Summary
En enkel metode for å etablere primær human placenta (villøse) og Deciduale organkulturer, er beskrevet. Villous og Deciduale orgel kulturer er uvurderlig verktøy for å studere patogenesen ved den menneskelige mor til foster grensesnitt. Infeksjon med fakultative intracellulære bakterien Listeria monocytogenes er demonstrert.
Abstract
Morkaken viser en stor grad av arts anatomisk variasjon. For å best forstå biologi og patofysiologien av human placenta, er det viktig å utforme eksperimenter med humane celler og vev. En fordel med organkultur er vedlikehold av tre-dimensjonale (3D) strukturell organisasjon og ekstracellulær matriks. Målet med metoden som beskrives her er vellykket etablering av ex vivo menneskesvangerskaps vev orgel kulturer og deres sunn kultur vedlikehold for 72-96 timer. Protokollen beskriver umiddelbar behandling av forsknings samtykket, placenta og Deciduale prøver frisk fra operasjonssalen. Dette er rikelig prøver som ellers ville bli forkastet. Detaljerte instruksjoner om den sterile innsamling av disse prøvene, inkludert morfologiske detaljer om hvordan du velger riktig vev for å etablere 3D organkulturer, er gitt. Placenta villous og Deciduale vev er microdissected inn 2-3 mm 3 stykkerog plassert separat på matrise linjert Transwell filtre og dyrket i flere dager. Villøse og Deciduale orgel kulturer er godt egnet for studiet av menneskelig host-patogen interaksjoner. I forhold til andre modellorganismer, er disse humane kulturer er spesielt fordelaktig å undersøke mekanismen for infeksjon av patogener som demonstrerer varierende mønstre av vertsspesifisitet. Som et eksempel viser vi infeksjon av placenta og Deciduale organkulturer med klinisk relevante, fakultative intracellulære bakterier patogene Listeria monocytogenes.
Introduction
Infeksjon og betennelse på maternal-føtal grensesnitt representerer en viktig kilde til sykelighet og dødelighet hos kvinner og barn. Å forstå hvordan patogener infisere disse vevene er kritisk for utvikling av nye strategier for å forebygge og behandle sykdommer slik som for tidlig fødsel og fosterdød. Men høye artsvariasjon av morens-føtal grensesnitt kompliserer eksperimentell undersøkelse. Videre mest mikrobielle patogener vise vertsspesifisitet, kan dermed mange dyremodeller ikke fullt rekapitulere menneskelige smittsomme sykdommer. Visse organismer (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholera, og mange andre) er strengt patogene i mennesker, mens andre, slik som Listeria monocytogenes, viser en mer middels nivå av vertsspesifisitet 1. Vertsspesifisitet er dokumentert i mange aspekter av patogenesen, inkludert kolonisering 2, formidling tre, immununndragelser 4 fem. Således er det av største viktighet for å velge optimale vert modellsystemer.
Består av føtale celler og mors blod, er placenta et organ som raskt utvikler seg i løpet av svangerskapet 6. I enkleste form, er den menneskelige placenta konstruert av føtale "villous" trelignende strukturer badet i mors blod. Gass og næringsutveksling skjer på tvers spesialiserte foster cellelag kalles trophoblasts som linje overflaten av villous trær. Morens livmor slimhinnene, kalt endometrium i den ikke-gravid kvinne, forvandler strukturelt og funksjonelt inn i decidua å imøtekomme den fetoplacental enhet. Villous trær er forankret i livmoren ved extravillous trophoblasts (EVT) som vandrer fra forankring celle kolonner i decidua. Den maternal-føtal grensesnitt, består derfor av decidua og morkaken.
