Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

Angiogenese er udløst af ekstracellulære signalering tidskoder, der fremmer endotelceller (EC'er) at polarisere, migrere med retningsbestemt specificitet, og danne nye vaskulatur i væv, der kræver blodforsyning. Medvirkende faktorer menes at drive angiogenese er signaler fra den ekstracellulære matrix (ECM). Som reaktion på de fysiske signaler, EC'er udvide nye filialer med retningsbestemt specificitet til at vejlede retningsbestemt bevægelse i dannelsen af det vaskulære netværk 1,2. Arkitekturen i EF morfologi og forgrening er defineret ved lokaliseret regulering af mikrotubuli (MT) cytoskeleton på en måde, der er koordineret med reguleringen af acto-myosin kontraktilitet 3. For EF grene til at danne, skal myosin-II være lokalt nedreguleret, hvilket resulterer i lokaliserede membran fremspring 4. På samme tid og på samme sted i cellen, bliver MT vækstdynamik ændret resulterer i langsom og vedvarende MT vækst for at fremme gren Elongelse og stabilitet fem. Denne koordinerede cytoskelet regulering giver EC'er til at polarisere deres morfologi at lette retningsbestemt migration.

Udviklingen af en polariseret celle morfologi kræver polariseret MT samling 6. Ved at migrere epitelceller MTS vokser langsomt og vedholdende specifikt på forkant af cellen 7-9; mens i neuroner, indledning og forlængelse af axoner eller dendritter kræver, at MTS er ikke kun til stede, men at de er dynamisk gennemgår processerne for montering og demontering 10-15. På denne måde, lokaliseret styring af MT vækstdynamikken bestemmer arkitekturen af ​​cellen og tillader hurtig remodellering af cellemorfologi som EC'er navigere gennem deres ECM.

MT vækstdynamik er reguleret af familier af molekylære motor proteiner og ikke-motoriske proteiner, kaldet mikrotubuli associerede proteiner eller mikrotubuli interagerende proteiner (herefter Referred til som Maps). MAP'er kan lokalt aktiveres eller inaktiveres, typisk gennem signaleringskaskader indledt ved cellepositionen ECM grænseflade 16,17. Når aktiv, Maps funktion ved binding til MT og ændring af kinetikken for MT samling og adskillelse; derved fungerer til lokalt regulere MT dynamik for at fremme celleform og polaritet 18-20. Mitotisk Centromer Associated kinesin (MCAK) er en kinesin-13 familie MAP som binder til MT ender og par ATP hydrolyse til MT demontering 21-23. Denne funktionelle rolle af MCAK vides at være kritisk inden mitosespindelen 24-28, samt i interfasen 29,30. Inden interfase EC'er, er MCAK-medieret MT demontering reguleret af lokaliseret Aurora-A induceret phosphorylering af MCAK som reaktion på sår-kant induceret aktivering af Rac1 lille GTPase. Resultatet af denne signaleringskaskade er hæmning af MCAK på forkant ECS, hvilket resulterer i polariseret MT vækst mod leading kant og MCAK-induceret MT demontering ved bagkanten migrere EC'er 31.

Traditionelle metoder til måling af MT vækstdynamik har typisk anvendt hånd sporing af enten fluorescens-mærkede tubulin eller senest, fluorescens-mærket MT end binding protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3 henholdsvis). Den fluorescerende tubulin tilgang har den fordel, at mærke hele MT array. Men fordi størstedelen af mitotiske celletyper opretholde en radial række af MT'er under interfase 8,32,33 MTS nær centrosom er meget tæt, og som et resultat, tracking MT vækst og adskillelse med fluorescerende tubulin er normalt begrænset til den perifere regioner af cellen. På grund af disse begrænsninger, har udnyttelsen af ​​fluorescensmærkede EB proteiner (EB1 eller EB3) været den mere fælles tilgang til måling MT dynamik. Fordi EB'er kun mærke de voksende plus-ender MTS, vises de som små (1-3 um), lyst fluorescerende kommerts, hvilket giver et let skelneligt markør for MT polymerisation med meget begrænset baggrundsfluorescens 34-37. Mens det faktum, at EBS etiket kun en delmængde af MT arrayet er en stor styrke af EB tilgang, det også fremhæves én vigtig begrænsning, er at ikke-voksende MT'er ikke mærket af EB3 tilgang. Ikke desto mindre er evnen til at måle og spore EB3 kometer over tid og til at visualisere MT vækst inden sub-cellulære regioner gør denne fremgangsmåde velegnet til applikationer, der kræver regional evaluering af MT organisation.

En anden kritisk begrænsning af traditionelle metoder til måling MT vækstdynamik har været meget store datasæt og den tid, der kræves til dataanalyse. Denne begrænsning skyldes behovet for hånden sporing af hundredvis af EB kometer på høje tid opløsning. Desuden skal gøres på en statistisk signifikant antal celler og også udført under forskellige kontrol- og experime disse målingerntal forhold. For nylig har disse begrænsninger blevet overvundet gennem beregningsmæssige analyse teknikker specifikt rettet mod sporing EB3 kometer ved hjælp time-lapse mikroskopi i levende celler 35. Når det bruges korrekt, denne beregningsmæssige tilgang tjener til både begrænser risikoen for menneskelige fejl i forbindelse med hånd-sporing ud over at give en high-throughput metode til måling MT polymerisering. Computational analyse af MT dynamik ved hjælp af MatLab-baserede software-pakke, plusTipTracker, giver mulighed for målinger af MT vækst ved at spore fluorescens-mærkede EB3 kometer 5,31,35,38. Derudover plusTipTracker software giver mulighed for beregninger af MT katastrofebegivenheder (aka afmontering) baseret på forsvinden EB3 kometer inden for et voksende MT spor, og giver mulighed for sub-cellulære (aka regionale) analyse af MT vækstdynamikken inden brugerdefinerede områder af interesse . For vores undersøgelser blev MT vækstdynamik sammenlignet indenforgrenede regioner versus ikke-forgrenede regioner, eller inden for førende versus efterfølgende celle kanter. Udlæst fra plusTipTracker software kan også anvendes til at generere farvekodede spor overlays til individuelle celler og subcellulære regioner.

