Summary
MicroRNAs играют важную регулирующую роль и появляются в качестве новых терапевтических мишеней для различных заболеваний человека. Было показано, что микроРНК осуществляется в липопротеинов высокой плотности. Мы разработали упрощенный метод, чтобы быстро изолирует очищенный HDL, подходящий для анализа микроРНК из плазмы крови человека.
Protocol
1. Сбор проб крови
- Сбор натощак периферической венозной пробы крови в 10 мл пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (который имеет несколько преимуществ по сравнению с другими антикоагулянтами) стандартными венепункции видного вены в локтевую ямку.
- Центрифуга образцов крови при 1600 х г в течение 20 мин при 4 ° С в настольной центрифуге, чтобы получить свободный от красных кровяных клеток и небольших количеств РНК плазмы.
- Последовательная центрифугировать супернатант при 3000 г (4 ° C) в качающемся роторе в течение 10 мин, чтобы удалить WBC & тромбоциты и затем еще 15 мин, чтобы удалить остатки клеточных остатков соответственно.
- Измерение плотности плазмы с помощью денситометра при КТ в соответствии с инструкциями изготовления.
Примечание: Регулировка плотности (d = 1,023 г / мл) с 0,9% солевом растворе может потребоваться после удаления экзосомы, но до градиента плотности ультрацентрифугирования. 2. экзосома Удаление из плазмы - Удалите циркулирующие экзосомы , которые имеют плотность , аналогичную HDL и представляют собой количественно важный источник микроРНК 3.
- Это можно сделать, добавив 252 мкл раствора осаждения экзосом до 1 мл плазмы с последующей инкубацией в течение 30 мин при 4 ° C. Чтобы осадить вне экзосомы, центрифугировать смесь в течение 30 мин при 1500 г при температуре 4 ° С.
- Для выделения HDL, перенос 1 мл полученного супернатанта к поликарбонатным толстостенные ультрацентрифуге трубки для дальнейшей обработки с градиентом плотности ультрацентрифугирования (см ниже).
- Для того, чтобы отделить HDL использовать 3-х шаговый использующую пол ультрацентрифуге с фиксированным углом ротора работает на 448,811 х G и 8 ° C, соответственно.
- Подготовьте три различных решения плотности последовательно и годной для каждой изоляции.
- Приготовьте раствор A (выделение ЛПОНП, d = 1,006 г / мл) путем растворения 11,4 г NaCl (NaCl: 0,195 моль), 0,1 г EDTA2Na и 1 мл 1 N NaOH в 1000 мл автоклавного дистиллированной воды. Затем добавляют еще 3 мл автоклавного дистиллированной воды.
- Приготовьте раствор B (выделение LDL, D = 1,182 г / мл), добавляя 25,2 г NaBr на 100 мл раствора A (NaCl 0,195 моль, NaBr, 2,44 моль).
- Готовят раствор С (выделение ЛВП, d = 1,470 г / мл) путем смешивания 78,8 г NaBr с помощью 100 мл раствора А (NaCl, 0,195 моль, NaBr, 7,7 моль). Подтвердите соответствующую плотность при комнатной температуре, используя денситометр. Держите все решения при 4 ° С до дальнейшего использования.
- Смешайте 1 мл плазмы (средняя плотность = 1023 г / мл) и нуклеазные бесплатно 200 мкл жира Red 7В в 6,5 мл из поликарбоната толстостенной ультрацентрифуге трубки.
- Затем осторожно слой 5 мл раствора А на верхней части смеси. При необходимости, добавить дополнительный жир Red 7В на вершине раствора A TO уравновесить вес каждой трубки. Центрифуга в течение 2 ч (ускорение - 5), (замедления - 7).
Примечание: Во время центрифугирования, липопротеиды накапливаются как группа в своих регионах равновесной плотности. - В конце прогона наблюдать 2 слоя. Удалить 1,5 мл фракции липопротеинов очень низкой плотности, представляющего верхний слой и хранят при температуре 4 ° С.
- И, наконец, с помощью передачи пипетки 4 мл из нижней части трубы, содержащей ЛПНП, ЛПВП, альбумин и фракции жирных кислот в новый поликарбонатной трубки для изоляции ЛНП.
- Смешайте 2 мл раствора В и 100 мкл нуклеазы свободного жира Красный 7Б в пробирку, содержащую LDL и HDL фракции (раздел 4), соответственно.
