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Biology

फास्ट और सरलीकृत उच्च शुद्ध उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन से miRNA के उच्च माध्यम से रखा अलगाव के लिए विधि

Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54257
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Virginia Commonwealth University, 2McGuire Veterans Affairs Medical Center, Research BC-101

Summary

MicroRNAs एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाते हैं और विभिन्न मानव रोगों के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभर रहे हैं। यह दिखाया गया है कि miRNAs उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन में किया जाता है। हम एक सरल विधि तेजी से मानव प्लाज्मा से miRNA विश्लेषण के लिए उपयुक्त शुद्ध एचडीएल को अलग-थलग करने के लिए विकसित किया है।

Protocol

1. रक्त के नमूनों का संग्रह

  1. 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक थक्कारोधी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (जो अन्य anticoagulants पर कई फायदे हैं) कोहनी के सामने खात में एक प्रमुख नस के मानक venipuncture से युक्त ट्यूबों में परिधीय शिरापरक रक्त के नमूनों उपवास लीजिए।
  2. रक्त के नमूने 1600 XG पर लाल रक्त कोशिकाओं और आरएनए की छोटी मात्रा से मुक्त प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. क्रमिक रूप से WBC और प्लेटलेट्स और फिर अतिरिक्त 15 मिनट दूर करने के लिए क्रमश: शेष सेल मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 3,000 ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) एक झूलते बाल्टी रोटर में कम से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
  4. प्लाज्मा के घनत्व को मापने के निर्माण निर्देशों के अनुसार आरटी पर एक densitometer का उपयोग कर।
    नोट: घनत्व का समायोजन (डी = 1.023 g / एमएल) 0.9% खारा समाधान के साथ exosomes को हटाने की लेकिन घनत्व ढाल ultracentrifugation से पहले के बाद आवश्यक हो सकता है।
    5. 2. प्लाज्मा से Exosome निकालना

    1. घूम exosomes एक घनत्व एचडीएल के लिए इसी तरह की है कि निकालें और miRNA 3 के एक मात्रात्मक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं।
      1. 1 मिलीलीटर प्लाज्मा 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा करने के लिए 252 μl exosome वर्षा समाधान जोड़कर यह मत करो। exosomes बाहर गोली, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 जी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र।
      2. एचडीएल, घनत्व ढाल ultracentrifugation के साथ आगे की प्रक्रिया के लिए एक पॉली कार्बोनेट मोटी दीवारों ultracentrifuge ट्यूब के परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला के हस्तांतरण के 1 मिलीलीटर को अलग करने के लिए (नीचे देखें)।

    3. घनत्व ढाल ultracentrifugation (चित्रा 1)।

    1. अलग करने के लिए एचडीएल एक 3 कदम प्रक्रिया एक निश्चित कोण रोटर 448,811 एक्स जी पर परिचालन और 8 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः के साथ एक मंजिल ultracentrifuge रोजगार का उपयोग करें।
    2. तीन अलग अलग घनत्व समाधान क्रमिक रूप से और प्रत्येक अलगाव के लिए नए सिरे से तैयार करें।
      1. समाधान एक तैयार (वीएलडीएल के अलगाव, डी = 1.006 g / एमएल) 11.4 छ NaCl (NaCl: 0.195 मोल) भंग द्वारा autoclaved-आसुत जल के 1000 मिलीलीटर में, 0.1 ग्राम EDTA2Na और 1 मिलीलीटर 1N NaOH। तब autoclaved-आसुत जल की एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. समाधान बी तैयार (एलडीएल के अलगाव, डी = 1.182 g / एमएल) के 100 मिलीलीटर समाधान ए (NaCl 0.195 मोल, NaBr 2.44 मोल) के लिए 25.2 छ NaBr जोड़कर।
      3. समाधान एक की 100 मिलीलीटर (NaCl 0.195 मोल, NaBr 7.7 मोल) के साथ 78.8 छ NaBr मिश्रण से समाधान सी (एचडीएल के अलगाव, डी = 1.470 ग्राम / मिलीलीटर) तैयार करें। आरटी पर उचित घनत्व एक densitometer का उपयोग कर पुष्टि करें। आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान रखें।