Her beskriver vi metoden til at undersøge den rolle, MCAK i modulerende MT vækst dynamik og bidrag denne MT depolymerase til reguleringen af ​​EF forgrening morfologi og retningsbestemt migration. Vores tilgang anvendes en primær human cellelinie, Human navleveneendotelceller (HUVEC'er), som er let dyrkes og stærkt modtagelige for elektroporering-induceret, transient transfektion af plasmid cDNA. Vi brugte derefter høj opløsning, time-lapse fluorescens mikroskopi af HUVEC'er transficeret med MT end binding protein 3 (EB3) og Mitotisk Centromer Associated kinesin (MCAK) -specifik cDNA konstruerer at vurdere effekter på MT dynamik transficeret HUVEC'er. PlusTipTracker-baserede beregningsmæssige billedanalyse af EB3-mærket MT plus ender var at måle MT vækst hastigheder og MT vækst levetider i time-lapse billeder, til at måle og sammenligne effekten af ​​eksperimentelle manipulationer på MT vækstdynamik. Denne metode giver mulighed for studiet af MT dynamik og identifikation af, hvordan lokaliseret regulering af MT dynamik inden sub-cellulære regioner bidrager til angiogene processer EF forgrening og migration. Disse teknikker er gældende for efterforskningen af ​​MAP, der kan fluorescensmærkede og udtrykt i levende celler.

Protocol

1. HUVEC Kultur og vedligeholdelse

  1. Forbered komplet endotel basalt medium ved at tilsætte hele indholdet af endotelcellevækst-medium supplement pakke og 5% penicillin / streptomycin antibiotisk blanding til phenolrødtfrit endothelial basal media (se Materialer / Udstyr oversigten). Varm komplet endotel basalt medium til 37 ° C i et vandbad.
  2. Fjern en HUVEC kryoglas fra lagring i flydende nitrogen og tø hurtigt i et 37 ° C vandbad i 2 min. Når ~ 80-90% optøet, tilsættes 500 pi opvarmet komplet endotel basale medium til cryovialet, blandes ved pipettering, og dispensere celler jævnt i en 100 mm plast vævskulturskål indeholdende 15 ml opvarmet komplet endotel basalt medium.
  3. Placer celler i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Tillad celler til at adhærere natten over. Du må ikke fjerne eller ændre cellekulturmediet.
  4. Når 100 mm skål er> 90% sammenflydende, overføre HUVEC'er into en 75 cm2 vævskulturbehandlet kolbe og holdes ved> 60% konfluens på alle tidspunkter (se trin 1.5).
    Bemærk: Når holdt ved en densitet> 60%, HUVEC fordoblingstid er konsekvent 18-20 timer.
    1. For situationer, hvor passage af cellerne ikke er nødvendig (dvs. densiteten er <90%), aspireres mediet og erstatte med frisk komplet endotel basalt medium hver 48 timer.
  5. Når HUVEC'er nå> 90% konfluens, skylles 2 gange med 10 ml 1x PBS, og derefter fjerne cellerne fra vævsdyrkningsskål ved at behandle dem 1,5 ml 0,25% trypsin i 1-2 min ved 37 ° C. Bemærk: Levedygtighed af HUVEC'er er stærkt reduceret ved at forlænge længden af ​​trypsin eksponering.
  6. Rednings-celler ved tilsætning af 8,5 ml komplet endotel basale medium til / HUVEC blandingen trypsin ved et forhold på 4: 1 endothelial basal media komplet: trypsin (minimal-forhold), og samles i en 15 ml konisk rør.
  7. Centrifuger ved 1400 xg i 4 min. Aspirersupernatanten.
  8. Pellet resuspenderes i 2 ml komplet endotel basalt medium og tilsæt cellerne til en ny 225 cm2 vævskultur-kolbe indeholdende 25 ml komplet endotel basalt medium.

