Summary
Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.
Abstract
Plasenta Türler arası anatomik değişkenlik geniş ölçüde göstermektedir. en iyi biyoloji ve insan plasenta patofizyolojisi anlamak için insan hücreleri ve dokuları kullanarak deney tasarlama zorunludur. Organ kültürü bir avantajı, üç boyutlu (3D) bakım yapısal organizasyon ve hücre-dışı matris. Burada anlatılan yöntemin amacı, ex vivo insan gebelik doku organ kültürleri başarılı kurulması ve 72-96 saat süreyle onların sağlıklı kültür bakımıdır. protokol işletim paketi taze araştırma-rıza gösterilen, plasenta ve desidual örneklerin hemen işleme ayrıntıları. Bunlar aksi takdirde iptal olacak bol örneklerdir. 3D Organ kültürleri kurmak için uygun dokuların nasıl seçileceği ile ilgili morfolojik ayrıntıları içeren bu örneklerin, steril koleksiyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar sağlanır. Plasental villus ve desidual dokular 2-3 mm 3 adet haline microdissected edilirve birkaç gün boyunca matris kaplı Transwell filtreleri üzerinde ayrı ayrı yerleştirilir ve kültürlü. Villöz ve desidual organ kültürleri, insan-konak etkileşim çalışma için uygundur. diğer organizma modellerine göre de, bu insan kültürleri konut spesifitesine değişen örnekleri göstermektedir patojenler için enfeksiyon oluşturma mekanizmaları incelemek için özellikle avantajlıdır. Bir örnek olarak, biz klinik olarak anlamlı, fakültatif hücre içi bakteri patojen Listeria monocytogenes ile plasental ve desidual organ kültürleri enfeksiyonunu gösterir.
Introduction
maternal-fetal arayüzünde enfeksiyon ve inflamasyon kadın ve çocukların morbidite ve mortalitenin önemli bir kaynağını temsil eder. patojenler bu dokuları bulaştırmak nasıl anlamak önlemek ve bu tür erken doğum ve fetal ölüm gibi hastalıkları tedavi etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Ancak, maternal-fetal arayüzü yüksek türler arası değişkenlik deneysel soruşturma zorlaştırmaktadır. Ayrıca, en mikrobiyal patojenler konak özgüllüğü, böylece birçok hayvan modelleri tamamen insan bulaşıcı hastalıklar özetlemek olamaz göstermektedir. Örneğin, Listeria monocytogenes gibi diğer ev sahibi özgüllük 1 daha orta seviyede gösterirken belirli organizmalar (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio kolera, ve çok sayıda diğerleri), insanlarda tamamen patojeniktir. Spasifitelerinin kolonizasyon 2, yayılması 3, bağışıklık kaçırma 4 de dahil olmak üzere, patogenezi birçok açıdan belgelenmiştir 5. Bu nedenle, uygun bir ev sahibi model sistemler seçmek için büyük önem taşımaktadır.
Fetal hücre ve anne kanı oluşan plasenta hızla gebeliğin 6 boyunca gelişen bir organdır. En basit anlamda, insan plasenta anne kanında boğulmuş fetal "villous" ağaç benzeri yapıların inşa edilmiştir. Gaz ve besin alışverişi villöz ağaçların yüzeyini döşeyen trofoblast adı verilen özel fetal hücre katmanları arasında oluşur. anne rahim mukozası astar, gebe olmayan kadınlarda endometrium olarak adlandırılan fetoplasental birimi karşılamak için desidua içine yapısal ve fonksiyonel dönüştürür. Villöz ağaçlar desidua içine hücre sütunları demirleme göç extravillous trofoblastlar (EVT) tarafından rahim içine demir atmış. maternal-fetal arayüzü, bu nedenle, desidua ve plasenta oluşur.
Organ kültürü tekniği Burada anlatılanL. dahil nerede ve nasıl klinik olarak önemli insan patojenleri incelemek için kullanılır olmuştur monocytogene s ve Toxoplasma gondii, plasenta bariyerini 2,7 çapraz. Bu ex vivo organ kültürleri in vivo doku mimarisi çoğaltmak ve insan plasenta için tartışmasız fizyolojik son derece alakalı model sistemler vardır. Ek kültür teknikleri 3D-matris içine gömülü Tüm organ eksplantlar, organ dilimleri ve doku veya kök hücre organoids içerir. Bu seçeneklerle ilgili ayrıntılar için, kapsamlı bir son gözden 8 bakınız. Bu protokol desidua ve plasenta villus ayrı kültürü için olduğunu lütfen unutmayın. plasental hücreleri ve desidual hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için, bir ko-kültür tekniği tercih edilebilir. Biz trofoblast aracılı desidual vasküler remodeling 9-11 okuyan araştırmacılar tarafından kullanılan, daha önce açıklanan villöz-desidual ko-kültür tekniği, ilgi okuyucu bakın.
