM, ~ 90 mm, und ~ 130 mM visuell. Der Trend stimmt mit herkömmlichen Verständnis der DNA - Struktur und seine stabilisierende Wirkung auf AuNPs 24-25. Wenn diese Prüfung visuell durchgeführt wird, zeigte der Test Rohling einen leichten blauen colora tion mit den Salzkonzentrationen , wie in Abbildung 2 mit Pfeilen gekennzeichnet, die an den Mittelpunkten nahe sind , wie diskutiert. Die Salzkonzentrationen vor Thesen Punkte bieten wenig oder keine wahrnehmbare Farbveränderung, und jenseits dieser Punkte die Farb steigt rapide. Für diese Arbeit wurde die anfängliche Salzkonzentration visuell bestimmt und dann fein abgestimmt mit Mikroplatten-Reader Messvergleiche von Assay leer und Kokain Proben.

Mit dem kostenlosen Aptamer Assay Ansatz falsch positive Reaktionen waren ein Problem. Oberflächen - Wechselwirkungen von Analyt - Moleküle sind eine Quelle für dieses Problem, wie 7 in einer früheren Veröffentlichung beschrieben. Um die ungewollte Farbantworten aufgrund unspezifischer AuNP Oberflächen - Wechselwirkungen, die DNA Belegungsdichten der Zielbindungs ​​Aptamer verhindern gesteuert wurde (Abbildung 3).

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Abbildung 3. Adsorbed Aptamer Assayresonanz mit variierenden DNA Belegungsdichte. Aggregation Reaktion auf Kokain (rot, target), EME (grün, Kontrolle) und Procain (blau), ein AuNP oberflächenaktives Molekül, für die 90, 120, 150, und 180 DNA / AuNP Belegungsdichten wurden angezeigt. Alle untersuchten Proben wurden in Methanol bei 1 mg / ml gelöst. Die Fehlerbalken durch die Standardabweichung in drei Messungen definiert sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Im Allgemeinen wurde die falsche positive Ansprechrate von Nicht-Ziel-Analyt-Moleküle aufgrund AuNP Wechselwirkungen reduziert DNA Belegungsdichten mit zunehmendem. Jedoch wurde die Assay-Empfindlichkeit als Folge der erhöhten DNA Abdeckung verringert. In dieser Arbeit wurden DNA-Dichten von 60, 90, 120, 150, 180 und 300 DNA / AuNP waren Untersuted. Dichten von 60 und 300 wurden in früheren Arbeiten 7 ausführlich beschrieben. 3 stellt zusätzliche DNA - Dichten untersucht. Procain war einer der höher oberflächenaktiven Nicht-Ziel-Analyten befragt. Für jede der einzelnen DNA Bedeckungen wurde der Assay-Antwort durch Einstellen der Salzkonzentration, wie beschrieben maximiert. Im Allgemeinen, wie die DNA-Abdeckung zunimmt, wird die Reaktion Unterschied zwischen Kontrolle (EME) und Kokain Reaktion abnimmt. In ähnlicher Weise verringert sich die Assay-Response in Gegenwart von Procain, um Hintergrundwerte mit zunehmender Beschichtungsstärken. Die 180 DNA / AuNP Dichte eliminiert Oberfläche falsch positive Reaktion für Procain zusammen, während eine hohe Zielantwort erhalten bleibt. Diese Einschätzung wird ein Verfahren beschrieben, diese Farb Assays zur Abstimmung für die Oberflächen im Zusammenhang mit falschen positiven Reaktionen zu reduzieren, während Zielantwort zu erhalten, so viel wie möglich. Verbesserte Empfindlichkeiten können durch die Reduktion von DNA Abdeckung erreicht werden. Doch falsch positive Antworten könnte ein Problem je nach Anwendung werden.

Kolorimetrische Assays sind für die schnelle, einfache oft vermutliche qualitative und auch quantitative Tests verwendet. Häufige Probleme mit kolorimetrischen Bestimmungen sind die subjektive Natur der Farbunterscheidungsvermögen, vor allem mit subtilen und Borderline-Farbunterschiede. Das Urteil Anrufe, die vom Analysten vorgenommen werden müssen, können zu einer Fehlinterpretation der Daten zur Folge haben. Messungen an Laborgeräte verringern die Unsicherheit und Unentschlossenheit im Zusammenhang mit der Untersuchungsergebnisse zu bewerten. Doch in dieser Arbeit war es die Absicht, ein Feld bereit Assay bereitzustellen, die sofortige Ergebnisse zu den Analytiker zur Verfügung gestellt. Als solches wurde ein Foto - Bildanalyse - Technik etabliert , die eine entschiedenere Farbergebnis (Abbildung 4) zur Verfügung gestellt.