2. Coverslip Forberedelse Før HUVEC Culture

  1. Coating Dækglas med Fibronectin substrater.
    1. Forbered pibende-ren 22 mm nr 1,5 dækglas 39 og opbevares ved stuetemperatur (RT) i 100% ethanol.
    2. Brug en bunsenbrænder at flamme et dækglas og læg det i en 35 mm petriskål med en pincet.
    3. Forbered en fibronectin / PBS-blanding ved at blande 10 pi fibronectin lager (1 mg / ml) med 990 pi PBS.
    4. Pipetter 250 pi af / PBS-blanding fibronectin onto dækglasset i 35 mm skål. Jævnt fordelt dække overfladen af ​​dækglasset.
    5. Inkubér fadet i mindst 3 timer ved 37 ° C og skylles 3 gange med 2 ml 1x PBS før brug.
  2. Coverslip Aktivering
    1. Placer en 22 mm No. 1.5 dækglas i 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane i 10 minutter på en røre plade. Efter inkubation vaskes 10 gange i 2 minutter hver i dobbelt-destilleret H2O (Hedeselskabet 2 O).
    2. Inkubere dækglasset i 0,5% glutaraldehyd i 30 minutter på en omrøringsplade. Efter inkubation vaskes 10 gange i 2 min i Hedeselskabet 2 O.
  3. polyacrylamid Forberedelse
    1. Forbered en PA-gel med en compliance på 0,7 kilopascal (kPa) ved at tilsætte 3,75 ml 40% acrylamid, 0,3 ml 2% bis-acrylamid, og 0,95 ml Hedeselskabet 2 O.
    2. Forbered en 10% brugsopløsning ammoniumpersulfat (APS) og gemme på is indtil brug.
    3. For at forberede PA løsning til en dækglas (samlet volumen = 166,7 pi), tilsættes 0,83 ul Hedeselskabet 2 O, 41,7 ul af bis-acrylamid løsning (lavet i trin 2.2.2.1), 124 pi 10% APS, og0,25 pi TEMED.
    4. Umiddelbart Pipettér 15 pi PA løsning på en hydrofob objektglas (se Reagenser List) og tildækkes med en aktiveret 22 mm No. 1.5 dækglas. Tillad PA at polymerisere i 20 minutter ved stuetemperatur.
    5. Fjern dækglasset og overførsel til en 35 mm skål. Vask 3 gange med 2 ml 1x PBS. Opbevar for <2 uger ved 4 ° C.
    6. At binde fibronectin til polyacrylamidgel, udsætter de polyacrylamid-coatede dækglas til 2 mM sulfo-SANPAH med 7.500 J i UV-lys (254 nm). Skyl gang med Hedeselskabet 2 O.
    7. Forbered en fibronectin / PBS-blanding ved at blande 10 pi fibronectin lager (1 mg / ml) med 990 pi PBS.
    8. Pipetter 250 pi af fibronectin / PBS blanding på dækglasset (r) i en 35 mm petriskål. Jævnt fordelt dække overfladen af ​​dækglasset.
    9. Inkubér fadet i mindst 3 timer ved 37 ° C og skylles 3 gange med 2 ml 1x PBS før brug.
class = "jove_title"> 3. cDNA Transfektion og HUVEC Kultur på dækglas

  1. Komplet trin 1,5-1,6.
  2. Ved hjælp af et hæmocytometer, tælle celletallet og indsamle et volumen, der indeholder 100.000 celler / dækglas (for ikke-migrationseksperimenter) eller 500.000 celler / dækglas (for migrationseksperimenter). Pelletere cellerne via centrifugering ved 1.400 x g i 4 min.
    Bemærk: Migration protokol er beskrevet i afsnit 9, nedenfor.
  3. Resuspender celler, som skal transficeres med 100 pi elektroporering puffer. Kombiner med 1 pg cDNA og anbringes i elektroporation cuvette. Elektroporere celler: DNA-blandingen ved hjælp af programmet, der er udpeget for HUVEC elektroporation (f.eks program #: A-034).
  4. Rescue transficerede celler med 500 pi komplette endotele basalt medium og pladernes celler på en fibronectin-overtrukne 22 mm No. 1.5 dækglas (se protokol 2.1, ovenfor). Der inkuberes ved 37 ° C i 3-4 timer for at give tid til ekspression af cDNA-konstruktioner.
le "> 4. Udarbejdelse af Prøve for Imaging

  1. Skær dobbeltklæbende tape i 2,5 cm x 0,65 cm strimler.
  2. Anskaf en ren glasplade. Tag to strimler af dobbeltsidet tape og sikre dem vandret langs øverste og nederste kant af dias. Bemærk: Det er vigtigt at tillade en lille mængde plads mellem båndet og objektglasset kant til forsegling af kammeret som beskrevet i trin 4.5).
  3. Mount dækglas (fra trin 3.4; celle nedad), således at 2 kanter af dækglasset hvile på båndet. Brug pincet til at trykke forsigtigt ned for at fastgøre dækglasset.
  4. Med en mikropipette tilsættes 40 pi billeddannende medium (komplet endotel basal medium suppleret med 25 pM HEPES) mellem dækglasset og dias. Sikre, at mellemrummet mellem dækglasset og objektglasset er helt fyldt med billeddannende medie. Aspirer overskydende billeddannende medium (om nødvendigt).
  5. Seal alle kanter med varm VALAP (1: 1: 1 vaseline: lanolin: paraffin). Kontroller for lækager ved at skubbe gently på dækglas.
  6. Placer monteret og forseglet dækglas på foropvarmet (37 ° C) mikroskop fase.