Orgelet kultur teknikken beskrevet herhar vært brukt for å undersøke hvor og hvordan klinisk relevante humane patogener, inkludert L. monocytogene s og Toxoplasma gondii, krysser placentabarrieren 2,7. Disse ex vivo orgel kulturer replikere in vivo vev arkitektur, og er uten tvil fysiologisk svært relevante modellsystemer for mennesker placentation. Andre kultur teknikker inkluderer orgel explants hele, orgel skiver, og vev eller stamcelle organoids innebygd i 3D-matrix. For detaljer om disse alternativene, henvises det til en omfattende Nyeste anmeldelse 8. Vær oppmerksom på at denne protokollen er for egen kultur decidua og placenta villi. For å studere interaksjonen mellom celler og placenta uterusslimhinneceller, kan et ko-kultur teknikk være foretrukket. Vi henviser interesserte leser til tidligere beskrevet villøse-decidual co-kultur teknikk, som brukes av forskere som studerer trophoblast-mediert decidual vaskulær remodelle 9-11.
Protocol
Forsøkene ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of California, San Francisco (CHR # 11-05530). Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse. Tissue ble samlet som avidentifiserte prøver.
MERK: Forskeren må innhente godkjenning fra sine institusjonelle mennesker Review Board. Utelukkelsen av prøver basert på svangerskaps historie eller placenta anomalier vil variere i henhold til behovene til en bestemt studie.
MERK: Passende sikkerhetsmessige forhold (biosikkerhet nivå 2) bør benyttes for alle trinnene i denne protokollen 12.
1. Forberedelse, før Collection Day
- Autoclave siler / tang for innsamling og saks / tang for mikro-disseksjon.
- Forbered tilstrekkelig volum (500 ml per eksemplar) av vaskebuffer (refer til tabell 1 for oppskrift).
- Forbered tilstrekkelig volum (100 ml per eksemplar) av 0,22 mikrometer sterilfiltrert Collection media (se Tabell 1 for oppskrift).
- Delmengde ekstracellulær matriks (ECM, se tabell av reagenser for detaljer) for langtidslagring.
- Oppbevares ECM i fast form ved -20 ° C. For best ytelse, unngå gjentakelse fryse tine. Tine flaske til en viskøs oppløsning ved 4 ° C, og forberede 300 mL alikvoter i kjølerommet med kjølt pipettespissene. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
2. Innsamling av Fresh Tissue
FORSIKTIG: Når du arbeider med fersk menneskelig vev, må forskerne følge godkjente forholdsregler (OSHA) for å hindre overføring av blodbårne patogener, og må ha fått skikkelig institusjonell opplæring. Riktig personlig verneutstyr, inkludert hansker, vernebriller og lab strøk er nødvendig.
- Transportereautoklaveres-siler (ett per eksemplar), autoklaveres-tang, vaskebuffer (carboy), Collection medie (25 ml per eksemplar i en 50 ml konisk rør), sprayflaske, 10% blekemiddel, 70% etanol, vev samling skuffen, sharpie og is bøtte / kjøler til sykehus / klinikk.
MERK: Prøver mottas i et forsknings utpekt plass plassert i et rom i nærheten operasjonssalen. En steril vevskultur panseret er ikke nødvendig, men samlingen bør skje massedrap og forskeren bør hensiktsmessig desinfisere overflater, som beskrevet nedenfor. - Place carboy vaskebuffer ved siden av vasken, og spray spigot med 10% blekemiddel og 70% etanol. Plasser glassfiberduk samling skuffen på lyskilden (lys pad eller lyskasse), og rense med 10% blekemiddel og 70% etanol. La det lufttørke.
- Har kliniker bære prøver fra operasjonssalen til prøven forberedelse rommet. På vasken, hell prøven oppå steril håndholdt sil, skyll vev flere ganger varh buffer, og overføre hele prøven i buffer for å renses glass skuffen oppå lyskilde.
MERK: Vurdering av vev av klinikeren er av høyeste prioritet, og dermed følgende trinn kun utføres etter at legen har verbalt uttrykk for at han / hun er ferdig med evalueringen. - Bruk steril tang til å velge placenta villi og decidua (figur 2A og 3A) for innsamling og overføring for å skille 50 ml koniske rør. Merk rørene med svangerskapslengde.
MERK: Foretrukket svangerskaps aldre er mindre enn 9 uker og mindre enn 16 uker for placenta og decidua, henholdsvis. Ved institusjonen, er bare en brøkdel av hver prøve anskaffet for forskningsformål, som tilstrekkelig vev må forbli for klinisk patologisk diagnose. - Lagre og transport prøven på is til forskningslaboratorium.