- Затем центрифуге в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 1,5 мл ЛНП фракции, представляющей верхний слой и держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° С. И, наконец, передача 4 мл из нижней части трубы, содержащей HDLФракцию к новому поликарбонатной трубки.
- Смешайте 2 мл раствора С, 100 мкл нуклеазы свободного жира Red 7В и 15 мкл 98% бета-меркаптоэтанол в пробирку, содержащую фракцию HDL, соответственно.
- Центрифуга в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 2 мл HDL фракции, представляющие верхний слой и либо держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° C.
- Для того, чтобы избежать помех с последующим электрофорезом в агарозном геле и ПЦР, удалите избыток соли, добавляемой при градиенте плотности ультрацентрифугирования с использованием центробежных фильтров устройств с соответствующей молекулярной массой обрезания (3K трубки для ЛОНП и 10K трубки для LDL / HDL), как описано в инструкции изготовителя.
- Если коротко, то после добавления 2,5 мл PBS, холодный (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4; рН 7,4) centrifuGE вся ЛПОНП фракция, собранная-во градиенте плотности ультрацентрифугирования при температуре 4 ° С в течение 60 мин с использованием качающийся роторе.
- Обессоливания фракции LDL в два раза с 10 мл охлажденного льдом PBS в течение 30 минут каждый. Затем, с помощью 13 мл охлажденного льдом PBS дважды для обессоливания HDL фракции. Чем выше объем PBS необходимо улучшить подвижность с электрофореза в агарозном геле. После центрифугирования, удаления липопротеинов, содержащих растворенные вещества и держать при температуре 4 ° C или хранили при -80 ° C.
- Липопротеинов Выполнение проектно электрофореза в агарозном геле, использующую набор с незначительными модификациями инструкциями изготовителя следующим образом.
Примечание: Этот шаг только для оценки качества и чистоты концентрированных образцов липопротеинов.- Если коротко, то получим 6 мкл обессоленной фракции липопротеинов с градиентом плотности ультрацентрифугирования и загружают на липопротеина гель Сборный. Использование человеческого lipopСтандарты rotein для VLDL, LDL и HDL в качестве эталона размера. Проводят электрофорез при комнатной температуре при 100 V в течение 60 мин с использованием буфера Rep Prep.
- Сушат гель в течение 10 мин, а затем окрашивают в течение 10 мин при комнатной температуре с жиром Red 7В. Destain геля в смеси метанол-вода 75:25 (об / об) и сухой снова в течение 5 мин.
- Выполнение проектно изоляции микроРНК очищенным человеческим ЛВП с использованием набора сыворотка / плазма микроРНК выделения и очистки.
- Если коротко, то добавляют 1 мл реагента для лизиса РНК в 200 мкл очищенного HDL, смешать с вихревом смесителе и затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов и инактивации РНКазы.
- Затем шип 3,5 мкл синтетического Caenorhabditis Элеганс микроРНК (Cel-MIR-39; 1,6 × 10 8 копий / мкл) в смеси. Затем проводят экстракцию РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните purificatiна извлеченной-микроРНК с Элюции спиновых столбцов в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте концентрацию микроРНК из очищенного HDL с spectrophorometer.
Примечание: Вымывание микроРНК из спиновых колонн использовали 16 мкл РНКазы свободной воды. - Изолировать 100 нг микроРНК из HDL подсыпали синтетическим микроРНК (CEL-микроРНК-39) и обратной транскрипции в объеме реакционной смеси 20 мкл с использованием набора для обратной транскрипции и в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните соответствующие элементы управления без шаблона микроРНК (NTC) и без обратной смеси транскриптазы (НЗТ).
- Выполнение проектно-изыскательских ПЦР в реальном времени в общем объеме 20 мкл с 2 мкл 1: 2 разведения кДНК, 10 мкл ПЦР-смеси, 2 мкл универсальной грунтовки, 2 мкл микроРНК праймеров и 4 мкл РНКазы воды.
- Запуск Reactiна в 96-луночные планшеты при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 45 циклов при 94 ° С в течение 15 с и 55 ° С в течение 30 с и фазу удлинения при 70 ° С в течение 30 s.ec Выполнение проектно всех реакций при трехкратном повторе ,
- Далее, Calcuate относительные количества микроРНК с помощью метода 2 -ΔΔ Ct после нормализации к синтетического гена домашнего хозяйства в соответствии с инструкциями изготовителя.