5. Microscopy

  1. Ved hjælp af en roterende skive konfokal mikroskop udstyret med en 60X, 1,40 Numerisk Aperture (NA) Differential Interference Contrast (DIC) immersionsolie objektiv, en automatiseret overvågning fokus systemet (PFS), elektronisk lukker for transmitteret belysning, en X-og Y motored fase, båndpasfiltre opstaldet i et elektronisk filter hjul, og et monolitisk laser kombinationsmodulet, fokusere mikroskopet ved grænsefladen af ​​cellen / dækglas og bruge mikroskopbordet joysticket for at finde en enkelt celle.
  2. Klik på "Kameraindstillinger" panel i billedet program. Inden for den "eksponeringstid" dropdown vindue af panelets Kameraindstillinger Vælg 400 ms.
    Bemærk: Eksponeringstider kan variere og bør bestemmes empirisk.
  3. Klik på "ND Acquisition" panel ibillede program. Inden fanen lambda (λ) på ND Acquisition panelet, skal du klikke på afkrydsningsfelterne til at vælge de 488 og 561 nm lasere. Inden for den "tid" fanen for ND Acquisition panelet, indstilles købet tid til 2 sek og den samlede tid til 2 min.
  4. Klik på "Kør nu" -knappen i ND Acquisition panelet til at erhverve en 2 min time-lapse billedsekvens på 2 erhvervelse sek intervaller ved hjælp af en 400 ms eksponeringstid for både 488- og 561 nm belysning.
  5. I panelet "Optisk Config" af billedet software og bruge de kameraindstillinger, der er beskrevet i trin 5.2, skal du klikke på 405 nm laser knappen og derefter klikke på "Acquire" for at fange et enkelt billede af blåt fluorescerende protein (BFP) -mærkede proteiner .
    Bemærk: Det er generelt tilrådeligt at begrænse celle eksponering (hyppighed af billedoptagelse og / eller eksponeringstid) til 405 nm laser belysning som denne bølgelængde kan skade cellerne over tid.
    1. For MCAK-shRNA studier, encquire en enkelt 405 nm billede for at verificere ekspression af BFP-mærkede shRNA.
  6. I panelet "Optisk Config" af billedet software og bruge de kameraindstillinger, der er beskrevet i trin 5.2, skal du klikke på knappen DIC og derefter klikke på "Acquire" at fange en enkelt DIC billede af cellen til forgrening morfologi analyse (se afsnit 10 , under).
  7. Efter overtagelsen billede, bruge "lysstyrke / kontrast" funktionen i billedet software program til at digitalt øge billedsignal.
  8. Eksporter lysstyrke og kontrast justeret billeder. Klik på "File" og derefter klikke "Gem som" og derefter klikke for at vælge ".tif" for billedet filtypen.
    Bemærk: Dette genererer typisk 61 .tif billedfiler fra en enkelt 2 min time-lapse erhvervelsen når fanget som beskrevet i trin 5.4.

6. MT Dynamics Analyse

  1. For EB3 tracking, bruge plusTipTracker software 35, en open source,MatLab-baserede beregningsmæssige softwarepakke designet til automatisk registrering, sporing, analyse og visualisering af fluorescerende mærket EB'er.
  2. plusTipGetTracks Graphical User Interface (GUI)
    1. At få adgang til plusTipGetTracks GUI, typen plusTipGetTracks.
    2. For EB3 komet afsløring, bruger GUI til at gennemse og vælge den forælder mappe, der indeholder de .tif billeder.
    3. Inden for sporingsparametre panel plusTipGetTracks GUI, indtastes følgende værdier: Søg Range Radius = 5 - 10; Minimum Sub-Track Længde = 3; Max Gap Længde (Frames) = 12; Max Krympning Factor = 1,0; Maksimal Angle Forward = 25; Maksimal Vinkel Bagud = 10; Svingninger Radius (Pixels) = 2; Frame Rate (sek) = 2; Pixel Size (um) = 110.
      Bemærk: tjek først for de optimale sporingsparametre bruger plusTipParamSweepGUI på et repræsentativt sæt af .tif billedfiler. Den indtastede værdi for pixelstørrelse er specifik for objektivlinsen anvendt til at erhverve den time-lapse billedes (se Steps 5,1-5,2, ovenfor).
    4. For Region of Interest (ROI) udvælgelse, skabe binære masker af hele cellen ved manuelt at opspore celle kant under anvendelse af DIC billede af cellen til dannelse af en polygon.
    5. For subregion of Interest (sub-ROI) udvælgelse, oprette forreste og bageste kant masker ved manuelt at tegne en 2 point tyk linje på tværs af såret kant celle af interesse ved hjælp af en modificeret plusTipTracker sub-ROI markeringsværktøj.
      Bemærk: Linjen skal trukket parallelt med sår kant på den position, hvor cellen af interesse strækker sig ud over nærliggende sår-edge celler 31.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Kontroller og visuelt inspicere spor overlays for de .tif billeder gemt i "ROI" mappe ved at klikke på "Plot Tracks" knappen i Track Overlays kolonnen. Gentag for alle spor overlejringer.
    2. Udfør data gruppering ved at klikke på knappen "Opret grupper" i kolonnen Valgfrie indstillinger. Vælg experimEntal data, der hører til samme datasæt ved at klikke på datafilerne. Gem markeringen ved at give "gruppe" et navn, der let kan identificeres (for eksempel "kontrolgruppe").
    3. For Sub-ROI MT vækstdynamik målinger, indtaste det mindste antal billedrammer, at der skal påvises en EB3 komet nummer inden for sub-ROI for at kvalificere sig som en "spor" og udtrække MT vækst udflugter i forreste og bageste kant ROI ved at klikke på "manuelt valg" i "Sub-ROI'er" panel af GUI.
      Bemærk: Brug f.eks 3 rammer (6 sek) som minimum afsløring længde skal udvindes som et "spor." Ekstraherede numre fra sub-ROI'er er lagret i et delprojekt mappe i den oprindelige mappe ROI for hver celle.
    4. MT vækst sub-spor og delpopulation analyse
      1. Beregn den gennemsnitlige MT vækst hastighed og betyder MT vækst levetid for "gruppe" datasæt (se trin 6.3.2), for hver ROI (se step 6.2.4), og for hver sub-ROI (se trin 6.2.5).
    5. Inden for den Quadrant Scatter Plots kolonne i plusTipSeeTracks GUI, klik på "Vælg grupper" og klik på de grupper (oprettet i trin 6.3.2), der skal sammenlignes.
      1. Vælg "Vækst hastighed" for x-aksen option og skriv middelværdien for vækst hastighed (fra trin 6.3.4) ind i feltet. Vælg "Vækst levetid" for y-aksen option og skriv middelværdien for vækst levetid (fra trin 6.3.4) ind i feltet.
    6. Markér afkrydsningsfeltet ud for "Fjern spor ved start / slut", og ved siden af ​​"Batch proces på grupper." Klik på "Make Plots" til beregning af fordelingen profil for MT vækst spor for hele cellen, forreste kanter, og bagkanter sub-ROI'er.
      Bemærk: For undersøgelser, der er beskrevet her, er MT vækst spor fordelt i fire subpopulationer: langsom og kortvarig, langsom og lang levetid, hurtig og kortvarig, og hurtigt og langlivet.
    7. Klik på "Data" og derefter klikke på "Data Analysis" fra Data dropdown vindue. Vælg "t-test: to prøve under forudsætning af ens varianser" at sammenligne betyde MT vækst hastigheder og MT vækst levetid. Fremhæve dataceller i regnearket hvor t-test sammenligninger resulterer i en p-værdi <0,001.