- For å samle inn mer enn ett eksemplar, rense glassbrettet som beskrevet ovenfor med 10% blekemiddel og 70% etanol mellom colleDette skjer for hver prøve.
3. Utarbeidelse av Organ kulturplater
MERK: Følgende trinn skal utføres ved hjelp av steril teknikk i en vev kultur hette. Det er ideelt for å dissekere mikroskop for å bli plassert i et sterilt felt. Dette er imidlertid ikke absolutt nødvendig så lenge mikro disseksjonen utføres raskt under, og instrumentene er dyppet ofte i 70% etanol.
- Tine ECM hetteglass (er) på is. Fortynne ECM 1: 1 med iskalde Collection media, bland ved pipettering. Pipette langsomt for å unngå innføring av luftbobler. Hver brønn i en 6-brønners vevskulturplate krever 100 ul av denne suspensjonen, og vil romme 3-4 organkulturer.
- Transwell Place innsatser (porestørrelse 0,4 um) i hver brønn av seks-brønners vevskulturplate.
- Belegge hver Transwell sette inn med et tynt lag (100 ul) av ECM / media suspensjon.
- Sett platen på is og umiddelbart videre til establishment organkulturer. Alternativt forberede plate før vev samling, og da brytes det i para-film og oppbevares ved 4 ° C for senere bruk. Lagring lenger enn seks timer er ikke anbefalt som ECM vil tørke ut.
4. Etablering av Organ kulturer
MERK: Dette trinnet beskriver hvordan du plasserer Deciduale organkulturer og villous organkulturer i egne transwells. Vevet ikke er i kontakt. Forskere er interessert i en co-kultur teknikk der decidua og villi er i direkte kontakt med hverandre, kan referere til tidligere litteratur 9,10.
- Skyll prøver to ganger i Collection media, og sentrifuger ved 1000 xg mellom hver gang. Overfør vev til en steril petriskål og plass på scenen av en dissekere mikroskop. Hold 6-brønns plate på is ved siden av mikroskopet.
- Micro-dissekere vev med sterile springer dissekere saks og pinsett, for å etablere 2-3 mm kultur villøse organs (figur 2A).
MERK: villøse organkulturer er små, godt vaskularisert "trær" med 2 eller 3 avdelinger, og med fremtredende extravillous trophoblast (EVT) celle kolonner 11. Det er viktig å utnytte bare villøse vev fra <9 ukers første trimester prøver, så invasjon av extravillous trophoblasts inn ECM er mest uttalt på disse unge alderen 13. - Velg godt vaskularisert villi med fremtredende EVT celle kolonner. EVT celle kolonner er visualisert som oppsvulmede, "uklar", "myke" endene (se pilspisser i figur 2A).
- Bruk steril tang til å overføre 3 eller 4 villous trær i hver transwell. Juster grener så treet er plassert flatt på toppen av ECM og separate klumpet seg grener.
- Micro-dissekere decidual vev med sterile springer dissekere saks og pinsett, for å etablere 3 mm 3 Deciduale organkulturer (figur 3A).
MERK: Prøver inneholde to distinct typer Deciduale vev, decidua parietalis og decidua capsularis (venstre og høyre vev fragmenter, henholdsvis figur 3A). - Trim med saks for å lage 3 mm 3 stykker av decidua parietalis. Decidua capsularis er ikke brukt for disse kulturene. Bruk pinsett til å erte bort levret mors blod.
- Bruk steril tang til å overføre 3-4 stykker av decidua i hver transwell.
- Legg 1 ml Collection media til bunnen av brønnen. Inkuber platen over natten ved 37 ° C i 5% CO2
- For eksperimenter hvor det er viktig å etterligne normal første trimester placenta oksygentensjon, opprettholde villous organkulturer i relative hypoksi (3% O 2).