    4. वीएलडीएल का अलगाव

    1. प्लाज्मा के 1 मिलीलीटर (औसत घनत्व = 1.023 g / एमएल) और nuclease मुफ्त 200 एक 6.5 मिलीलीटर पॉली कार्बोनेट मोटी दीवारों ultracentrifuge ट्यूब में वसा लाल 7B की μl मिक्स।
    2. तो ध्यान से मिश्रण की चोटी पर समाधान एक के 5 मिलीलीटर परत। यदि आवश्यक हो, समाधान एक टी के शीर्ष पर अतिरिक्त वसा लाल 7B जोड़नेओ प्रत्येक ट्यूब के वजन के संतुलन। - 2 घंटा (5 त्वरण) के लिए अपकेंद्रित्र (मंदी - 7)।
      नोट: centrifugation के दौरान, लिपो प्रोटीन उनकी संतुलन घनत्व क्षेत्रों में एक बैंड के रूप में जमा कर रहे हैं।
    3. चलाने के अंत में 2 परतों निरीक्षण करते हैं। वीएलडीएल अंश 4 डिग्री सेल्सियस पर शीर्ष स्तर और दुकान का प्रतिनिधित्व करने के 1.5 मिलीलीटर निकालें।
    4. अंत में, एलडीएल युक्त ट्यूब के नीचे से एक विंदुक हस्तांतरण 4 मिलीलीटर का उपयोग कर, एचडीएल, एलडीएल एल्बुमिन और अलगाव के लिए एक नया पॉली कार्बोनेट ट्यूब के लिए फैटी एसिड अंश।

    5. एलडीएल का अलगाव

    1. क्रमशः समाधान बी और 100 μl nuclease मुफ्त वसा लाल 7B के 2 मिलीलीटर मिक्स, एलडीएल और एचडीएल अंश (धारा 4) युक्त ट्यूब में।
    2. फिर 3 घंटा (त्वरण 9, मंदी 7) के लिए बाहर अपकेंद्रित्र। इसके बाद, एलडीएल अंश ऊपर परत का प्रतिनिधित्व करने के 1.5 मिलीलीटर हटाने और -80 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस या दुकान पर रहते हैं। अंत में, एचडीएल युक्त ट्यूब के नीचे से 4 मिलीलीटर हस्तांतरणएक नए पॉली कार्बोनेट ट्यूब के अंश।

    6. एचडीएल का अलगाव

    1. समाधान सी के 2 मिलीलीटर, 100 μl nuclease मुफ्त वसा लाल 7B और, एचडीएल अंश युक्त क्रमशः ट्यूब में 98% β-mercaptoethanol के 15 μl मिक्स।
    2. 3 घंटा (त्वरण 9, मंदी 7) के लिए अपकेंद्रित्र। इसके बाद शीर्ष स्तर का प्रतिनिधित्व एचडीएल अंश के 2 मिलीलीटर हटाने और या तो 4 डिग्री सेल्सियस पर या -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान रहते हैं।

    7. Desalting और लिपोप्रोटीन भागों की एकाग्रता

    1. बाद में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और पीसीआर के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए, अत्यधिक नमक उपयुक्त आणविक वजन कटऑफ (वीएलडीएल और एलडीएल / एचडीएल के लिए 10K ट्यूब के लिए 3K ट्यूब) के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों के रूप में निर्माता के निर्देशों के द्वारा वर्णित का उपयोग कर घनत्व ढाल ultracentrifugation के दौरान जोड़ा गया निकालें।
      1. संक्षेप में, 2.5 मिलीलीटर जोड़ने ठंड पीबीएस (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 8 मिमी Na2HPO4, 2 मिमी KH2PO4, पीएच 7.4) के बाद Centrifuजीई पूरे वीएलडीएल अंश 60 मिनट के एक झूलते बाल्टी रोटर प्रयोग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र-दौरान घनत्व ढाल ultracentrifugation।
      2. 30 मिनट प्रत्येक के लिए 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस के साथ दो बार एलडीएल अंश फीका बनाना। अगले, एचडीएल अंश Desalting के लिए दो बार 13 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस का प्रयोग करें। उच्च पीबीएस मात्रा agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ गतिशीलता में सुधार करने के लिए आवश्यक है। centrifugation के बाद, लिपोप्रोटीन युक्त विलेय को हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।