7. colokalisering Analysis

  1. For baggrund subtraktion, ved hjælp af "linje værktøj" af imaging software program, tegne et område af interesse (ROI) ved at klikke på skærmen for at oprette en kvadratisk form, der er 10 um 2 på den grønne kanal billede (488 nm excitation) på en position, hvor der ikke er nogen celle fluorescens (baggrunden). Gentag dette for den røde kanal billede (561 nm excitation) under anvendelse billederne fra trin 5.8.
  2. Brug af imaging software PROGRAM, højreklikke på ROI fra trin 7.1 og vælg "sæt som baggrund ROI." Klik på "Image" og derefter klikke på "subtrahere baggrund" fra dropdown vinduet for at trække de gennemsnitlige baggrundsværdier (fra trin 7.1) fra hele billede. Udfør baggrund subtraktion for celler co-udtrykkende Em-Aurora A og enten mCherry-MCAK, Mapple-EB3 eller Mapple-tubulin.
  3. I baggrunden trækkes røde kanal kun billedet, skal du klikke på Binary bånd og vælg "Definér Threshold" og derefter vælge "per kanal" funktion til at udelukke den udpegede fluorescerende markør.
    Bemærk: Det tærskelværdier trin blev udført på enten mCherry-MCAK, Mapple-EB3 eller Mapple-tubulin billede for at tillade at tegne linjer, der specifikt markerede tærsklingsbehandlede objekt for co-lokalisering analyse (se trin 7.4).
  4. Brug af linje værktøj i imaging-softwaren, tegne en 2-punkts tyk linje over de udelukkede objekter i tærsklingsbehandlede billede.
  5. Vælg den linje objekter tegnet i trin 7.4. Kopier og indsæt linje objekter fra den røde kanal på dens tilsvarende grønne kanal (Em-Aurora A) billede.
  6. Mål gråtoner pixel intensitetsværdier under linjen objekter til at beregne co-lokalisering og samlede Em-Aurora-A-værdier for hver enkelt celle ved at vælge "Measure" og derefter "Intensitet Profile" fra dropdown vindue i program til billedbehandling.
    1. Organiser dataene ved eksperimentel behandling og sub-cellulære region ved at eksportere til et regneark program og gemme filen som type .xls (for eksempel "control_grayscale_intensity.xls").
      Bemærk: Data præsenteret på denne måde repræsenterer co-lokalisering brøkdel af den samlede målte Em-Aurora-A per sub-cellulære region.
  7. Under anvendelse af de målte værdier fra trin 7.6, gentag trin 6.3.7 at beregne den statistiske signifikans under anvendelse af p <0,05 som cutoff for signifikans.
  1. Fix celler (se trin 3.4) med paraformaldehyd / glutaraldehyd co-udtræk / fiksering buffer (PGF-Phem, 4% paraformaldehyd, 0,15% glutaraldehyd, 0,2% rengøringsmiddel i 60 mm rør, 27,3 mM Hepes, 10 mM EGTA, og 8,2 mM magnesiumsulfat 4, pH 7,0) i 10 minutter ved stuetemperatur.
  2. Skyl 3 gange i 5 minutter med 2 ml 1x PBS.
  3. Behandl 2 gange i 15 minutter med 0,01 g / ml NaBH4 i 1x PBS til standsning reaktive aldehyder.
    Bemærk: NaBH4 danner bobler, der kan forårsage dækglassene at flyde. Det er afgørende, at dækglassene forbliver neddykket i disse inkubationer. Hvis dækglassene begynder at flyde pincet til at hæve den ene kant af dækglasset, således at boblerne at undslippe.
  4. Skyl 2 gange med 1 x PBS før blokering med 5% fedtfri mælk i 1x PBS på en vippende platform i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Inkuber celler i primære antistoffer (kanin anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) og rotte-anti-α-tubulin (1: 500) fremstillet i 1 x PBS-opløsning. Der inkuberes ved 4 ° C på en vippeplatform natten over.
  6. Fjern primære antistoffer og skyl 3 gange i 5 minutter i 1 x PBS før inkubation med sekundære antistoffer (æsel-anti-kanin (1: 1.000) og gede-anti-rotte (1: 1.000)) fremstillet i 5% fedtfri mælk i 2 timer ved 37 ° C.
  7. Mount dækglas på en glasplade i fluorescens-optimeret montering medium. Forsegl dækglasset kanter på glasset ved hjælp af klare neglelak, og opbevares i mørke ved 4 ° C.