Protocol
Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslara göre yapılmıştır. Bu çalışma Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, San Francisco (CHR # 11-05530) tarafından onaylandı. sağlanan tüm hastalar örnekler ve müteakip analizler toplanması için onam yazılı. Doku de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır.
NOT: araştırmacı kurumsal insan denekler inceleme kurulu tarafından onay alması gerekir. gebelik öyküsü veya plasental anomaliler dayalı örneklerin dışlama herhangi bir özel çalışma ihtiyaçlarına göre değişecektir.
NOT: Uygun güvenlik koşulları (biyogüvenlik düzeyi 2) bu protokol 12 tüm adımlar için kullanılmalıdır.
Toplama Günü 1. Hazırlık, önce
- Otoklav süzgeçler / toplama forseps ve mikro diseksiyon için makas / forseps.
- Yeterli Yıkama tamponu hacmi (numune başına 500 ml) (re hazırlayın) tarifi için Tablo 1'e fer.
- Yeterli hacim 0.22 uM steril filtreli Koleksiyon medya (numune başına 100 ml) hazırlayın (tarifi için bakınız Tablo 1).
- Kısım Ekstrasellüler Matriks uzun süreli saklama için (ECM, ayrıntılar için Reaktifler Tablo bakınız).
- -20 ° C'de katı halde mağazası ECM. En iyi performans için, tekrar donma çözülme kaçının. Çözülme 4 ° C'de viskoz bir çözeltiye şişe ve soğutulmuş pipet uçları olan soğuk bir odada 300 ul alikotları hazırlamak. -20 ° C'de saklayın alikotları.
Taze Doku 2. Koleksiyonu
DİKKAT: taze insan dokusu ile çalışırken, araştırmacı Kandaki patojenlerin bulaşmasını önlemek için Evrensel Önlemler (OSHA) takip etmelidir, ve uygun kurumsal eğitimi almış olmalıdır. eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar kat dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar, gereklidir.
- taşımaotoklava-süzgeçler (örnek başına bir tane), otoklava-forseps, yıkama tamponu (damacana), toplama ortamı (50 ml konik bir tüp içinde örnek başına 25 mi), sprey şişesi,% 10 çamaşır suyu,% 70 etanol, doku toplama tepsisi, Sharpie ve buz kovası / hastane / kliniğe soğutucu.
NOT: Örnekler çalışma paketi yakın bir odada bulunan bir araştırma belirlenen alanda alınır. Bir steril doku kültür kapağı gerekli değildir, ancak koleksiyonu süratle oluşması ve aşağıda tarif edildiği gibi bir araştırmacı uygun, yüzeyleri sterilize edilmelidir. - Wash Yeri damacana lavabo bitişik tampon ve% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tertibatı püskürtün. Yeri cam doku toplama ışık kaynağı (ışık ped veya ışık kutusu) tepsi ve% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile dezenfekte. kurumaya bırakın.
- numune hazırlama odasına işletim takımından klinisyen taşıma örnekleri var. lavabo, Was doku birkaç kez durulayın, steril el süzgeç üstüne numune dökmekh tampon ve ışık kaynağı üstünde dezenfekte cam tepsiye tampon içinde tüm numune aktarın.
NOT: klinisyen tarafından dokusunun değerlendirilmesi klinisyen sözlü o / o değerlendirmeyi tamamladı işaret ettikten sonra, böylece aşağıdaki adımlar yalnızca gerçekleştirilir, en yüksek önceliğe sahiptir. - Toplanması için plasental villuslarda desiduadan (Şekil 2A ve 3A) ve daha 50 ml konik tüp, ayrı aktarmak steril forseps kullanın. gebelik yaşı Tüpleri etiketleyin.
NOT: Tercih edilen gebelik yaşları az 9 hafta ve sırasıyla plasenta ve desidua için en az 16 haftadır. kurumda, her numunenin sadece bir kısmını yeterli doku klinik patolojik tanı için kalmalıdır olarak, araştırma amaçlı temin edilir. - araştırma laboratuvarı buz üzerinde saklayın ve ulaşım örneği.