    8. agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

    1. लिपोप्रोटीन agarose जेल वैद्युतकणसंचलन निर्माता के निर्देशों के मामूली संशोधनों के साथ किट के रूप में निम्नानुसार रोजगार perfrom।
      नोट: यह कदम सिर्फ गुणवत्ता और केंद्रित लिपोप्रोटीन नमूनों की पवित्रता का आकलन करने के लिए है।
      1. संक्षेप में, घनत्व ढाल ultracentrifugation साथ desalted लिपोप्रोटीन अंश के 6 μl प्राप्त करने और एक पूर्व डाली लिपोप्रोटीन जेल पर लोड। मानव lipop का प्रयोग करेंVLDL, एलडीएल और एचडीएल आकार संदर्भ के रूप में के लिए rotein मानकों। बाहर 60 मिनट के प्रतिनिधि प्रस्तुत करने का बफर का उपयोग करने के लिए 100 वी पर आरटी पर वैद्युतकणसंचलन ले।
      2. 10 मिनट के लिए जेल सूखी और फिर वसा लाल 7B साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए दाग। 5 मिनट के लिए फिर से मेथनॉल-पानी 75:25 (वी / वी) और सूखे का एक मिश्रण में जेल Destain।

    9. आरएनए निष्कर्षण और शोधन

    1. सीरम / प्लाज्मा miRNA अलगाव और शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध मानव एचडीएल द्वारा miRNA के अलगाव perfrom।
      1. संक्षेप में, शुद्ध एचडीएल के 200 μl के लिए आरएनए सेल अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, एक vortexer के साथ मिश्रण है और फिर nucleoprotein परिसरों और RNases की निष्क्रियता की पूरी हदबंदी सुनिश्चित करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए incubated।
      2. मिश्रण में; (1.6 x 10 8 प्रतियां / μl सेल-मीर 39) तब सिंथेटिक Caenorhabditis एलिगेंस microRNA के 3.5 μl स्पाइक। फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार शाही सेना निष्कर्षण के लिए बाहर ले।
    2. purificati प्रदर्शन करनानिर्माता के निर्देशों के अनुसार Elute स्पिन स्तंभों के साथ निकाली-miRNA के पर। एक spectrophorometer साथ शुद्ध एचडीएल से miRNA की एकाग्रता को मापने।
      नोट: स्पिन स्तंभों से miRNA के क्षालन RNase मुक्त पानी के 16 μl कार्यरत हैं।

    10 रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी पीसीआर)

    1. एचडीएल से miRNA के 100 एनजी पृथक सिंथेटिक miRNA (सेल-मीर 39) और एक 20 μl प्रतिक्रिया मात्रा रिवर्स प्रतिलेखन किट रोजगार और निर्माता के निर्देशों के अनुसार में रिवर्स लिखित साथ नुकीला।
    2. टेम्पलेट miRNA (एनटीसी) के बिना और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम मिश्रण (NRT) के बिना उचित नियंत्रण प्रदर्शन करना।

    11. वास्तविक समय पीसीआर (QRT- पीसीआर)

    1. सीडीएनए के 2 कमजोर पड़ने, 10 μl पीसीआर मिश्रण, 2 μl सार्वभौमिक प्राइमर, miRNA प्राइमरों के 2 μl और 4 μl RNase मुक्त पानी: एक 1 का 2 μl के साथ 20 μl की कुल मात्रा में perfrom वास्तविक समय पीसीआर।
    2. reacti भागो15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह प्लेटें, 15 सेकंड और 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 30 के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तार के चरण के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्रों के बाद में triplicates में सभी प्रतिक्रियाओं perfrom s.ec ।
    3. अगले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिंथेटिक गृह व्यवस्था जीन को सामान्य बनाने के बाद 2 -ΔΔ सीटी विधि का उपयोग कर miRNA के calcuate रिश्तेदार मात्रा।

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Representative Results

उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन के अलगाव Exosomes को हटाने के बाद
उच्च शुद्ध एचडीएल से miRNA प्राप्त करने के लिए यह exosomes कि miRNA संदूषण 7 का एक स्रोत का प्रतिनिधित्व दूर करने के लिए आवश्यक है। यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ घनत्व ढाल ultracentrifugation से पहले किया गया था। व्यावहारिक प्रयोजनों के लिए वाणिज्यिक कंपनी द्वारा विकसित एक तीन कदम मानक घनत्व ढाल ultracentrifugation प्रोटोकॉल (चित्रा 1) संशोधित किया गया था। इस प्रोटोकॉल 140,000 आरपीएम की गति एक निश्चित कोण रोटर जो काफी हद तक 54,000 आरपीएम 3, 8, 9, और 10 से ऊपर centrifugation बलों के साथ आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से भी तेज है साथ centrifugation की आवश्यकता है। एक के साथ एक व्यापक रूप से उपलब्ध टी 1270 रोटर को रोजगार 70,000 आरपीएम की अधिकतम शक्ति, centrifugation शुरू में polyallomer ट्यूब जो centrifugation ताकतों का विरोध करने में विफल रहा है के साथ बाहर किया गया था। ट्यूबों के पतन से बचने के लिए,पॉली कार्बोनेट नलियों सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया। Centrifugation समय लिपोप्रोटीन ऑक्सीकरण और संभावित miRNA गिरावट 11 के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए कई अलग अलग centrifugation टाइम्स, 8 से 96 घंटे की कुल से लेकर परीक्षण किया गया। इसके अलावा तापमान जिस पर centrifugation बाहर किया गया था centrifugation समय और बल, क्रमशः के आधार पर समायोजित किया गया।

उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन भागों की पवित्रता
पृथक उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन अंशों की पवित्रता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ की जाँच कर रहे थे। चित्रा 2 ढाल ultracentrifugation द्वारा पृथक एचडीएल घटाव के लिए एक विशिष्ट वैद्युतकणसंचलन परिणाम दिखाता है। यह स्पष्ट रूप से पता चला है कि एचडीएल वीएलडीएल के किसी भी संक्रमण से रहित था और ठेठ α-गतिशीलता को दर्शाती है। वीएलडीएल और एलडीएल भागों में किसी भी α-पलायन लिपो प्रोटीन के अभाव ultracent दौरान एचडीएल से पूरी तरह ठीक होने को दर्शाता हैrifugation कदम है। एचडीएल अंश है, तथापि, यह भी β-गतिशीलता, एक ज्ञात electrophoretic बैंडिंग पैटर्न के कुछ ट्रेस लिपो प्रोटीन के साथ संदूषण (एलपी (ए)) 12 के कारण दिखाया।

पृथक एचडीएल से एलपी (ए) के उन्मूलन
एचडीएल में किया miRNAs का अध्ययन उच्चतम शुद्धता की एचडीएल के अलगाव की आवश्यकता है। एल.पी. के हस्तक्षेप (क) एचडीएल के साथ संभावित एलडीएल में किया miRNAs साथ एचडीएल के पार संदूषण के लिए योगदान देता है। एचडीएल के इस प्रदूषण को कम करने के लिए, β-mercaptoethanol 10 के 15 μl पिछले centrifugation कदम (चित्रा 1) के दौरान समाधान सी के लिए जोड़ा गया है। Β-mercaptoethanol के अलावा एचडीएल घनत्व गुण 10 बदलने के लिए नहीं दिखाया गया है। के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, β-mercaptoethanol के अलावा एलपी (ए) का बहुत प्रभावी हटाने के साथ सुसंगत किसी भी बी-पलायन लिपो प्रोटीन के अभाव में हुई।

miRNA के शोधन एचडीएल से
miRNA के अलगाव शुरू में रोजगार सेल अभिकर्मक जो आमतौर पर खून से शाही सेना निकासी के लिए प्रयोग किया जाता है प्रयास किया गया था। हालांकि इस पद्धति एक बहुत अच्छा शाही सेना उपज (91.45 एनजी / μl) में है, लेकिन बाद हुई spectrophotometric विश्लेषण असंतोषजनक आरएनए पवित्रता दिखाया। फिनोल को हटाने के द्वारा पृथक शाही सेना के अतिरिक्त शुद्धि शुद्धता में सुधार हुआ है, लेकिन शाही सेना उपज अब काफी कम था। इसके बाद, एक और किट परीक्षण किया गया था जो स्वीकार्य आरएनए शुद्धता (1.7 260/280 एनएम अनुपात), लेकिन शाही सेना उपज 26 गुना कम सेल अभिकर्मक (3.45 बनाम 91.45 एनजी / μl) के साथ तुलना की गई थी दिखाया। एक अच्छी उपज के साथ स्वीकार्य आरएनए शुद्धता के लिए सबसे अच्छा परिणाम miRNeasy सीरम / प्लाज्मा किट के साथ प्राप्त किया गया (48.2 एनजी / μl; 1.6 260/280 एनएम अनुपात) और इसलिए इस निष्कर्षण प्रक्रिया बाद में अलग से miRNA का पता लगाने के लिए नियुक्त किया गया था एचडीएल लिपोप्रोटीन अंश।