MERK: Laboratorie alternativene inkluderer små hypoksi inkubator kamre som passer inni eksisterende inkubatorer, eller en tri-gass inkubator som introduserer ekstern N2 gass til lavere oksygenkonsentrasjon. - Tilsett 1 ml villøse eller decidual medium (Table 1) til toppen av transwell etter 12-16 timer av kultur.
MERK: Fraværet av media i løpet av den første natten i kultur gjør at extravillous trophoblast celle kolonner for å invadere (villøse kultur), og for vevet (både villøse og decidual) til å bli ordentlig integrert i ECM. I vår erfaring, Deciduale organkulturer være levedyktig i 72 timer og villøse orgel kulturer for 96 timer. Vi anbefaler eksperimentelle endepunkter som faller innenfor denne tidsrammen. Se tabell 1 for sammensetning av villøse og decidual medium. Villøse medium har en høy prosentandel av FBS, mens decidual medium er supplert med graviditet hormoner (progesteron, 17p-estradiol) som opprettholder den decidualized tilstand (tabell 1).
5. Utarbeidelse av L. monocytogenes kulturer
MERK: For detaljert protokoll på langtidslagring av L. monocytogenes, og kulturen og vekst av this organisme i Brain Heart Infusion (BHI) og agar, se Wang et al. 14
- Plukk en enkelt L. monocytogenes kolonien fra stripete BHI agar plate og vaksinere 3 ml BHI kraft.
- Inkuber L. monocytogenes kultur over natten (16 timer), i en skrå stilling, ved 30 ° C.
MERK:. Disse kultur forholdene tillater bakterievekst å nå stasjonær fase L. monocytogenes er flagellert ved 30 ° C, noe som øker vertscellen invasjon 15.
6. Infeksjon av Organ kulturer med L. monocytogenes
- Varm PBS og villøse eller decidual medium (tabell 1) til 37 ° C.
- Bruk sterile pinsetter for å fjerne eventuelle organ kultur stykker som ikke invaderer inn i ECM, og er derfor flytende i brønnen.
- Nøye aspirer media fra bunnen av transwell. Skyll øvre og nedre transwells to ganger ved forsiktig pipettering 1 ml av krigm PBS inn i brønnen, og omhyggelig aspirere i mellom. Forsiktig pipette 1 ml antibiotika-free villøse eller decidual media til øvre og nedre transwell. Vær forsiktig med å forstyrre organ kultur.
- La vevet inkuberes i antibiotika-fritt medium i minst en time for å sikre at antibiotika har blitt fjernet.
MERK: Ved stasjonær fase tettheten av L. monocytogenes kultur er ca 1 x 10 9 kolonidannende enheter (CFU) per ml. Antallet av bakterier som brukes til å infisere organkulturer skal bestemmes empirisk for å møte eksperimentelle behov. - For villtype L. monocytogenes rutinesmitteforsøk viser robust invasjon med en 1:50 fortynning av natten (4 x 10 7 L. monocytogenes i 1 ml medium per brønn). Resuspender riktig antall bakterier i antibiotika-free villøse eller decidual medium.
- Sug media fra toppen av transwells. Tilsett 1 ml av podestoff. Inkuber platene ved 37° C i 5% CO2 for å muliggjøre bakteriell invasjon.
- Fjern ekstracellulære bakterier ved å aspirere media fra øvre og nedre transwells. Skyll brønner to ganger med varm PBS. Tilsett 1 ml villøse eller Deciduale media supplert med 50 mikrogram ml -1 Gentamicin. Inkuber platene ved 37 ° C i 5% CO2.
MERK: L. monocytogenes er en fakultativ intracellulær bakterie som kan vokse i ekstracellulært medium, vokser inne i cellene, og spre seg fra celle-til-celle uten å gå til det ekstracellulære rom. Gentamicin har en bakteriedrepende effekt på ekstracellulære L. monocytogenes, og således tillater måling av intracellulært L. monocytogenes vekst og spres gjennom orgelet kultur 16.