- colle ile% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile, yukarıda tarif edildiği gibi birden fazla numune toplamak için, bir cam tepsi sterilizeHer numunenin ction.
Organ Kültür Tabaklar 3. hazırlanması
Not: Aşağıdaki adımlar, bir doku kültürü başlığı içinde steril bir teknik kullanılarak yapılmalıdır. diseksiyon mikroskobu steril bir alanda yer için idealdir. mikro-disseksiyon süratle gerçekleştirilir, ve cihazlar% 70 etanol içinde sıklıkla daldırılır Ancak, bu sürece mutlaka gerekli değildir.
- buz üzerinde çözülme ECM flakon (ler). pipetleme karıştırın, buz gibi soğuk Koleksiyon medya ile 1: ECM 1 seyreltin. Pipet yavaş yavaş kabarcıkları almaktan kaçınması. 6-çukurlu doku kültürü plakasının her da bu süspansiyon 100 ul gerektiren 3-4 organ kültürleri uygun olacaktır.
- 6-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna yer Transwell (gözenek büyüklüğü 0.4 uM).
- Kat her ECM / medya süspansiyon ince bir tabaka (100 ul) ile ekleme Transwell.
- Buz üzerinde plakası yerleştirin ve hemen Ev aldılar devamorgan kültürleri t. Alternatif olarak, dava daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C'de para-film ve mağaza sarın hangi doku koleksiyonuna önce plaka hazırlamak. ECM kurumasına gibi uzun 6 saat daha Depolama tavsiye edilmez.
Organ Kültürlerinin 4. kurulması
NOT: Bu adım, ayrı transwells içinde desidual organı kültürleri ve villöz organı kültürleri yerleştirmek açıklamaktadır. dokuların temas değildir. Desidua ve villus birbiri ile doğrudan temas halinde olan bir ko-kültür tekniği ile ilgili araştırmacılar, önce literatüre 9,10 başvurabilirsiniz.
- Her durulama arasında 1000 xg'de Koleksiyon medya ve santrifüj iki kez örnekleri durulayın. Diseksiyon mikroskobu sahnede steril petri ve yere doku aktarın. Mikroskop bitişik buz üzerinde 6 oyuklu plaka tutun.
- 2-3 mm villöz organı kültürünü yerleştirmek için steril springer diseksiyon makas ve forseps, Mikro-teşrih dokuS (Şekil 2A).
NOT: Villöz organ kültürleri 2 veya 3 şube ile küçük, iyi kanlanan "ağaç", ve belirgin extravillous trofoblast (EVT) hücre sütunları 11. ECM içine extravillous trofoblastların işgali olarak, çoğu bu genç yaşlarda 13 de telaffuz edilir <9 hafta birinci trimester örneklerinden sadece villus doku kullanmak önemlidir. - belirgin EVT hücre sütunları ile iyi vaskülarize villuslar seçin. EVT hücre sütunları soğanlı olarak canlandırırlar, "bulanık", "kabarık" biter (Şekil 2A ok başları bakınız).
- Her transwell içine 3 veya 4 villöz ağaçları aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ağaç ECM ve ayrı clumped dallar üstünde düz konumlandırılmış böylece şube ayarlayın.
- 3 mm 3 desidual organı kültürleri (Şekil 3A) kurmak için, steril springer diseksiyon makas ve forseps ile desidual doku mikro teşrih.
NOT: Örnekler iki dis içerirlerplasental dokuların, desidua parietalis ve desidua capsularis ve Tinct türleri (sırasıyla sağ doku parçaları, Şekil 3A sol ve). - Desidua parietalis 3 mm 3 parçaları oluşturmak için makasla kesin. Desidua capsularis bu kültürler için kullanılmaz. herhangi pıhtılaşmış anne kanı kızdırmak için forseps kullanabilir.
- Her transwell içine desidua 3-4 adet aktarmak için steril forseps kullanabilir.
- kuyunun dibinde Toplama medya 1ml ekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe levhasını
- Deneyler için, birinci trimester plasenta oksijen gerilimi taklit göreceli hipoksi (% 3 O 2) villöz organı kültürleri korumak için önemli olduğu.
NOT: Laboratuvar seçenekleri içinde küçük varolan kuluçka uygun hipoksi inkübatör odaları veya oksijen konsantrasyonunu düşürmek için dış N2 gazı tanıtan bir tri-gaz inkübatör bulunmaktadır. - Villöz veya Desidual orta (Tab 1 ml ekleyinle 1) kültür 12-16 saat sonra transwell bir top.