3 के कार्गो में पहचान की थी और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल तेज 5 को दबाने के लिए दिखाया गया था। चित्रा -4 ए। मीर 223 के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया और अनुकूलन के बाद आधारभूत दहलीज और दहलीज चक्र मूल्यों की तुलना प्रवर्धन घटता की एक विशेष लॉग साजिश से पता चलता नुकीला में Cel-मीर-39। वहाँ के रूप में प्लाज्मा में miRNA के लिए जाना जाता है सामान्यीकरण के नियंत्रण की कोई रिपोर्ट नहीं हैं इस कृत्रिम जीन आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, RNU6-2, RNU-48 की तरह कई संभावित स्थापित अंतर्जात गृह व्यवस्था जीन, HY3 पता लगाया नहीं जा सकता है और SNORD95 शुद्ध एचडीएल में पता लगाया जा सकता है, लेकिन, मीर 223 और SNORD95 की सीटी मूल्यों में अंतर पांच से कम है ( डाटा नहीं दिखाया गया)। पिघलने वक्र विश्लेषण चित्रा 5 में सचित्र स्पष्ट रूप से एक अलग ही पता चलता हैशिखर पूर्ववर्ती पीसीआर में एक चयनात्मक miRNA के प्रवर्धन के साथ संगत। जैसा कि चित्र 4 बी। में सचित्र, दोनों मीर 223 और संदर्भ Cel-मीर -39 लगातार सभी छह समर्थक बैंड में पता लगाया जा सकता है। सभी व्यक्तियों के बीच अपेक्षाकृत छोटे बदलाव मीर 223 के साथ तुलना में Cel-मीर-39 के लिए मनाया गया। इन निष्कर्षों को उच्च शुद्धता पर एचडीएल के अलगाव का समर्थन अपने miRNA माल का पता लगाने की अनुमति है।

शुद्ध एचडीएल में मीर 223 की जांच
वास्तविक समय पीसीआर मात्रात्मक विधि भी कतरा miRNA करने के लिए डबल बाल के लिये कांटा-संरचना miRNA व्यापारियों यों इस्तेमाल किया गया था। इस पद्धति का एक आगे / रिवर्स जीन विशिष्ट प्राइमरों और एक थर्मास्टाइबल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस सीडीएनए miRNA के बाल के लिये कांटा संरचना बदलने की जरूरत है। सीडीएनए बाद में परिलक्षित और SYBR हरे रंग का पता लगाने की मदद से वास्तविक समय qPCR का उपयोग मात्रा गया था। सीरम, प्लाज्मा और शुद्ध एचडीएल प्लाज्मा से MicroRNA सही हो सकता है प्रोफ़ाइलएड miRNA आरटी पीसीआर प्रणाली का उपयोग करते हुए।