MERK: Reproduserbar L. monocytogenes infeksjon av villous og decidua organkulturer oppstår med 5 timers inkubasjon ganger. Inkubasjonstiden før tilsetningen av gentamicin kan modifiseres basert på eksperimentelle behov og ability av organismen for å invadere vevet. For bedre å forstå de anatomiske områder mest utsatt for smitte, kan kortere inkubasjonstid brukes to. - Opprettholde skålene ved 37 ° C i 5% CO2 i løpet av forsøket. Endre hele media i hver brønn daglig.
MERK: I vår erfaring, L. monocytogenes -infected Deciduale organkulturer være levedyktig i 48 timer og villøse organkulturer i 72 timer.
7. Harvest of Organ kulturer for Histopatologi
- Fremstille en frisk oppløsning av 4% paraformaldehyd ved å fortynne 10 ml av en 16% lager ampulle i 30 ml PBS. Store 4% paraformaldehyde ved 4 ° C, beskyttet mot lys, og bruk innen en uke. Bring til romtemperatur før bruk.
- Sug media fra øvre og nedre transwell. Forsiktig rens brønnene to ganger med PBS ved romtemperatur. Tilsett 1 ml 4% paraformaldehyde til toppen transwell til å dekke organ kultur.
- Inkuberi 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 20 min. Unngå lengre inkubasjonstider da dette kan føre til overfiksering av vevet.
- Aspirer paraformaldehyd og rens brønnene to ganger med PBS ved romtemperatur. Embed de faste kulturer orgel i oktober medium, fryse, og avsnittet om en cryostat ( "fast frosset"). Generelt er fast frosset vev lettere å seksjon enn frosne vev uten forutgående fiksering.
MERK: For fullstendige protokollen på oktober innebygging og frossen seksjonering, kan du få tilgang til relevante deler fra publiserte protokoller 17,18. Avhengig av eksperimentelle behov og tilgjengelig laboratorieutstyr og lagring, kan vevet i stedet være parafin-embedded og delt på en mikrotom 19. - Videre forberede vev lysbilder for rutine Hematoxylin & eosin farging, immunfluorescens eller immunhistokjemi 18,20,21.
Representative Results
Figur 1 (modifisert fra Zeldovich & Bakardjiev 22) diagrammer relevant placenta og livmor anatomi. Figur 2 viser representative brutto og histologiske bilder av morkake villi, mens Figur 3 viser decidual vev.
Denne protokollen beskriver første samlingen av fersk placenta og decidual vev ved sykehuset eller klinikken. De innsamlede prøven er en blanding av fosterets placenta (villi) og mors livmor komponenter (decidua). Etter skylling med buffer som inneholder bredspektret antibiotika og soppmidler, er hele prøven inspisert av øyet med en lyskasse. Villi og decidua er plassert i separate rør og transporteres på is til laboratoriet. I laboratoriet, er en dissekere mikroskop brukes til å sette pris på de fine morfologiske funksjoner i friskt vev. Representative fotografier avvilløse (figur 2A) og Deciduale vev (Figur 3A) som ble kjøpt med en dissekere mikroskop med to eksterne gooseneck lyskilder vises for referanse.
Villous organkulturer genereres fra første trimester prøver. Kulturer består av små terminal villous trær med 2-6 grener. Det er viktig å dissekere villous grener som avsluttes i extravillous trophoblast kolonner og er godt vaskularisert. Disse funksjonene blir sett på som "fluffy" eller "uklar" grenen ender (pilspisser), og svak rosa-rød lineær fargetone som kurs gjennom grenene på treet til venstre i figur 2A. I motsetning til dette, blir vaskulaturen og extravillous trofoblaster ikke lett visualisert for treet på høyre side av dette bildet, noe som ville være suboptimal for kulturen. Over den første dagen av kultur, extravillous trophoblasts vandrer inn i ECM, thus forankring av trærne villous i matriksen på transwell.