NOT: kültüründe ilk gecede sırasında medyanın yokluğu extravillous trofoblastik hücre kolonları (villus kültürü) işgal için izin verir, ve doku için (villus ve desidual hem de) sıkıca ECM gömülü olmak. Bizim tecrübelerimize göre, desidual organ kültürleri 96 saat boyunca 72 saat ve villöz organ kültürleri için geçerli kalır. Biz bu süre içinde düşmek deneysel son noktalar öneriyoruz. Villöz ve desiduanın ortamının bileşimi için Tablo 1'e bakınız. Desidual ortamı decidualized durumunu (Tablo 1) muhafaza gebelik hormonları (progesteron, 17β-estradiol) ile desteklenmiş iken villöz orta FBS yüksek oranda bulunur.
L. 5. hazırlanması Kültürler monocytogenes
NOT: L. uzun süreli depolama hakkında ayrıntılı protokolü için monocytogenes, kültür ve thi büyümebeyin kalp infüzyon (BHI) suyu ve agar s organizma, Wang ve ark bakın. 14
- Tek bir L. almak çizgili BHI agar plakasından koloniyi monocytogenes ve BHI suyu 3 ml aşılamak.
- L. inkübe 30 ° C 'de, eğik pozisyonda, gece boyunca (16 saat) kültür monocytogenes.
Not:. Bu kültür koşulları bakteri üremesi sabit faz ulaşmasına izin L. monocytogenes konakçı hücre istilasını 15 artar, 30 ° C, en kamçılı edilir.
L. ile Organ Kültürlerin 6. Enfeksiyon monocytogenes
- Sıcak PBS ve villöz veya 37 ° C'ye kadar Desidual ortamı (Tablo 1).
- ECM içine işgal etmedi ve bu nedenle kuyunun içinde yüzen herhangi bir organ kültürü parçalarını kaldırmak için steril bir cımbız kullanın.
- Dikkatle transwell altından medya aspire. yavaşça savaş 1 ml pipetle iki kez üst ve alt transwells durulayıniyi ve dikkatli arasında aspire içine PBS m. Yavaşça, üst ve alt transwell antibiyotik içermeyen Villöz ya Desidual ortam 1 ml pipetle. Organ kültürü rahatsız etmemek için dikkatli olun.
- Doku antibiyotikler çıkarıldığından emin olmak için en az bir saat boyunca antibiyotik içermeyen ortamda inkübe edelim.
NOT: sabit faz L. yoğunluğunu monocytogenes kültürü, ml başına yaklaşık olarak 1 x 10 9 koloni oluşturan birim (CFU) 'dir. organ kültürleri enfekte etmek için kullanılan bakteri sayısı deney ihtiyaçlarını karşılamak için ampirik olarak tespit edilmelidir. - Vahşi tip L. Rutin enfeksiyon deneyleri monocytogenes (oyuk başına ortam 1 ml 4 x 10 7 L. monocytogenes) bir karışımı, 1:50 seyreltme ile sağlam invazyonu. antibiyotik içermeyen Villöz ya Desidual ortam içinde bakteri uygun sayıda yeniden süspanse edin.
- transwells üst aspire medya. Yavaşça inokulum 1 ml ekleyin. 37 ° C'de inkübe% 5 CO 2 ° C bakteri istilası için izin vermek.
- Üst ve alt transwells medya aspire dışı bakteri çıkarın. sıcak PBS ile iki kez kuyu durulayın. 50 ug ml -1 gentamisin ile desteklenmiş villöz ya Desidual ortam 1 ml ilave edilir. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: L. monocytogenes, hücre dışı ortamda yetişen hücreler içinde büyür ve hücre-dışı alanını erişmeden hücre-hücre yayılabilir fakültatif hücre bir bakteridir. Gentamisin dışı L. üzerinde bakterisidal etkiye sahiptir monocytogenes ve böylece hücre içi L. ölçülmesini sağlar monocytogenes gelişimini ve organ kültürü 16 ile yayıldı.
NOT: tekrarlanabilir L. villus ve desidua organı kültürlerin monocytogenes enfeksiyonu 5 saat inkübasyon sürelerinde oluşur. gentamisin eklenmesinden önce inkübasyon süresi deneysel ihtiyaçları ve ab dayalı modifiye edilebilirorganizmanın ility dokusunu işgal etmeye. Daha iyi enfeksiyona anatomik siteleri en savunmasız anlamak için, kısa inkübasyon süreleri 2 kullanılabilir. - Deney süresince% 5 CO2 içinde 37 ° C'de plakalar koruyun. iyi günde her bütün ortamı değiştirmek.