हमारा मतलब मीर 223 जीन अभिव्यक्ति की प्रयोगात्मक उत्पाद शुद्ध एचडीएल में 30.9 की एक सीटी मूल्य से पता चला है और अपनी इसी नकारात्मक नियंत्रण कट ऑफ 35 से ऊपर थे (एनटीसी = 38.1 सीटी मूल्य, NRT और एनएसी परिलक्षित नहीं थे)। इस प्रयोग में, हम कम तापमान के पिघलने के साथ प्राइमर-डिमर के गठन शुद्ध एचडीएल नमूनों में देखा था (75.5 डिग्री सेल्सियस मीर 223 में 73 डिग्री सेल्सियस और Cel-मीर 39) और विशिष्ट miRNA assays की तुलना में अधिक सी टी मूल्य (तालिका 1)। तालिका 1 में प्राइमर dimers शायद समाधान में प्राइमरों के उच्च एकाग्रता की वजह से होते हैं। यह तब होता है जब ज्यादातर प्राइमर अणुओं 30 पीसीआर चक्र 13 के बाद एक दूसरे को देते हैं। इससे उन्हें अन्य प्राइमर अणुओं को और प्रभाव में पानी रखना रेखीय मिनी टेम्पलेट्स हो जाते हैं और यह उच्च पृष्ठभूमि के कारण होगा और सी टी मूल्य <एनटीसी के लिए 40 की एक पीढ़ी को जन्म दे सकती (कोई templat की अनुमति देता हैई नियंत्रण) नमूने हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. एचडीएल अलगाव की प्रक्रिया की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एचडीएल तीन centrifugation कदम की एक श्रृंखला में घनत्व ढाल ultracentrifugation द्वारा तैयार किया गया था। लिपोप्रोटीन बैंड और घनत्व ढाल में मध्यवर्ती भागों का वितरण सचित्र हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. agarose जेल β-mercaptoethanol के बिना पृथक लिपो प्रोटीन के वैद्युतकणसंचलन। VLDL, घनत्व ढाल ultracentrifugation द्वारा पृथक एलडीएल और एचडीएल अंशों समाधान सी demonst को β -mercaptoethanol जोड़ने के बिनाएचडीएल अंश में एलपी (ए) की उपस्थिति दर। लेन 1, 2, 9, 10 और प्रत्येक आकार मार्कर का प्रतिनिधित्व करते हैं; लेन 3/4, 5/6 और 7/8 क्रमश VLDL, एलडीएल और एचडीएल प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. agarose जेल β-mercaptoethanol के साथ अलग। पिछले centrifugation कदम से पहले समाधान के लिए सी β -mercaptoethanol जोड़ना एचडीएल की वैद्युतकणसंचलन एचडीएल अंश से एलपी (ए) को हटाने में हुई। लेन 1, 2, 9 और 10 प्रत्येक आकार मार्कर का प्रतिनिधित्व करते हैं; लेन 3-8 प्रतिनिधित्व एचडीएल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4. दो अलग-अलग miRNAs की प्रवर्धन साजिश और Cel-मीर 39 और मीर-223 की अभिव्यक्ति। (ए) वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर पृथक एचडीएल को रोजगार के रूप में वर्णित किया गया। पीसीआर 45 चक्र और बात जिस पर वक्र intersects दहलीज सी टी -Value है के लिए चलाया गया था। डेटा की अभिव्यक्ति दिखाने Cel-मीर 39 (बाएं पैनल) और मीर-223 (सही पैनल), क्रमशः। क्षैतिज रेखा का पता लगाने सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। 35 का एक चक्र संख्या सकारात्मक प्रवर्धन के लिए कटऑफ के रूप में स्थापित किया गया था। (बी) 6 नमूनों से प्राप्त पृथक एचडीएल से प्रतिनिधि वास्तविक समय पीसीआर डेटा दिखाए जाते हैं। कच्चे मतलब सीटी मूल्यों Cel-मीर 39 और मीर-223, जिनकी अभिव्यक्ति के स्तर से कम 2 सीटी एक अलग दाता से 6 नमूने, प्रत्येक के बीच शुद्ध एचडीएल प्लाज्मा अंश में मूल्य भिन्न के लिए दिखाए जाते हैं। अभिव्यक्ति की रूपरेखा पीसीआर प्रणाली और मानव सीरम और प्लाज्मा miRN उपयोग किया गया थाएक QRT- पीसीआर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. Cel-मीर 39 और मीर-223 के लिए पिघलती घटता। के रूप में सचित्र, एक भी चोटी की उपस्थिति Cel-मीर 39 (सही पैनल) और मीर-223 (बाएं पैनल), क्रमशः के विशिष्ट प्रवर्धन इंगित करता है। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
सिंथेटिक सेल-मीर-39 के नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण और मीर-223 सीरम, प्लाज्मा, सीडीएनए में विशेषता है, और शुद्ध एचडीएल अंश की तालिका 1। पंक्ति सी टी मूल्य। एनटीसी (कोई templatई नियंत्रण), NRT (कोई रिवर्स प्रतिलेखन एंजाइम), एनएसी (कोई प्रवर्धन नियंत्रण, केवल पानी और QRT- पीसीआर की अभिकर्मकों)।

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Discussion

खून से उपन्यास बायोमार्कर की पहचान नैदानिक ​​निदान और विभिन्न रोगों के रोग का निदान में सहायता करेगा। MicroRNAs बायोमार्कर के सभी गुणों के अधिकारी के लिए जाना जाता है और विभिन्न अध्ययनों 14-17 में दिखाया गया है। इस अध्ययन में हम प्लाज्मा एचडीएल से miRNA को अलग-थलग करने के लिए तेजी से और सरल आसान विधि का प्रदर्शन किया है। VLDL, एलडीएल और एचडीएल के अलगाव की पारंपरिक घनत्व ढाल अल्ट्रा centrifugation विधि प्लाज्मा के सटीक नमूना, बफर समाधान की सटीक तैयारी, घनत्व वाले लिपोप्रोटीन और नीचे अंशों 8 की मात्रात्मक हस्तांतरण की माप पर निर्भर करता है। वहाँ कई तरीके है कि एचडीएल 8 -11 को अलग-थलग करने के लिए वर्णित किया गया है। इन विधियों अक्सर या तो बहुत श्रमसाध्य हैं या प्लाज्मा और desalting पृथक लिपो प्रोटीन के लिए व्यापक डायलिसिस की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है और पूरी तरह से miRNAs 3 के एक स्रोत के रूप में exosomes और लिपो प्रोटीन दूर नहीं है। इन कमियों को हम इस सी की स्थापना की है संबोधित करने के लिएmple और प्लाज्मा एचडीएल से miRNA के अलगाव की तेजी से विधि।