Abbildung 4
Figur 4. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Mit steigenden Konzentrationen von Kokain, führte der Assay Farbe in zunehmendem blaue Farbe. Digitale Fotos von Kalibrierungskurven wurden unter Verwendung von zwei verschiedenen Smartphones erhalten und zu einem Standard-Laptop-Computer importiert für die Analyse mit ImageJ Software. Die Farbwerte wurden verwendet, um die c plottenalibration Kurven wie in Figur 4 gezeigt. Die Bildanalyse eine lineare Reaktion auf zunehmende cocaine Konzentration mit beiden Sätzen von Smartphone Bilder bereitgestellt , wie durch die R 2 Werte angegeben. Diese Methode wurde auf ein Smart-Device-App übergegangen, den Analytiker auf dem Gebiet zu unterstützen. Eine detaillierte Auswertung der App wurde in einer früheren Publikation 7 durchgeführt. Die App eliminiert viel von der Unsicherheit und Unentschlossenheit im Zusammenhang mit subtilen Farbänderung Ergebnisse der niedrigsten Kokain-Konzentrationen.

Langzeitlagerung von physikalisch adsorbiert DNA-Assays dieser Art wurden im Detail untersucht und eines der Ziele dieser Arbeit nicht war Bedingungen finden, um den Test Haltbarkeit zu verlängern. Behandlung der Testkomponenten zur Lagerung bei 4 ° C wurde in einer früheren Veröffentlichung 6 beschrieben. Für diese Arbeit Lyophilisation der vorbereiteten Testkomponenten wurde für die langfristige Nutzung und Lagerung o betrachtetf den Test. Lyophilisieren der Assaykomponenten hat den deutlichen Vorteil zu halten, und die Proben bei Umgebungstemperatur zu speichern, die die Notwendigkeit für einen Kühlschrank oder Gefrierschrank beseitigen würde. Der erste Schritt in der Gefriertrocknungsprozess ist es, zuerst die Probe einzufrieren. Um zu überprüfen, führen die AuNP Proben den Gefrierprozess überleben, einen Vergleich der Absorptionsspektren des Tests vor, dass der aufgetauten Probe gefriert. Die Scans sollten genau übereinstimmen. Wenn die Proben der Gefrierprozess nicht überleben, das aufgetaute Probenspektrum Absorption in der Region haben über 525 nm erhöht. Dies zeigt an, dass die AuNPs während des Gefrierens und die aufgetaute Probe beeinträchtigt wird aggregiert. Die Lebensfähigkeit der aufgetauten Assay wurde mit Kokain und EME (Abbildung 5) getestet.

Abbildung 5
Abbildung 5. Adsorb Aptamer Assay Antwort Haltbarkeit Studie. Quantification von der Test als Reaktion auf EME (grün, Kontrolle) und Kokain (rot, Ziel) durchgeführt, mit eingefroren und anschließend während eines Zeitraums von 4 Wochen Adsorbed Aptamer Assay Proben aufgetaut. Die Fehlerbalken durch die Standardabweichung in drei Messungen definiert sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die aufgetauten Assay Leerproben blieb auf dem gleichen Wert im Verlauf der Studie als Proben, die gemacht wurden und sofort verwendet (keine Lagerung). Die Antworten der Kokain und EME-Proben wurden im Einklang mit den typischen Reaktionen mit Proben beobachtet gemacht und sofort verwendet (keine Lagerung). Die gefrorenen Proben wurden für die Dauer von 4 Wochen ohne Änderung der Assayleistung überwacht , wie bei 4 ° C über den gleichen Zeitraum 7 oder Assayproben hergestellt und verwendet immediatel gespeicherten Proben verglicheny. Kokain - Antworten waren relativ konstant während der vier Wochen, die auch für die 4 ° C Proben 7 beobachtet wurde. Der Rückgang der EME-Signal von Woche 1 bis Woche 2 wird oft mit Raumtemperatur und 4 ° C Lagerung sowie beobachtet. Ein Phänomen zugeschrieben wir Reifung des Assays in der ersten Woche. Dieser Ansatz erweitert die verfügbaren Optionen für die Langzeitlagerung der adsorbierten DNA kolorimetrische Assays und lieferte ein Tor zu zusätzlichen langfristigen Speicheroptionen, nämlich Lyophilisation.