NOT: Bizim tecrübe, L. ise enfekte olan desidual organ kültürleri 72 saat boyunca 48 saat ve villöz organ kültürleri için geçerli kalır monocytogenes.
Histopatolojisi 7. Hasat Organ Kültürleri
- 30 ml PBS içinde% 16 hazır ampul 10 ml seyreltilmesi ile% 4 paraformaldehit taze çözelti hazırlayın. 4 ° C'de saklayın% 4 paraformaldehid, ışıktan korunmuş ve bir hafta içinde kullanın. Kullanmadan önce, oda sıcaklığına kadar getir.
- Üst ve alt transwell medya aspire. Yavaşça oda sıcaklığında iki kez PBS ile kuyu durulayın. Yavaşça tamamen Organ kültürü kapsayacak şekilde transwell dön 1ml% 4 paraformaldehid ekleyin.
- tasarlamak20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid. Bu doku aşırı tespitin yol açabilecek kadar uzun inkübasyon süreleri kaçının.
- oda sıcaklığında iki kez PBS ile aspire paraformaldehit ve durulama kuyular. Bir kriyostat üzerinde Ekim ortamı, donma ve bölümünde sabit bir organ kültürleri embed ( "dondurulmuş fixed"). Genel olarak, sabit bir dondurulmuş doku önceden tespit olmayan dondurulmuş dokudan daha bölümüne daha kolaydır.
NOT: Ekim gömme ve dondurulmuş kesit komple protokol, yayınlanmış protokolleri 17,18 alakalı bölümleri erişmek için lütfen. Deneysel ihtiyaçları ve mevcut laboratuar ekipmanları ve depolama bağlı olarak, doku yerine parafine gömülmüş ve bir mikrotom 19 kesitli olabilir. - Dahası rutin Hematoksilen & Eosin boyaması, immünofloresans veya immünhistokimya 18,20,21 doku slaytlar hazırlamak.
Representative Results
Şekil 1 (Zeldovich & Bakardjiev 22 değiştirilmiş) İlgili plasental ve rahim anatomisi diyagramlar. 2 temsilci gros ve plasental villus histolojik görüntülerini göstermektedir, Şekil 3 desidual dokuyu gösteriyor ise.
Bu protokol ilk olarak hastane veya klinikte taze plasental ve desidual doku toplama açıklar. Toplanan örnek fetal plasental (villus) ve anne rahim bileşenlerinin (desidua) bir karışımıdır. geniş spektrumlu antibiyotik ve antifungal içeren tampon ile yıkandıktan sonra, tüm numune bir ışık kutusu kullanarak gözle tarafından denetlenir. Villuslarda Desidua laboratuvara buz üzerinde ayrı ayrı tüplere yerleştirilir ve taşınır. Laboratuvarda, bir diseksiyon mikroskobu sağlıklı doku ince morfolojik özellikleri takdir etmek için kullanılır. Temsilcisi fotoğraflarvillöz (Şekil 2A) ve desidual dokular İki harici boynu ışık kaynakları ile bir mikroskop ile elde edildi (Şekil 3A) referans olarak gösterilmiştir.
Villöz organ kültürleri ilk trimester örneklerinden oluşturulur. Kültürler 2-6 şubesi bulunan küçük terminali villus ağaçların oluşmaktadır. Extravillous trofoblast sütunlarında sona erdirmek ve iyi vaskülarize olan villus dalları incelemek önemlidir. Bu özellikler "kabarık" veya "bulanık" dal uçlarından (ok başları) ve soluk pembe-to-kırmızı doğrusal tonu olarak görülüyor Şekil 2A soldaki ağacın dalları aracılığıyla kurslar. Buna karşılık, damarlar ve extravillous trofoblastlar kolayca kültürü için optimal olacak bu resmin sağında, ağaç için görüntülendi değildir. Kültürün ilk gününde üzerinde, extravillous trofoblastlar ECM, t göçhus transwell üzerinde matris içine villöz ağaçları ankraj.