Deciduale organkulturer genereres fra første og begynnelsen av andre trimester prøver. Hele livmorslimhinnen blir forvandlet til decidua svært kort tid etter implantasjon. Mer spesifikt definerer decidua basalis livmorslimhinnen direkte underliggende placenta / implantasjonsstedet, definerer decidua capsularis mucosa ligger over fosteret, og decidua parietalis refererer til resten av livmorslimhinnen. Visualisering under et dissekere mikroskop viser at tidlig svangerskaps prøven består hovedsakelig av decidua parietalis og decidua capsularis (venstre og fragmenter høyre vev, henholdsvis i figur 3A). Den decidua capsularis enkelt utmerker seg med sin tynne, membran natur. For organkulturer, er decidua parietalis trimmet til 3 mm 3 fragmenter med mikro-disseksjon saks og adheleie levret blod er fjernet med pinsett.
Etter inkubering over natten, blir vev infisert med L. monocytogenes. Infeksjonen protokoll som er beskrevet ovenfor er basert på den Gentamicin beskyttelse test som benyttes for å studere intracellulær vekst og spredning av fakultative intracellulære bakterier 16. Organkulturer i antibiotika-fritt medium inkuberes med L. monocytogenes i 5 timer. Kulturene ble vasket med steril PBS for å fjerne bakterier fra mediet. Deretter blir Gentamicin tilsettes for å eliminere ekstracellulære organismer. Før litteratur fra vårt laboratorium brukes immunfluorescens og konfokalmikroskopi å bestemme bakterie vev lokalisering på ulike tidspunkter etter smitte to. Organkulturer blir renset i PBS, fiksert i 4% paraformaldehyd, og enten frosset-innleiret i oktober medium og lagret ved -80 ° C, eller parafin-innleiret og lagret ved romtemperatur. Vevssnitt kan være stabestemt for immunfluorescens (IF) eller immunhistokjemisk (IHC) analyse av bakterier og eukaryote celle lokalisering. Figur 2B er et representativt IF bilde av en frossen seksjon fremstilt av en 8,3 uke villøse orgel kultur på 72 timer etter smitte. Legg merke til den tunge bakteriebelastning (grønn fluorescens) i de EVTs ved endene av villous grener, og den relative mangelen på bakterier i treet-foring syncytiotrophoblast (rød fluorescens) lag. I tidligere arbeid, brukte vi ligner IF flekker å lokalisere L. monocytogenes i villous organkulturer på ulike tidspunkter etter smitte. Over 72 timer, infeksjon spredning fra EVT i sub-syncytialt cytotrophoblasts og underliggende villøse stroma. Spesielt, synyctiotrophoblast lag var resistent mot infeksjon 2.
Representative lette mikroskopiske bilder av H & E-fargede parafin-embedded Deciduale vevssnitt preparert fra 14,3 uke specimens er vist i figurene 3B og 3C. Dette ECM-belagt transwell membran var innebygd for å vise orgel kultur in situ (figur 3B). Bildet viser epitel-lined kjertler (stjerne) og endothelial-lined blodkar (diamant) plassert heterogent innenfor decidual stromal cellerommet. I tillegg er det maternelle immune celler spredt i hele decidual stroma ved en variabel tetthet. IHC-farging og IF kan utnyttes for å bestemme bakterie microanatomical lokalisering i forhold til spesifikk hørende immunceller. Som et eksempel, CD14 + makrofager (grønn fluorescens) lokalisere til foring av blodkar og er spredt i stroma (figur 3D), mens store aggregater av L. monocytogenes (rød fluorescens) er observert hovedsakelig i decidual stroma i 48 timer etter infeksjon (Figur 3D).
| vaskebuffer | innsamling medium | villøse medium | decidual medium |
| PBS | DMEM / F-12 med Glutamax | DMEM / F-12 med Glutamax | DMEM / F-12 med Glutamax |
| Penicillin 100 IU / ml | Føtalt bovint serum 2,5% | Føtalt bovint serum 20% | Føtalt bovint serum 2,5% |
| Streptomycin 100 ug / ml | Penicillin 100 IU / ml | Penicillin 100 IU / ml | 17β-østradiol 300 pg / ml |
| Gentamicin 50 pg / ml | Streptomycin 100 ug / ml | Streptomycin 100 ug / ml | Progesteron 20 ng / ml |
| Amphotericin B 1.25 pg / ml | Gentamicin 50 pg / ml | ||
| < / Td> | Amphotericin B 1.25 pg / ml |
Tabell 1:. Medie oppskrifter komponenter og konsentrasjoner for utarbeidelse av vaskebuffer, Collection medium, villøse medium, og decidual medium.