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Discussion

Im Laufe der letzten zehn Jahre Nanopartikel basierend kolorimetrischen Assays 2-4 zum Nachweis von Targets umfassen kleine Moleküle, DNA, Proteine ​​und Zellen entwickelt worden. Die Tests, die DNA-Aptamere mit Nanopartikeln verwenden wurden gewinnen Interesse. Typischerweise werden diese kolorimetrische Assays durch Mischen der DNA-Aptamer mit Analytmoleküle durch Zugabe zu AuNPs 9-10 gefolgt durchgeführt. Allerdings haben diese Tests wurden in Proof-of-Concept-Demonstrationen mit kontrollierten Laborbedingungen und mit begrenzten, ausgewählten Steuerelemente verwendet. Die jüngsten Fortschritte dieser Technologie in das Feld für den Übergang gemacht haben 7 worden. Bei diesem Ansatz wurde die DNA-Aptamers an AuNP adsorbierten Oberflächen vor der Zugabe der Analytmoleküle getestet werden (Abbildung 1). Die Entwicklung von entweder Aptamer-Gold-Nanopartikel auf Basis kolorimetrische Assays erfordert Optimierung in verschiedenen Stadien der Fertigung / Analyseprozess. Damit diejenigen, die mit der Scheibeipline muss mit Raffinierung assoziiert der Nuancen bewusst sein und diese Assays zur Fehlerbehebung erfolgreich sein.

Die adsorbierten Aptamer-Gold-Nanopartikel-Assays erfordern eine sorgfältige Optimierung für jeden Aptamer / Ziel-Paar. Doch hier bietet die Schritte folgende erläutert eine konsistente Protokoll Optimierung dieser farbmetrischen Assays durchzuführen. Die Bestimmung und Einstellung der Salzkonzentration , die zwischen dem Ziel und Assay - Rohling in der maximalen beobachtbare oder messbare Farbänderung resultiert , ist eine der kritischen Optimierungsschritte (Abbildungen 2 und 3). Für einige Aptamer / Zielpaare haben wir beobachtet , dass die Verwendung von hohen Salzkonzentrationen in der Nähe der Endpunkt der Titrationskurve haben in einem blau-to-roten Farbverschiebung 18 geführt. Dies weist auf eine Stabilisierung der AuNPs durch die Aptamer bei der Zugabe des Ziels und Salz.

Andere Faktoren, die die Test pe beeinflussen könntenrformance umfassen Pufferkomponenten und Konzentrationen, die Menge an DNA-Aptamer-Abdeckung, verwendeten Lösungsmittel, der Temperatur, Aptamer Sequenz und Struktur, target-assay Inkubationszeit (Zeit, als Ziel zu dem Assay zugegeben wird, vor der Salzzugabe) und die Farbentwicklungszeit ( benötigte Zeit für die Farbe nach der Salzzugabe zu entwickeln). Eine 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2 pH 7,4 Puffer war der Assay Puffer der Wahl in vielen der Ziel / Aptamer - Paare in unserer Arbeit verwendet. Jedoch kann dieser Puffer nicht für alle Aptamere ideal. Zu erhalten, die richtige Faltung des Aptamers, müssen die Assaypufferkomponenten können angepasst werden, und hielt so nahe wie möglich zu der Zusammensetzung verwendet in dem Aptamer Selektionspuffer. Wenn ein Puffer mit AuNPs verwendet wird, müssen die Pufferkomponenten und Konzentrationen in Betracht gezogen werden, insbesondere bei ionischen Substanzen. Hohe Konzentrationen an ionischen Verbindungen könnte vorzeitige Aggregation der AuNPs verursachen. DNA / AuNP Abdeckung wurde in Abbildung 3 gezeigt. Da die DNAAbdeckung erhöht sich von 90 bis 180 DNA / AuNP verringerte sich die Zielanalyten Reaktion reduziert die Empfindlichkeit des Assays führt. Daher ist ein Kompromiß erforderlich, der auf jeder Aptamer abhängt, aufgrund seiner besonderen Faltung und der Grad der Wechselwirkung mit dem AuNP Oberfläche.