Desidual organ kültürleri ilk ve erken ikinci trimester örneklerinden oluşturulur. tüm rahim astar implantasyon sonrası çok kısa bir süre desidua dönüşür. Daha özel olarak ise, Desidua basalis doğrudan plasenta / implantasyon sitesinin altında uterus mukozası, Desidua capsularis mukoza fetus örten tanımlar tanımlar ve Desidua parietalis rahim duvarına kalanına anlamına gelir. Bir mikroskop altında Görselleştirme erken gebelik örnek (Şekil 3A'da, sırasıyla sol ve sağ doku parçaları) büyük ölçüde Desidua parietalis ve desidua capsularis oluştuğunu gösterir. Desidua capsularis kolayca ince zar doğası ile ayırt edilir. Organ kültürleri için Desidua parietalis 3 mm ila 3 kesilir Mikro-diseksiyon makas ve Adhe ile fragmanlarkira pıhtılaşmış kan forseps ile çıkarılır.
Gece boyunca inkübasyondan sonra, dokular L. bulaşmış monocytogenes. Yukarıda tarif edilen enfeksiyon protokolü hücre büyüme ve fakültatif hücre içi bakterilerin 16 yayılmasını incelemek için kullanılan Gentamisin koruma deneyi dayanır. Antibiyotik içermeyen ortam içinde organ kültürleri L ile kuluçkalanır 5 saat monocytogenes. Kültürler ortamından bakteri kaldırmak için steril PBS ile yıkanmıştır. Bundan sonra, Gentamisin hücre dışı organizmalar yok etmek için ilave edilir. Laboratuvarımızda önceden literatür enfeksiyonu 2 sonra çeşitli zaman noktalarında bakteriyel doku lokalizasyonu belirlemek için immünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanılır. Organ kültürler% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi, PBS içinde durulandı, ve ya dondurulmuş gömülü Ekim ortamı içinde ve -80 ° C'de saklandı veya parafine gömülmüş ve oda sıcaklığında saklandı. Doku kesitleri sta olabilirImmünofloresan (IF) ya da bakterilerin immünohistokimyasal (İHK) analizi ve ökaryotik hücre lokalizasyonu için ined. Şekil 2B temsilcisi IF enfeksiyondan sonra 72 saatte bir 8,3 hafta villöz organ kültürü hazırlanan bir frozen görüntü. villöz dalların ucunda EVTs ağır bakteriyel yükü (yeşil floresan), ve ağaç kaplama sinsityotrofoblast (kırmızı floresan) katmanı içinde bakterilerin göreceli eksikliği dikkat edin. Boyama L. yerelleştirilmesine IF önceki çalışmada, benzer kullanılan enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında villus organ kültürleri içinde monocytogenes. 72 saat, alt Sinsityal sitotrofoblastlar ve altta yatan villus stroma içine EVT gelen enfeksiyon yayılması üzerine. Özellikle, synyctiotrophoblast tabakası enfeksiyonu 2 dirençliydi.
H & E boyalı parafine gömülmüş desidual doku bölümleri Temsilcisi ışık mikroskobik görüntüleri 14.3 hafta specime hazırlananns Şekiller 3B ve 3C'de gösterilmiştir. Bu ECM-kaplı Transwell membran yerinde organ kültürü (Şekil 3B) göstermek için gömülü edildi. Görüntü epitel kaplı bezler (yıldız) ve endotel kaplı damar (elmas) desidual stromal hücre bölmesi içinde heterojen bir konuma göstermektedir. Ayrıca, değişken yoğunlukta desidual stroma dağılmış anne bağışıklık hücreleri vardır. IHC ve boyama, belirli yerleşik bağışıklık hücrelere göre bakteriyel mikroanatomik lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir eğer. Bir örnek olarak, CD14 + makrofajlarda (yeşil flüoresan) damar duvarına lokalize ve stroma (Şekil 3D) içerisinde dağılmış ise L. büyük agregalar monocytogenes (kırmızı flüoresan) enfeksiyondan sonra 48 saat (Şekil 3D) de desidual stromada ağırlıklı gözlenir.
| Yıkama tamponu | Toplama ortamı | villöz orta | desidual orta |
| PBS | GlutaMAX ile DMEM / F-12 | GlutaMAX ile DMEM / F-12 | GlutaMAX ile DMEM / F-12 |
| Penisilin 100 IU / ml | Fetal Sığır Serumu% 2.5 | Fetal Sığır Serumu% 20 | Fetal Sığır Serumu% 2.5 |
| Streptomisin 100 ug / ml | Penisilin 100 IU / ml | Penisilin 100 IU / ml | 17β-estradiol 300 ug / ml |
| Gentamisin 50 ug / ml | Streptomisin 100 ug / ml | Streptomisin 100 ug / ml | Progesteron 20 ng / ml |
| Amfoterisin B 1.25 mg / ml | Gentamisin 50 ug / ml | ||
| < / Td> | Amfoterisin B 1.25 mg / ml |
Tablo 1:. Ortam tarifleri parçaları ve Yıkama tamponu, toplama ortamı, Villöz orta ve Desidual ortamının hazırlanması için konsantrasyonları.