Figur 1. Placental struktur. (A) Oppbygging av feto placentaiskemi enhet i morens livmor, (B) Utvidelse av boksen i (A) fremhever at foster trophoblast (T) foret placenta villi er badet i mors blod og forankret i decidua av extravillous trophoblasts (EVT). Finnes villi er foster fartøy (FV), fibroblaster og fostermakrofager. Modifisert fra Zeldovich & Bakardjiev 22. "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: villøse organkulturer - Representant brutto og mikroskopiske bilder (A) To terminal villous trær med en svangerskapsalder på 6 uker, som så under et dissekere mikroskop.. Legg merke til de "myke" ender (pilspisser) og fremtredende foster blodkar løpe gjennom grenene på treet til venstre som gjør dette stykket passer for orgel kultur. (B) Immunofluorescensanalyse mikroskopi av orgel kultur (gestasjonsalder 8,3 uker) 72 timer etter infeksjon med Listeria monocytogenes, opplyser tung bakteriemengden [green] i extravillous trophoblasts. DAPI er vist i blått, og HCG + syncytiotrophoblasts i rødt. Skala barer = 1 mm (A), 250 nm (b).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Decidual organ kultur - Representant brutto og mikroskopiske bilder (A) decidua parietalis [venstre] og decidua capsularis [right] på fosteralder 6 uker, som sett under et dissekere mikroskop. (B) H & E-fargede delen av 14,3 ukers svangerskapslengde decidua parietalis organ kultur viser kjertler og blodkar organiserte heterogent hele decidual stroma. The (diamant, ◆) og (stjerne, *) markerer representant fartøy og kjertel, henholdsvis. Brown linje på nedre kant er transwell membran, på kanten. (C) H & E-fargede delen av 14,3 ukers svangerskapslengde decidua parietalis orgel kultur ved høyere forstørrelse demonstrates muskuløs vegger spiral arterioler innebygd i decidual stroma. Maternal immunceller er små med mørke runde kjerner, og er uregelmessig fordelt over hele stroma. (D) Immunofluorescensanalyse mikroskopi av orgel kultur 48 timer etter infeksjon med L. monocytogenes, fremhever store soner av bakterier [red] i decidual stroma, og mors CD14 + makrofager [green] fôr en kroket vaskulære rommet og spredt i stroma. Skala barer = 1 mm (A), 250 nm (B), 50 mikrometer (C og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Innavlede, transgene og knockout musestammer kan tjene i eksperimentelle systemer til robust teste mekanismer. Men til tross for generell bevaring av kjerne genetisk materiale, de funksjonelle genomer hos mus og mennesker viser signifikante forskjeller i regulatoriske elementer 23. Det er ikke overraskende, derfor, at lovende prekliniske studier i dyremodeller er noen ganger ikke rekapitulert hos mennesker. Morkaken viser svært høy artsmangfold, og dermed gjengi dyremodeller mindre enn ideell for studiet av menneskelig sykdom 24. Erkjennelsen av både betydelige forskjeller i mennesker og mus immunologi 25, og det uttales divergerende utviklingen i placenta anatomi, er det klokt å vurdere bruken av ex vivo organkulturer fra menneskelig svangerskaps vev for eksperimentell undersøkelse.
Beskrivelsene, fotografiske bilder, og instruksjonsvideo i denne protokollen instruere forskere påhvordan å etablere villøse og Deciduale organkulturer på ECM-belagt transwell vev kultur inserts. Fordeler med denne teknikken er den relative enkelhet av mikro-disseksjon og mekanisk støtte transwellsystemet, spesielt når sammenlignet med alternative metoder slik som 3D-matriser innebygde eller organ- skive kulturer. Suspensjon av orgelet kultur på membran støtte muliggjør næringsstoff utveksling på alle vev overflater og levedyktighet holdes for kortsiktig kultur (96 timer for villous kulturer, 72 timer for Deciduale kulturer) .Dette teknikken gjør det mulig for å studere menneskelig morkake biologi på vev nivå, unektelig mer biologisk relevant enn monolayer cellekultur modeller.