3. Плотность Градиент Ультрацентрифугирование (Рисунок 1).
4. Выделение ЛПОНП
5. Выделение LDL
6. Выделение HDL
7. обессоливания и концентрации липопротеина фракций
8. Электрофорез в агарозном геле
9. Экстракция РНК и очистка
10. с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
11. ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выделение липопротеинов высокой плотности после удаления экзосомы
Для получения микроРНК с высокой степенью чистоты HDL необходимо удалить экзосомы , которые представляют собой источник загрязнения микроРНК 7. Это было сделано до градиенте плотности ультрацентрифугирования с коммерчески доступного набора. Для практических целей стандартный градиент плотности протокола ультрацентрифугирования три этапа , разработанный коммерческой компании был изменен (рисунок 1). Этот протокол требует , центрифугирование с фиксированным углом ротора со скоростью 140000 оборотов в минуту , который существенно быстрее , чем обычно используемые протоколы с центрифугирование силами до 54000 оборотов в минуту 3, 8, 9 и 10. Использующую широкодоступных Т-1270 ротор с максимальное усилие 70000 оборотов в минуту, центрифугирование первоначально проводили с polyallomer трубками, которые не в состоянии сопротивляться центрифугировании сил. Для того, чтобы избежать коллапса труб,поликарбонатные трубы были успешно использованы. Время Центрифугирование имеет решающее значение для липопротеинов окисления и потенциально деградации микроРНК 11. Поэтому были испытаны несколько различных времени центрифугирования, начиная от в общей сложности 8 до 96 часов. Кроме того температура, при которой центрифугирование проводили регулировали в зависимости от времени центрифугирования и силы, соответственно.
Чистота липопротеинов высокой плотности фракций
Чистота выделенных фракций липопротеидов высокой плотности были проверены с электрофорезом в агарозном геле. Рисунок 2. иллюстрирует типичный результат электрофореза для HDL вычитании изолированы путем градиентного ультрацентрифугирования. Он ясно показал, что HDL был лишен каких-либо загрязнений ЛОНП и имеет типичный альфа-мобильности. Отсутствие каких-либо альфа-мигрирующих липопротеинов в ЛОНП и ЛНП фракций демонстрирует полное восстановление от HDL в течение ultracentrifugation шаг. HDL фракции, однако, также показал некоторые следы бета-подвижности, известной электрофоретической рисунком обвязочной вследствие загрязнения липопротеинов (Лп (а)) 12.
Устранение Лп (а) от изолированного HDL
Изучение микроРНК, перевозимые в HDL требует изоляции HDL наивысшей чистоты. Вмешательство Лп (а) с HDL потенциально способствует перекрестного загрязнения ЛВП с микроРНК, переносимых в ЛПНП. Чтобы свести к минимуму это загрязнение HDL, 15 мкл бета-меркаптоэтанола 10 добавляли к раствору C в течение последней стадии центрифугирования (Рисунок 1). Добавление бета-меркаптоэтанола было показано , чтобы не изменить свойства плотности HDL 10. Как показано на рисунке 3. добавление -меркаптоэтанол привело к отсутствию каких - либо B-мигрирующих липопротеинов в соответствии с весьма эффективного удаления Лп (а).
Очистка микроРНК из HDL
Выделение микроРНК первоначально была предпринята попытка использующую лизирующий реагент, который обычно используется для выделения РНК из крови. Хотя этот метод приводит к очень хорошим выходом РНК (91,45 нг / мкл), но после того, как спектрофотометрический анализ показал неудовлетворительную чистоту РНК. Дополнительная очистка выделенной РНК путем удаления фенола улучшило чистоту, но выход РНК был теперь значительно низким. Далее, еще один комплект был испытан , который показал приемлемую чистоту РНК (260/280 нм коэффициент 1,7) , однако выход РНК в 26 раз ниже по сравнению с реактива для лизиса (3,45 против 91,45 нг / мкл). Наилучшие результаты для приемлемой чистоты РНК с хорошим выходом были получены с сыворотки / плазмы комплект miRNeasy (48,2 нг / мкл; соотношение 260/280 нм 1,6), и, следовательно, эта процедура экстракции была впоследствии использована для обнаружения микроРНК из Выделенную HDL фракции липопротеинов.