9. cellemigrationsassay

  1. Udfør HUVEC kultur for migration analyser som beskrevet ovenfor (protokol 3: cDNA Transfektion og HUVEC Kultur på dækglas, trin 3,2-3,3).
  2. Efter celletransfektion, rednings transficerede celler med 80 pi komplet endotel basalt medium. Pipette 80 pi prøve som en enkelt dråbe på midten af ​​en tørret fibronectin-coatede 22 mm runde No. 1.5 dækglas. Du må ikke sprede 80 pi dros. Der inkuberes ved 37 ° C i 3-4 timer for at give tid til celleadhærens til et konfluent monolag.
    Bemærk: Tørring dækglasset er nødvendige for at forhindre 80 pi dråbe i at sprede sig ved kontakt af dækglasset. Derved bliver HUVEC'er koncentreres inden for et lille område af dækglasset og derved fremmer hurtig dannelse af et konfluent monolag af celler.
  3. Skyl 2 gange i komplet endotel basale medium for at fjerne ikke-vedhæftede celler.
  4. For at oprette en "sår kant," skrabe dækglasset med en steriliseret barberblad ved forsigtigt at trække en ren barberblad over HUVEC monolag (fra trin 9.2). Hold dækglasset forsigtigt på plads med en pincet for at forhindre glidning af barberbladet under skrabning.
  5. Lade cellerne komme sig i en 37 ° C inkubator i 3 timer. Saml og montere dækglas (er) for imaging (se protokol 4).
  6. Anskaf fase-kontrast og 488 nm billeder med 10 min intervaller for 12 timer på mikroskopet ved hjælp af en10x 0,45 NA fase objektiv og en 0,52 NA LWD kondensator ved hjælp af "ND Acquisition" panel af købet billedet program (beskrevet i trin 5.3).

10. Kvantificering af HUVEC Forgrening og Migration

  1. Til forgrening analyse og at give mulighed for endnu celle belysning og fordomsfri kvantificering erhverve et mikroskopisk billede af en HUVEC transficeret (se trin 3.3) og udtrykker Mapple-C1-cDNA konstruere, en celle volumen markør.
  2. Brug af program til billedbehandling, skal du åbne Mapple-C1 billede og mærke position på begge sider i branchen, hvor membranen viser den største vinkel krumning. Forbinde disse to punkter med en lige linie. Denne linje er "filial oprindelse."
  3. Ved hjælp af linje værktøj af imaging software, visuelt identificere grene, der måler> 10 um i længden fra "filial oprindelse" bestemt i trin 10.2. Beregn gren længde ved at måle afstanden fra the "gren oprindelse" til det mest distale punkt af grenen spids (se figur 4).
  4. Tæl antallet af forgrenede fremspring, der måler> 10 um i længden for at opnå "celle gren nummer."
  5. For migration analyse ved hjælp af billeder, indsamlet på trin 9.6, visuelt identificere et sår-edge HUVEC baseret på fysiske placering (dvs. celler fysisk på kanten af såret) og udtryk profil (dvs. vælge en grøn sår kant celle hvis eksperimentet involverer ekspression af GFP).
  6. Brug af fasekontrast billeder af cellen, visuelt identificere kernen (den halvgennemsigtige sfærisk struktur nær centrum af cellen), og derefter visuelt identificere nucleolus (en lille, mørk-farvet, sfærisk struktur i kernen) på det første tidspunkt af time-lapse billeder. Klik på positionen af ​​nucleolus at mærke x og y koordinater for nucleolus.
  7. Ved hjælp af imaging software, hånd-sporenucleolus i successive time-lapse billeder ved at klikke på positionen af nucleolus at mærke x og y-koordinaterne for nucleolus i hver ramme i time-lapse film (figur 4).
  8. Ved hjælp af imaging software, klik på "File" og derefter klikke på Gem som "og derefter klikke for at vælge den type billedfil" .xls ".
  9. Åbn hånd-sporing datafil (fra trin 10.8) ved hjælp af et regneark program. Beregn den gennemsnitlige migration hastighed og betyde migration afstand til oprindelse.
  10. Ved hjælp af et regneark program, skal du klikke på "Data" og derefter klikke på "Data Analysis" fra dropdown-vinduet data. Vælg Bonferroni-korrigeret, envejs variansanalyse test med> 95% sikkerhed som cutoff for statistisk signifikans.

Representative Results

HUVEC kultur for levende celle mikroskopi
Live-cell imaging af HUVEC'er udtrykker fluorescerende proteiner kræver, at HUVEC'er opretholdes i et miljø, der er egnet til normal vækst og vedligeholdelse celle, samt normal proteinekspression og funktion. Figur 1 viser en skematisk afbildning af den anvendte protokol til fremstilling af en pufret og lukket system, der opretholder optimeret optiske egenskaber til opsamling time-lapse billeder af levende celler. Tynde strimler af dobbeltsidet tape anbringes på et objektglas (figur 1A) og derefter dækglasset indeholdende den dyrkede HUVEC'er inverteres oven på båndet, således at cellerne vender mod glas (figur 1B). På denne måde båndet tilvejebringer et lille mellemrum mellem de to glasflader, og skaber et rum, i hvilket cellerne kan badet i passende celledyrkningsmedier (figur 1C, se protokol 4, ovenfor). jegna sidste trin er dækglas forseglet til objektglasset under anvendelse af en vaseline: lanolin: paraffin (1: 1: 1 blanding, VALAP; figur 1 D) at etablere et lukket system. Denne cellekultur fremgangsmåde blev anvendt til både kortere sekvens billeddannelse af EB3 kometer og for længere tid sekvens forgrening og migrationseksperimenterne. Derudover vokslignende konsistens VALAP tillader nem fjernelse fra objektglas og dækglas i slutningen af ​​et billeddannende eksperiment, således at supplerende tilgange, herunder fiksering og immunomærkning (se protokol 8), kan udføres på samme dækglas og celleprøve der blev visualiseret under anvendelse af live-cell imaging tilgang.