मुख्य लक्ष्य है और इस अध्ययन के प्राथमिक उद्देश्य अलग है और लाल रक्त कोशिकाओं के बिना ultracentrifugation द्वारा एचडीएल miRNA जटिल अलग करने के लिए किया गया था, बफी कोट, exosomes, स्रावी पुटिकाओं, VLDL, एलडीएल और लिपो प्रोटीन (क) हस्तक्षेप, तो शुद्ध एचडीएल से miRNAs अलग। संदूषण और एचडीएल के साथ इन घटकों में से किसी का हस्तक्षेप की उम्मीद प्रयोगात्मक परिणामों और miRNA रूपरेखा डेटा बदल जाएगा। खून से डीएनए, आरएनए और miRNAs के अलगाव इसकी जटिल प्रकृति की वजह से एक बहुत ही मुश्किल काम है। यह हमेशा के लिए न्यूक्लिक एसिड (सहित miRNAs) निष्कर्षण और शुद्धि कोशिकाओं, ऊतकों और अंग नमूने 18 की तुलना करने के लिए तकनीकी चुनौतियों का बहुत कुछ के साथ समक्ष रखी गई है। इसके अलावा वहाँ अपेक्षाकृत कम miRNA रक्त कोशिकाओं घूम में मौजूद जीन हैं। रक्त exosomes, स्रावी vesicles और मुक्त घूम miRNAs के साथ HDLs, जो अपेक्षाकृत कम 18 कर रहे हैं के लिए एक ज्ञात वाहक है। इसलिए, बड़ा एकरक्त प्लाज्मा नमूना मात्रा के पहाड़ प्रसंस्करण और एचडीएल miRNA परिसर के अलगाव के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, miRNAs और अपने लक्ष्य दृश्यों की लघु प्रकृति यह और भी मुश्किल मानक पीसीआर oligonucleotide प्रौद्योगिकियों के साथ पर्याप्त विशिष्टता प्राप्त करने के लिए बनाता है। खून की सेलुलर घटकों हमेशा जवाब में miRNA और mRNA छिपाना तापमान, सूक्ष्मजीवों और विषाक्त पदार्थों या तनाव सहित बाहरी वातावरण में बदलने के लिए जानते हैं। इसके अलावा न्युक्लिअसिज़, RNases, घूम प्रोटीन और अन्य एंजाइमों रक्त में की उपस्थिति इन miRNA अलगाव को प्रभावित करेगा।

QRT- पीसीआर की ΔΔCt पद्धति का उपयोग करते हुए घूम miRNA प्रवर्धन भी β-actin या डेटा सामान्य बनाने के लिए GAPDH की तरह एक अच्छी तरह से स्थापित जाना जाता गृह व्यवस्था जीन का अभाव है। यह फिर से रक्त सीरम या प्लाज्मा 19 घूम से रूपरेखा miRNA के लिए बड़ी बाधा में से एक बन गया है। आमतौर पर छोटे गैर कोडिंग snoRNAs इस्तेमाल किया और snRNAs शायद ही कभी खून और इस मीटर में व्यक्त कर रहे हैंयह आगे उन्हें आंतरिक नियंत्रण जीन के रूप में उपयोग में मुश्किल akes। snoRNAs और snRNAs के इन दोष हल करने के लिए और किसी भी तकनीकी कठिनाइयों हम आंतरिक नियंत्रण जीन के रूप में assays में सीरम / प्लाज्मा सिंथेटिक कील में नियंत्रण इस्तेमाल के रूप में निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पीछा से बचने के लिए। यह किसी भी अविशिष्ट प्रवर्धन के लिए सामान्य बनाने में मदद करता है और miRNA शुद्धि और पीसीआर प्रतिक्रिया 18 के दौरान परिवर्तन हुआ। यहाँ तक कि miRNA की गिरावट या किसी विशिष्ट miRNA प्रवर्धन संकेतों के अभाव के मामले में, कील में नियंत्रण QRT- पीसीआर प्रतिक्रियाओं में बढ़ाना और एक हद तक निरंतर और एक समान सीटी मूल्य के साथ एक उम्मीद संकेत देना चाहिए। तीन नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के साथ नियंत्रण प्रवर्धन में कील के आधार पर हम मीर 223 जीन के लिए अच्छा इष्टतम डेटा मान्यता मिल गई। इस बात की पुष्टि की है कि हम इस सरल विधि से प्लाज्मा एचडीएल घूम से मीर 223 की अच्छी उपज मिल गया है।