Den mest kritiske trinnet i denne protokollen er mikro-disseksjon av hensiktsmessige villous og Deciduale stykker for orgel kultur. Optimale vevstykker blir demonstrert fotografisk (figur 2A og figur 3A) for å hjelpe til forskere for hvemvisualisering av svangerskaps prøver er ny. Det er spesielt viktig å velge villous trærne med grener som ender i EVT kolonner, da disse cellene vil migrere inn i ECM og bidra til å forankre villi til membranen. For begge typer organkulturer er nyttig for å redusere forstyrrelser i vev under medie endringer ved pipettering i en forsiktig og rolig måte.
Denne teknikken presenterer bare minimale problemer. Noen ganger prøver viser forurensning. Forurensning er vanligvis bakteriell (tidvis poly-mikrobiell), og bare blir tydelig etter 1-2 dager i kultur. Når forurensning observeres, skal blekemiddel anvendes, kulturen kastes, og den vevskulturinkubator steriliseres for å hindre at en langvarig problem. Det er flere mulige måter forurensning kan oppstå: in utero infeksjon, under operasjonen, under prøven høst / behandling, eller under orgelkultur vedlikehold. Slakte og behandlingstrinn er den mest sannsynlige tidenog sted for forurensning å bli introdusert. Derfor er det viktig å redusere mengden av tid prøven blir manipulert under innsamling og mikro-disseksjon. Dette vil redusere prøven eksponert for den omgivende, ikke-sterilt miljø. Avhengig av laboratorieoppsett, kan dissekere mikroskop være plassert inne i sterilt vev kultur hette.
Den histopatologiske analyse av organkulturer etter infeksjon med medisinsk relevant patogen L. monocytogenes, er vist her som en mulig anvendelse av protokollen. Immunfluorescens lokalisering av både bakterier og vertsimmunceller etter smitte frambringer ny innsikt i den menneskelige verten svar på patogener. Deciduale orgel kulturer kan tjene som en komplementær ex vivo eksperiment teknikk for å undersøke data generert fra in vivo mus infeksjoner, inkludert spennende rapporter som viser feil i murine Deciduale makrofag forsvar funksjoner 26,27. I tillegg menneskelig orgen kulturer kan anvendes i blandet infeksjon strategier, for eksempel som en konkurrerende inokulum sammensatt av flere isogene stammer av L. monocytogenes. Konkurransedyktige infeksjon av organkulturer er en følsom måte å teste relevansen av virulensfaktorer i menneske vert. En begrensning ved denne fremgangsmåten er vevet levedyktighet, som er begrenset til kortvarig kultur (96 timer for villous kulturer, 72 timer for Deciduale kulturer). Dette er ideelt for infeksjon med hurtigvoksende mikrober som L. monocytogenes, men lengre kulturer kan være nødvendig for patogener som tar mer tid til å etablere og spres gjennom vev.
For å redusere den globale byrden av graviditet komplikasjoner, må forskning fokuserer på å forstå patofysiologien av den menneskelige maternal-føtal grensesnitt. Bakterier, sopp og virus patogener som krysser fra mor til foster årsaken ødeleggende komplikasjoner under svangerskap og fosterinfeksjon. Kontrollert in vivo infeksjon av laboratorie aniMals er vanligvis regnet som gullstandarden for å ta opp hvordan patogener koloniserer og transitt mellom organer 28. Fordi morkake anatomi varierer sterkt over pattedyrarter, er det av største betydning å innlemme menneskelig vev i forskningsstrategier. Menneske villous og Deciduale orgel kulturer er svært relevante modellsystemer for å undersøke verts patogen interaksjoner. For å studere dette viktige ennå dårlig forstått organ, kan forskerne dra nytte av den overflod av ellers forkastet human placenta og Deciduale prøver, bruker organ kultur strategier som er beskrevet her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