figur 1
Figur 1:. Metode af HUVEC kultur for levende celler mikroskopisk billeddannelse (A) Klip 2 stykker af dobbeltklæbende tape i 0,65 cm x 2.50 cm rektangulære strimler og sikre et stykke dobbeltklæbende tape vandret langs den øverste kant af objektglasset, og det andet stykke, langs den nederste kant af objektglasset. Det er vigtigt at tillade en lille mængde plads mellem båndet og objektglasset kant til forsegling af kammeret som beskrevet i (D). (B) Under anvendelse af pincet fjerne dækglasset indeholdende HUVEC'er og invertsukker dækglasset (celle nedad) oven på stykker tape. (C) Ved anvendelse af en mikropipette, tilsættes 40 pi billeddannende medie (komplet endotel basalt medium suppleret med 25 pM HEPES) mellem dækglasset og objektglasset. Sørg for, at rummet mellem dækglasset og slide er helt fyldt med imaging medier og undgå bobler. Brug en aspirator langs kanten af ​​dækglasset for at fjerne overskydende medier, hvis det er nødvendigt. (D) Brug varmt VALAP (1: 1: 1 vaseline: lanolin: paraffin) at forsegle omkring kanterne af dækglasset. Kontroller for billeddannende medier lækages ved at skubbe rundt forsigtigt på dækglasset. Brug ekstra VALAP at afhjælpe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Automatiseret sporing af fluorescens-mærket EB3 muliggør omfattende analyse af hele celler og regionale MT vækst dynamik. Indsamlingen af ​​klare, tydelige og meget tid og rum-løst mikroskopiske billeder af EB3 protein er afgørende for analysen af ​​EB3 bevægelser inden i cellen. HUVEC ekspression af fluorescens-mærket EB3 varierer meget fra celle til celle og fluorescensintensiteten øger typisk inden for samme celle over en periode på timer. Således er det vigtigt at overveje og overvåge disse ændringer i udtryk profil for at identificere potentielle virkninger af øget EB udtryk på MT vækstdynamik. Dette opnås bedst ved at evaluere grå-skala fluorescens intensity profiler for hver afbildet celle, og derefter begrænse dataanalyse til de celler, der udviser et defineret område af grå skala udtryk profiler. Indledende vurdering af udtryk profil datasæt er kritisk, og bør sammenlignes med MT vækstdynamik data, der opnås ved plusTipTracker software til hver celle. Udtryk profiler kan plottes mod MT vækst hastighed og MT vækst levetid for hver celle i en forsøgsgruppe, for at bestemme det ønskede område af gråtoner ekspression og til at identificere potentielle outliers.

Figur 2 fremhæver en HUVEC dyrket på en fibronectin substrat (se protokol 2.1, ovenfor) og udtrykke nær optimale niveau af Mapple-mærket EB3. Fluorescerende EB3 kometer er vist i en time-lapse serie billeder over en periode på 12 sek (figur 2A). Analyse af EB3 kometer ved hjælp plusTipTracker software indebærer en automatiseret, frame-by-frame EB3 komet DETEktion (grønne og gule prikker, figur 2B). Kometer detekteret inden for hver frame derefter forbundet, afhængig af deres ændring i position fra ramme-til-ramme, for at generere EB3 spor og en visuel EB3 track overlay (Figur 2C-F). Track overlays er farvekodet og farve sondringer kan bestemmes ved parametre indtastes af brugeren. Sædvanligvis disse sondringer bruge den globale gennemsnit af MT vækst hastighed og MT vækst levetid 5,31 og dermed opdele data i fire grupper: langsom og kortvarig (rød), langsom og langlivede (gul), hurtige og korte levede (grøn), og hurtigt og langlivet MT vækst (blå, figur 2G). PlusTipTracker-medieret sporing af EB3-mærket MT vækstdynamik muliggør også brugerdefinerede Regioner interessepunkter (ROIs). PlusTipTracker udtrækker MT vækstsporet data inde fra brugerdefineret ROI (figur 2A, B og F), således at der sammenligninger af MT vækst Dynamics inden for forskellige områder af den samme celle.

Figur 2
Figur 2: EB3 komet afsløring, sporing, og plusTipTracker data output (A) tid-lapse film af en HUVEC udtrykker mapple EB3.. Venstre panel viser en hel celle visning og helcelle maske (hvid linje) demarking de cellegrænser. Rød kasse repræsenterer det zoomede område vist i time-lapse billeder (højre paneler). Højre paneler viser rå grå-skala time-lapse billeder af EB3 kometer i successive imaging rammer (t = 0 sek - t = 12 sek). (B) plusTipTracker påvisning af EB3 kometer fra de viste billeder i (A). Venstre panel viser en hel celle visning af opdagede kometer (gule prikker). Rød kasse repræsenterer det zoomede område vist i time-lapse billeder (højre paneler). Højre paneler fremhæve fem fundne EB3 kometer (røde pile) og spore disse fem kometer over 12 sek imaging periode. Grøn prikker repræsenterer opdaget EB3 kometer, som ikke eksisterede (eller blev ikke påvist) i forrige tidsinterval. (C) Maksimal projektion af 61 rammer (2 min film) af EB3 kometer vist i (A). (D) plusTipTracker MT spor overlejring af de samme 61 frames (2 min film) vist i (C). (E) zoom på maksimal intensitet fremspring (rød boks i C). (F) Zoom af plusTipTracker MT track overlejring af maksimal intensitet projektion (rød boks i D). (G) Farvekodede legende for track overlays vist i (D) og (F). Betegnelse så langsom, hurtig, kortvarig eller langlivede er baseret på den gennemsnitlige værdi for alle vækst- spor målt i en gruppe af ti Mapple-EB3 udtrykker HUVEC'er. For nemmere visualisering, er spor overlejringer i (D) og (F), der genereres ved hjælp inverterede pixel intensiteter af cellen billedet vist i (A). Scale barer = 20 pm./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

HUVEC forgrening og migrationsmønstre er følsomme over for mekanisk-fysiske signaler fra ECM.