अंत में, हम एक विधि ओ की स्थापना की हैएफ घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC) प्लाज्मा एचडीएल से miRNA की शुद्धि के लिए β-mercaptoethanol के अलावा के साथ। विधि के कई फायदे हैं: (क) VLDL, एलडीएल और एचडीएल मंजिल ultracentrifuge से समय की एक छोटी अवधि के भीतर अलग हो रहे हैं अन्य तरीकों कि 24 की जरूरत के लिए तुलना - 96 घंटा के 8-11; (ख) एलडीएल और एचडीएल डायलिसिस, desalting / ध्यान दे, 1 घंटा के भीतर जगह ले अन्य तरीकों कि 24 या उससे अधिक घंटे 8,9 ली के साथ तुलना; (ग) लिपो प्रोटीन के संदूषण एचडीएल अंश में β-mercaptoethanol द्वारा हटा दिया जाता है, लेकिन एलडीएल अंश में इस्तेमाल किया जा करने का इरादा नहीं है; (घ) नमूना आवश्यक मात्रा सभी चरणबद्ध VLDL, एलडीएल के लिए केवल 1 मिलीलीटर है और एचडीएल isolations अन्य तरीकों कि अधिक नमूना मात्रा की जरूरत के साथ तुलना; (ई) यह अलगाव 11 के दौरान एचडीएल को कम से कम oxidative नुकसान; (च) 12 नमूनों की एक अधिकतम एक भी लिपोप्रोटीन जुदाई विश्लेषणात्मक समय में विश्लेषण किया जा सकता है; (G) निकाले एचडीएल के 250 μl नमूना मात्रा मीटर का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त हैIRNA एकाग्रता / शुद्धता, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, प्रोटीन एकाग्रता, माइक्रोएरे और RT-qPCR प्रक्रियाओं। हमारे विधि की सीमाओं एचडीएल miRNA के छोटे प्रतिशत exosome वर्षा चरण के दौरान खो सकते हैं और आवश्यक प्लाज्मा नमूना मात्रा को अलग-थलग करने के लिए एचडीएल miRNA 200 से अधिक μl होना चाहिए।

अंत में, प्लाज्मा microRNAs केवल संचलन में क्षतिग्रस्त या पाखण्डी रक्त कोशिकाओं से लेकिन यह भी स्वस्थ सामान्य रक्त कोशिकाओं और शरीर जो विभिन्न स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों और अंगों शरीर के चल रहे स्वास्थ्य की स्थिति से प्रभावित हैं के अन्य भागों से कोशिकाओं से व्युत्पन्न नहीं कर रहे हैं 20. यह वर्तमान अध्ययन व्यवस्थित मानव प्लाज्मा के अलग एचडीएल से परिपक्व मीर 223 शुद्ध गया है। इस अध्ययन में यह स्पष्ट रूप से दर्शाता उच्च शुद्ध एचडीएल प्लाज्मा में परिपक्व मीर 223 के स्तर, detectable स्थिर, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और व्यक्तियों के बीच नमूना संगत कर रहे हैं कि, जिससे बहुत लिपो प्रोटीन, ली के लिए भविष्यकाल परीक्षण के नैदानिक ​​इस्तेमाल की सुविधादेखें, हृदय और अन्य चयापचय सिंड्रोम। हैरानी की बात है, परिपक्व miRNAs, विशेष रूप से मीर 223 एचडीएल प्लाज्मा से शायद पाचन और अन्य कठोर परिस्थितियों जो संभवतः शुद्ध एचडीएल में मीर 223 की स्थिरता को समझाने nuclease लिए प्रतिरोधी रहे हैं। RNases को मीर 223 के प्रतिरोध की व्यवस्था आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। जाहिर है, इन शुद्ध एचडीएल प्लाज्मा में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन विभिन्न विकृतियों के अध्ययन में भविष्य miRNA मार्करों पर प्रकाश डाला जाएगा। प्लाज्मा में ये एचडीएल जुड़े microRNAs एक संभावित नैदानिक ​​नैदानिक ​​बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और भविष्य में दवा व्यक्तिगत।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन अलगाव घनत्व ढाल ultracentrifugation प्लाज्मा microRNA exosomes
फास्ट और सरलीकृत उच्च शुद्ध उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन से miRNA के उच्च माध्यम से रखा अलगाव के लिए विधि
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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H.… More

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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