Anne rahmine feto-plasental ünitenin Şekil 1. Plasental yapısı. (A) yapısı, Kutunun (B) Genişleme (A) Fetal trofoblast (T) plasenta villusların anne kanında banyo ve tarafından desidua içine demirlemiş kaplı olduğunu vurgulamaktadır extravillous trofoblastlar (EVT). villuslarda içinde bulunan cenin gemiler (FV), fibroblast ve fetal makrofajlar. Zeldovich & Bakardjiev 22 Modifiye. "> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Villöz organ kültürleri - Temsilci brüt ve mikroskopik görüntüleri (A) bir mikroskop altında bakıldığında 6 haftalık bir gebelik yaşı ile iki terminali villöz ağaçlar,.. organ kültürü için bu parça uygun hale soldaki ağacın dalları Akan "kabarık" uçlar (ok başları) ve belirgin fetal damarsal unutmayın. Extravillous trofoblastların ağır bakteriyel yükü [yeşil] vurgulayarak Listeria monocytogenes ile organ kültürü (gebelik yaşı 8.3 hafta) 72 saat sonrası enfeksiyon (B) İmmünofloresan mikroskopi. DAPI mavi gösterilir ve kırmızı βHCG + sinsityotrofoblastlarda. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Desidual organ kültürü - Temsilci brüt ve mikroskopik görüntüleri (A) desidua parietalis [left] ve desidua capsularis [sağ] gebelik yaşı 6 hafta, bir mikroskop altında bakıldığında. 14.3 hafta gebelik yaşı desidua parietalis organ kültürü (B) H & E boyalı bölüm desidual stroma boyunca heterojen organize bezleri ve damarsal gösterir. (Elmas, ◆) ve (yıldız işareti *) sırasıyla, temsili gemi ve bezi vurgulayın. alt kenarda kahverengi çizgi kenarında, Transwell zardır. 14.3 hafta gebelik yaşı desidua (C) H & E boyalı bölüm yüksek büyütme d Organ kültürü parietalisdesidual stromada gömülü kas duvarlı spiral Arteriolleri emonstrates. Maternal bağışıklık hücreleri koyu yuvarlak çekirdekleri ile küçük ve düzensiz stroma boyunca dağıtılır. (D) L. ile organ kültürü 48 saat sonrası enfeksiyon İmmünofloresan mikroskopi Bakterilerin büyük bölgeleri desidual stromada [kırmızı] ve anne CD14 + makrofajlar [yeşil] dolambaçlı vasküler boşluk astar ve stromada dağınık vurgulayarak monocytogenes. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 250 mikron (B), 50 mikron (C ve D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Kendilenmiş, transgenik ve nakavt fare suşları sağlam mekanizmalar test etmek deneysel sistemlerde hizmet edebilir. Bununla beraber, temel genetik materyal genel korumaya karşın, farelerde ve insanlarda işlevsel genomları düzenleyici elemanlar 23 önemli farklılıklar ortaya koymaktadır. Bu nedenle, hayvan modellerinde bu umut vaat eden klinik öncesi çalışmalar, bazen insan hastalarda şaşırtıcı değildir değinmeyecek değildir edilir. Plasenta, böylece insan hastalığı 24 çalışması için hayvan modelleri daha az ideali sonra render çok yüksek türler arası çeşitlilik gösterir. İnsan ve fare immünoloji 25 önemli farklılıklar ve plasental anatomi telaffuz farklı evrim hem kabul eden deneysel araştırma için insan gebelik dokularının ex vivo organ kültürleri kullanımını dikkate isabetli olmuştur.
Bu protokolde açıklamaları, fotoğraf görüntüleri ve öğretim video ile ilgili araştırmacılar talimatECM-kaplı Transwell doku kültürü ekler üzerine villöz ve desidual organı kültürleri nasıl kurulabileceğini. Bu tekniğin avantajları özellikle de 3D gömülü matrisler veya organ dilim kültürleri gibi alternatif yöntemlere kıyasla mikro-diseksiyon göreceli basitlik ve mekanik destek Transwell sistemini içerir. Membran desteği organ kültürü Süspansiyon tüm doku yüzeylerinde besin alışverişi için izin verir ve canlılık kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) .Bu teknik dokusunda insan plasental biyoloji eğitimi için izin verir muhafaza edilir seviye, tek tabakalı hücre kültürü modellere göre tartışmasız daha biyolojik ilgili.