3 и было показано , что репрессировать HDL холестерина поглощение 5. Рисунок 4A. показывает типичный лог-график кривых усиления, сравнивающих эпидемический порог и порог цикла значения после оптимизации реакции ПЦР для MIR-223 и зубчатым в Cel-MIR-39. Этот синтетический ген был использован в качестве внутреннего контроля, поскольку нет никаких сообщений о нормализации известного контроля за микроРНК в плазме. Кроме того, несколько потенциальных установленных эндогенные гены домашнего хозяйства, такие как RNU6-2, РНЕ-48, HY3 могли быть не обнаружены и SNORD95 может быть обнаружен в очищенном HDL, но разница в значениях Ct СИК-223 и SNORD95 меньше пяти ( данные не показаны). Таяние анализ кривой показано на рисунке 5. ясно показывает отличный синглпик соответствует амплификации селективного микроРНК в предыдущей ПЦР. Как показано на рисунке 4B., И микроРНК-223 и эталонным Cel-Mir-39 последовательно могут быть обнаружены во всех шести профессиональных группах. наблюдались относительно небольшие вариации среди всех лиц для Cel-MIR-39 по сравнению с микроРНК-223. Эти данные подтверждают выделение ЛВП с высокой степенью чистоты, чтобы обнаружить его микроРНК груза.
Обнаружение микроРНК-223 в очищенном HDL
В реальном масштабе времени количественный метод ПЦР использовали для количественного определения двойной шпилька-структуры микроРНК предшественников к одножильному микроРНК. Этот метод требует вперед / назад ген-специфических праймеров и термостабильной обратной транскриптазы, чтобы преобразовать шпилька структуру микроРНК в кДНК. КДНК затем амплифицировали и определяли количественно, используя в режиме реального времени КПЦР с помощью зеленого обнаружения SYBR. МикроРНК из сыворотки, плазмы и очищенной плазмы HDL может быть точно Profilред использованием системы микроРНК ПЦР.
Наш экспериментальный продукт среднего экспрессии генов микроРНК-223 показал значение Ct 30,9 в очищенном HDL и его соответствующие отрицательные контроли были выше среза 35 (НТК = 38,1 значения Ct, НЗТ и NAC не амплифицировали). В этом эксперименте мы наблюдали в очищенных образцах HDL образование Primer-димера с низкой температурой плавления (73 ° С в MIR-223 и 75,5 ° C в Чел-микроРНК-39) и выше , C значение T , чем специфические микроРНК анализов (Таблица 1). Грунтовка-димеров в таблице 1. происходят , вероятно , из - за высокой концентрации праймеров в растворе. Это происходит , главным образом , когда праймер молекулы присоединять друг к другу после того, как 30 циклов ПЦР 13. Это позволяет им не отжечь с другими молекулами праймера и , по сути, становятся линейными мини-шаблоны , и это приведет к более высокого фона и может привести к генерации С Т значения <40 для NTC (Нет templatе) контроль образцов.
Рисунок 1. Схематическое представление процедуры HDL изоляции. ЛВП получали путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности в серии из трех этапов центрифугирования. Распределение липопротеинов полос и промежуточных фракций градиента плотности проиллюстрированы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Электрофорез в агарозном геле липопротеинов Изолированные Без -меркаптоэтанол. ЛОНП, ЛНП и ЛВП фракции , выделенные с помощью градиента плотности ультрацентрифугирования без добавления бета -mercaptoethanol к раствору C demonstоценить наличие Лп (а) в HDL фракции. Дорожки 1, 2, 9 и 10 представляют каждый маркер размера; Дорожки 3/4, 5/6 и 7/8 представляют собой VLDL, LDL и HDL соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Электрофорез в агарозном геле ЛВП изоляции с бета-меркаптоэтанола. Добавление бета -mercaptoethanol к решению C до последней стадии центрифугирования привело к удалению Лп (а) из HDL фракции. Дорожки 1, 2, 9 и 10, каждый, представляют маркер размера; Дорожки 3-8 представляют HDL. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Amplification Plot двух различных микроРНК и экспрессия Cel-MIR-39 и микроРНК-223. (А) в режиме реального времени с использованием количественной ПЦР изолированном HDL проводили, как описано. ПЦР проводили в течение 45 циклов и точкой , в которой кривая пересекает порог С Т -Value. Данные показывают экспрессию Cel-микроРНК-39 (левая панель) и микроРНК-223 (правая панель), соответственно. Горизонтальная линия представляет собой порог обнаружения. Ряд цикл 35 был установлен как для обрезания положительного усиления. (B) представитель ПЦР в реальном времени данные из изолированного ЛВП , полученного из 6 образцов показаны. Сырое средние значения Ct показаны для Cel-MIR-39 и MIR-223, уровни экспрессии которых различаются менее чем на 2 значения Ct в очищенной HDL фракции плазмы между 6 образцов, каждый из которых от другого донора. Выражение профилирование проводили с использованием ПЦР-системы и сыворотку & Plasma miRN HumanQRT-PCR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Кривые плавления для Cel-MIR-39 и микроРНК-223. Как показано, наличие одного пика указывает на специфическую амплификацию Cel-микроРНК-39 (правая панель) и микроРНК-223 (левая панель), соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Ряд C т значение отрицательного и положительного контроля синтетического Cel-MIR-39 и микроРНК-223 характеризуется в сыворотке, плазме, кДНК и очищенной фракции ЛПВП. Не NTC (Нет templatе управление), НЗТ (Нет обратной транскрипции фермента), NAC (Отсутствие контроля амплификации, только вода и реагенты из QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение новых биомаркеров из крови поможет в клинической диагностике и прогнозировании различных заболеваний. MicroRNAs уже известно, обладают всеми качествами биомаркеров и было показано в различных исследованиях 14-17 лет. В данном исследовании мы показали быстрый и простой простой способ изолировать микроРНК из плазмы HDL. Обычные градиенте плотности методом ультрацентрифугированием изоляции ЛОНП, ЛНП и ЛВП зависит от точного отбора проб плазмы, точного приготовления буферного раствора, измерение плотности и количественного переноса донных фракций липопротеидов 8. Существуют многочисленные методы , которые были описаны для выделения HDL 8 -11. Эти методы часто либо очень трудоемким или требуют большого объема плазмы и экстенсивного диализа для обессоливания изоляции липопротеинов и не полностью удалить экзосомы и липопротеинов в качестве источника микроРНК 3. Для устранения этих недостатков мы установили эту сиmple и быстрый способ выделения микроРНК из плазмы HDL.
Основная цель и основная цель этого исследования состояла в том, чтобы отделить и изолировать комплекс HDL-микроРНК посредством ультрацентрифугирования без эритроцитах, охристые пальто, экзосомы, секреторные везикулы, ЛОНП, ЛНП и липопротеинов (а) вмешательство, а затем изолируют микроРНК из очищенного HDL. Загрязнения и вмешательство любого из этих компонентов с HDL изменит ожидаемые результаты эксперимента и микроРНК профилирования данных. Выделение ДНК, РНК и микроРНК из крови является очень трудной задачей из-за его сложного характера. Она всегда была поставлена с большим количеством технических проблем для нуклеиновых кислот (включая микроРНК) экстракции и очистки по сравнению с клетками, тканями и образцов органов 18. Кроме того, существует относительно меньше генов микроРНК, присутствующие в циркулирующих клеток крови. Кровь является носителем для экзосомы, секреторных везикул и HDLs наряду со свободным циркулирующих микроРНК, которые являются относительно менее 18. Поэтому, чем крупнеемонтирование крови объема плазмы образца требуется для обработки и выделения комплекса HDL-микроРНК. Кроме того, короткая природа микроРНК и их последовательностей-мишеней, делает его даже трудно достичь достаточной специфичностью со стандартными технологиями олигонуклеотидных ПЦР. Клеточные компоненты крови всегда знают, секретируют микроРНК и мРНК в ответ на изменение во внешней среде, включая температуры, микроорганизмов и токсинов или стресса. Также наличие нуклеаз, РНКазами, циркулирующих белков и других ферментов в крови будет влиять на эти микроРНК изоляцию.