Zusätzlich Lösungsmittel benötigt Analyt-Moleküle auflösen kann unbeabsichtigte Aggregation der AuNPs führen. Wasser, Testpuffer und Methanol wurden alle ohne Probleme verwendet. Verwendet, ohne Verdünnung, Acetonitril und Dimethylsulfoxid (DMSO) adsorbiert an die Oberfläche verursacht AuNP unbeabsichtigte Aggregation. Acetonitril war problematisch, selbst in Verdünnungen von weniger als 1% (Endvolumen). Lösungsmittel sollten mit AuNPs vor der Verwendung mit dem kolorimetrischen Assay getestet werden. Die Temperatur, bei der der Assay durchgeführt wird, kann einen Einfluss darauf haben, ob eine Antwort mit dem Test beobachtet wird. Dies hat mehr mit dem Aptamer Struktur und Schmelztemperatur oder die Stabilität des Aptamers Struktur bei einer gegebenen Temperatur zu tun, alsmit den Nanopartikeln. In unserer Arbeit haben wir festgestellt, dass es zwischen mit dem Aptamer in einer vorgeformten Struktur mit der DNA in einer gefalteten Form, und auch nicht vollständig in einer einsträngigen Struktur ein empfindliches Gleichgewicht ist. Dies ist der Fall für die adsorbierte Aptamer - Assay Form dieser kolorimetrische Assays (Abbildung 1). Wenn man bedenkt Struktur muss die Aptamersequenz auch in Betracht gezogen werden, da ein Großteil der Aptamer-Struktur das Ergebnis der einzelnen Oligonucleotidsequenzen ist. Doch weitere Untersuchungen zu diesem Aspekt ist erforderlich.

Im Allgemeinen ist der Ansatz, den wir bei der Entwicklung eines Aptamer-AuNP basierten kolorimetrischen Assay verwenden, ist das gleiche für alle Aptamer / Ziel-Paare. Zuerst ein Aptamer für ein Ziel von Interesse erhalten. Dies kann durch Durchsuchen der Literatur oder die Auswahl eines Aptamer für ein Molekül von Interesse erreicht werden. In dieser Phase gibt es keine Möglichkeit zu wissen, ob das Aptamer ein guter Kandidat ist eine kolorimetrische zum ErstellenTest. Dies kann nur durch Versuche bestimmt werden. Als nächstes wird die Aptamer mit AuNPs über Nacht inkubiert , um das adsorbierte Aptamer - Assay (Figur 1) herzustellen. Der Standardansatz ist mit 60 Aptamere / AuNP beginnen zu testen; jedoch werden mehrere Bedeckungen für die nächste Stufe der Prüfung vorbereitet. Wenn die Tests zum Testen bereit sind, führen Sie die Titrationskurve Untersuchungen , wie beschrieben (Abbildung 2). Der Mittelpunkt der Titrationskurve dient als zuverlässige Salzkonzentration ausgehend für das Ziel, Assay leer und Kontrolltests verwendet werden. Die Salzkonzentration wird feinabgestimmt eine maximale Farbdifferenz zwischen dem Ziel und Assay-Leerproben zur Verfügung zu stellen. Um zu testen, die Antwort ist real und durch Aptamer-Ziel-Bindung und nicht aufgrund von nicht-spezifischen Ziel / Lösungsmittel-Wechselwirkungen, führen Sie den Test mit den Kontrollen. Gleichzeitig werden Testfarbentwicklungszeiten bei 5-Minuten-Intervallen untersucht. Gefolgt von Ziel-Assay Inkubationszeiten bei 5 min intervals zunächst 15+ min Inkubationszeiten verwendet werden, bis dieser Schritt optimiert wird. Je nach den Ergebnissen, eine weitere Optimierung der Salzkonzentration, Aptamer Abdeckung, Inkubationszeit und Farbentwicklungszeit kann erforderlich sein (Abbildung 3). Dieser Ansatz beschreibt ein Protokoll für die Konstruktion und Entwicklung von Aptamer-AuNP kolorimetrische Assays für ein Ziel / Aptamer-Paar. Weitere Untersuchungen in die Aptamersequenz und strukturelle Auswirkungen auf die Verbesserung der adsorbierten Aptamer kolorimetrische Assays sind von großem Interesse. Es besteht ein Bedarf, die Wechselwirkungen zu verstehen, die mit den Aptamer, Ziel- und AuNPs. Dieses Wissen könnte dazu führen, Aptamere für eine bessere Funktionalität zu Schneiderei und auch die Vorhersage, welche Aptamere im adsorbierten Aptamer-Testformat aktiv.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

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References

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Biochemie Ausgabe 112 kolorimetrischer Test Gold-Nanopartikel Aptamer kolorimetrischen app Nukleinsäuren Nanotechnologie Biosensoren optische Sensoren
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Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

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