Bu protokolde en kritik adım organ kültürü için uygun villus ve desidua parçaları mikro diseksiyonudur. Doku optimal parçaları fotografik göstermiştir (Şekil 2A ve Şekil 3A) için araştırmacılar yardım etmek içingebelik örneklerin görselleştirme yenidir. Hücreler ECM göç ve zara villuslar çapa yardımcı olacak gibi, dalları EVT sütunlarında sona villöz ağaçları seçmek için özellikle önemlidir. organ kültürleri her iki tip için dikkatli ve telaşsız bir şekilde pipetleme medya değişiklikleri sırasında dokuya bozuklukları en aza indirmek için yardımcı olur.
Bu teknik sadece asgari zorluklar vardır. vesilesiyle, numuneler kontaminasyonu göstermektedir. Bulaşma genellikle bakteriyel (bazen poli-mikrobiyal) ve sadece kültürde 1-2 gün sonra belli olur. kontamine sonra, ağartma kültürü atıldı uygulanmalıdır, ve doku kültürü kuluçka uzun süreli bir sorunu önlemek için sterilize edilir. numune hasat / işleme sırasında utero enfeksiyonu, ameliyat sırasında, ya da organ kültürü bakımı sırasında: birkaç olası kontaminasyon ortaya çıkabilecek yolu vardır. Hasat ve işlem adımları büyük olasılıkla zaman vardırve kirlenme yer tanıtılması. Nedenle, örnek toplama ve mikro-disseksiyon de kolaydır süreyi azaltmak için çok önemlidir. Bu ortam, steril olmayan ortama örnek maruziyeti azaltacaktır. laboratuar kurulumuna bağlı olarak, diseksiyon mikroskobu steril doku kültürü kaputu içinde yer alabilir.
Tıbben ilgili patojen L. ile enfeksiyon sonrası organ kültürleri histopatolojik analizi monocytogenes, protokol olası bir uygulama olarak burada gösterilmiştir. patojenlere insan konak yanıtı içine enfeksiyon verimleri yeni anlayışlar sonra hem bakteri ve konak bağışıklık hücrelerinin İmmünofloresan lokalizasyonu. Desidual organ kültürleri fare desidual makrofaj savunma fonksiyonları 26,27 kusurları gösteren ilginç raporlar da dahil olmak üzere in vivo fare enfeksiyonları, elde edilen verileri incelemek için tamamlayıcı ex vivo deney tekniği olarak hizmet olabilir. Buna ek olarak, insan OrgBir kültürler, L. birkaç izogenik suşu oluşan bir rekabet aşı malzemesi olarak, karışık enfeksiyon stratejilerinde kullanılabilir monocytogenes. organ kültürleri Rekabet enfeksiyon insan konak içinde virülans faktörlerinin önemini test etmek için hassas bir yoldur. Bu yöntemin bir kısıt kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) ile sınırlıdır doku canlılığı vardır. Bu, L. gibi hızlı büyüyen mikroplarla enfeksiyon için ideal monocytogenes, ancak daha uzun kültürleri kurmak ve doku içinden yaymak için daha fazla zaman alır patojenler için gerekli olabilir.
gebelik komplikasyonlarının küresel yükünü azaltmak için, araştırma, insan maternal-fetal arayüzü patofizyolojisinin anlaşılmasında odaklanması gerekmektedir. Bakteriyel, fungal ve gebelik ve fetal enfeksiyon komplikasyonları yıkıcı neden anneden fetüse çapraz viral patojenler. Laboratuvar ani in vivo enfeksiyon kontrollümals tipik patojenler kolonize ve organlar 28 arasında geçiş nasıl adresleme için altın standart olarak kabul edilir. plasental anatomi memeli türler arasında belirgin farklılık, çünkü araştırma stratejileri içine insan dokusu dahil etmek büyük önem taşımaktadır. İnsan villus ve desidual organ kültürleri konak-patojen araştırmak için son derece alakalı model sistemler vardır. Bu hayati henüz tam olarak anlaşılamamıştır organı incelemek için, araştırmacılar, burada açıklandığı gibi organ kültürü stratejileri kullanarak, aksi takdirde iptal insan plasental ve desidua örneklerin bolluğu yararlanabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