Циркулирующих микроРНК амплификации также не хватает хорошо налаженной известных генов домашнего хозяйства, такие как бета-актина или GAPDH для нормализации данных при использовании метода ΔΔCt из QRT-PCR. Это опять - таки представляет собой одну из важнейших препон для микроРНК профилирующих от циркулирующих в сыворотке крови или плазмы 19. Обычно используются короткие не являющиеся snoRNAs кодирования и snRNAs редко выражается в крови и этим мAKES его дальше трудно в использовании их в качестве генов внутреннего контроля. Для того, чтобы решить эти недостатки snoRNAs и snRNAs и избежать каких-либо технических трудностей, которые мы использовали синтетический Spike-В контрольной сыворотки / плазмы в анализах в качестве гена внутреннего контроля, как следует в соответствии с протоколом производителя. Он помогает в нормализации для любого неспецифической амплификации и изменения произошли во время очистки микроРНК и ПЦР - реакции 18. Даже в случае ухудшения микроРНК или отсутствие каких-либо конкретных сигналов амплификации микроРНК, спайк-контроль должен амплифицировать в реакции ПЦР-Qrt и дают ожидаемый сигнал с достаточно постоянной и равномерной величины Ct. На основе всплеску управления усилением вместе с тремя отрицательными контроля и положительного контроля мы получили хорошую оптимальную проверку данных для гена микроРНК-223. Это подтверждает, что мы получили хороший выход MIR-223 из циркулирующей плазмы HDL от этого простого метода.
В заключение, мы установили метод OF градиент плотности ультрацентрифугирования (DGUC) с добавлением бета-меркаптоэтанола для очистки микроРНК из плазмы HDL. Метод имеет ряд преимуществ: (а) ЛОНП, ЛНП и ЛВП разделены в течение короткого периода времени по этажу ультрацентрифуге по сравнению с другими методами , которые необходимы 24 - 96 ч 8-11; (б) LDL и HDL диализ, обессоливание / с концентрацией внимания, иметь место в течение 1 часа сравнить с другими методами , которые имели 24 или более часов 8,9; (В) Заражение липопротеинов удаляется с помощью бета-меркаптоэтанола в HDL фракции, но не предназначен для использования во фракции LDL; (D) Объем образца составляет всего 1 мл для всех ступенчатого ЛОНП, ЛНП и ЛВП обособления сравнению с другими методами, что нуждается в большем количестве объема пробы; (е) сведено к минимуму окислительное повреждение HDL в процессе выделения 11; (Е) не более 12 образцов могут быть проанализированы в рамках единого разделения липопротеинов аналитической перспективе; (Г) 250 мкл объем пробы добытой HDL достаточно, чтобы проанализировать мКонцентрация ИРНА / чистота, электрофорез в агарозном геле, концентрация белка, микрочипов и процедуры RT-КПЦР. Ограничения нашего метода является то, что небольшой процент HDL-микроРНК может потерять во время стадии осаждения экзосом и требуемый объем плазмы выборки должен быть больше, чем 200 мкл, чтобы изолирующие HDL-миРНК.
И, наконец, плазменные микроРНК не только получены из поврежденных или ренегатских клеток крови в кровотоке, а также от здоровых нормальных клеток крови и клеток из других частей тела, которое включает в себя различные здоровых и больных тканей и органов, пострадавших от текущего состояния здоровья организма 20. настоящее исследование систематически очищают зрелый MIR-223 из изолированного ЛВП плазмы крови человека. Это исследование ясно показывает, что уровни зрелых микроРНК-223 в высокой степени очистки плазмы HDL могут быть обнаружены, стабильные, воспроизводимые и последовательной среди индивидуумов образца, что существенно облегчает клиническое применение Futurity тестов для липопротеинов, Liвер, сердечно-сосудистые и другие метаболические синдромы. Удивительно, но зрелые микроРНК, в частности, микроРНК-223 из ЛВП плазмы, вероятно, устойчивы к нуклеазному расщеплению и других тяжелых условиях, которые потенциально объяснить стабильность микроРНК-223 в очищенной HDL. Механизм сопротивления MIR-223 к РНКазами требует дальнейшего изучения. Очевидно, изучая профили экспрессии микроРНК в этих очищенным HDL плазмы бы пролить свет на будущие маркеры микроРНК при изучении различных недугов. Эти HDL связаны микроРНК в плазме могут быть использованы в качестве потенциальных клинических диагностических биомаркеров и персонализированной медицины в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes | Becton, Dickinson and Company | 366643 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R | 75004261 | |
| Densito 30PX densitometer | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube | Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | Sigma-Aldrich | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | Helena Laboratories | 3344,3544T | |
| Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL | LipoTrol; Helena Laboratories | 5069 | |
| Rep Prep buffer | Helena Laboratories | 3100 | |
| RNeasy MinElute spin columns | Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 analyzer | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 Touch real-time PCR detection system | BioRad | ||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | 480878 | |
| 0.20 µM sterile syringe filter | SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
- Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
- Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
- Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
- Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
- Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
- Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
- Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
- Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
- Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
- Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
- Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
- Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
- Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).