HUVEC'er er velkendte til at reagere på forskellige typer af signalering tidskoder og i den forbindelse, at undergå morfologiske ændringer, der dikterer en passende cellulære respons på den bestemte signalering cue (r) 36,40-42. HUVEC'er dyrket på fibronectin overtrukne glassubstrater (figur 3A), eller på stive 2-dimensionelle polyacrylamid ECM'er (55 kPa) typisk vise en runde eller aflange morfologi med få distinkte forgrenede fremspring (figur 3B). Men når de dyrkes på meget blødt 2-dimensionelle polyacrylamid ECM'er (0,7 kPa), HUVEC'er vise en stærkt forgrenet morfologi, der er kendt for at resultere fra overholdelse-induceret nedregulering af myosin-II kontraktilitet 4,5,31 (figur 3C). Således HUVEC'er regulere deres cellulære morfologi gennem ECM mechanosensing, og dette opnås ved lokal modulering af MT dynamik og acto-myosin kontraktilitet.

Fordi HUVEC'er vise en bred vifte af morfologiske egenskaber, for at måle HUVEC forgrening er det vigtigt at først definere, hvad en forgrenet fremspring er, og derefter at definere, hvor en forgrenet fremspring vil måles objektivt. Én teknik anvender en fire-trins fremgangsmåde, hvor en celle grænse eller "maske" genereres manuelt opsporing kanterne af cellen under anvendelse af et billede af en celle, der udtrykker en fluorescerende volumen markør til at definere celle kanter (figur 3D). Efter maske generation, er branch oprindelser defineret ved lokalisering størst ombukningsvinkel mellem den forgrenede fremspring og cellelegemet. En linje henledes på DEMArk den "filial oprindelse" (lilla vinklede linier, figur 3E). Branch nummer måles blot ved at tælle antallet af filialer med en defineret gren oprindelse (figur 3F). Branch længden måles som afstanden fra grenen oprindelse til den distale gren spids (figur 3G). For at undgå inddrage små lamellipodial fremskrivninger fra dataanalyse, yderligere kriterium kræver, at filialer skal være længere ( "filial længde") end de er brede (ved "filial oprindelse"), og at filialer skal være mindst ti mikrometer i længden 5 , 31.

Figur 3
. Figur 3: Analyse af HUVEC forgrening morfologi (A - C) DIC billede eksempler på HUVEC'er dyrket på fibronectin coated glas ECM'er (A) stive (55 kPa) polyacrylamid ECM'er (B) og bløde (0,7kPa) polyacrylamid ECM'er (C). Forgrening forøges dramatisk i HUVEC'er dyrket på 0,7 kPa polyacrylamid ECM'er (C) sammenlignet med stivere ECM'er (A, B). (D). DIC mikroskopisk billede (venstre billede) af en transficeret HUVEC udtrykker en Mapple-C1-cDNA konstruere (en celle volumen markør, højre billede). (E) Definer filialen oprindelse ved at lokalisere den største vinkel krumning (dvs. den position, hvor membranen viser den største krumning, lilla-farvede linjer) på begge sider af branchen og tilslut derefter vinklerne med en lige linje (blå linjer) . (F) identificere og udvælge forgrenede fremspring, som strækker sig> 10 um fra "gren oprindelse" (defineret i E). Tæl antallet af forgrenede fremspring for at opnå den "filial nummer." (G) Mål afstanden fra centrum af den "filial oprindelse" til most fjerneste punkt af filialen hjælp linjen værktøj i anmærkninger og målinger anvendelse af NIS Elements Software for at opnå den "filial længde." Scale barer = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Foruden sensing ECM overholdelse, HUVEC'er også fornemmer og svare eliminering af tilstødende cellulære kontakter som induceret af bunden sårdannelse. I migration assay HUVEC'er dyrket i et monolag underkastes en ridse sår og migration egenskaber måles (se protokol 9, ovenfor). Efter induktion af såret ved at ridse monolaget, sår-edge HUVEC'er polarisere ved at udvikle en protrusive forkant, som strækker sig ind i såret (figur 4A, t = 0 timer). Over et tidsforløb for 10-12 timer, polariserede sår-edge HUVEC'er vandre ind i sårområdet og fyldesår, oprettelse af et nyt konfluent monolag (figur 4A, t = 11 timer). Som med HUVEC forgrening, nuværende tyder på, at polarisering og migration er kritisk afhængig af den koordinerede re-organisering af MT og actin cytoskelet 43-49. Dette opnås til dels ved lokal inhibering af MCAK-induceret MT demontering ved forkanten, men ikke ved bagkanten af sår-kant HUVEC'er 31. Følsomheden af ​​MT dynamik viklet-inducerede polarisation initieres af Rac1 GTPase, som er rettet mod talrige downstream regulator proteiner, herunder Aurora-A kinase, som phosphorylerer og inhiberer MCAK på forkant, og andre kinaser der er i stand til at inhibere eller aktivere MAP'er til lokalt modulere MT vækst og svind 18,31,36,48,50-53. Omfattende eksperimentelle beviser støtter den opfattelse, at koordineringen af ​​forkant fremspring og bagkant sammentrækning styres gennem cyklusser af Rac1 aktiveringat fremme MT samling på forkant og RhoA aktivering til acto-myosin kontraktilitet ved bagkanten, og derved køre dirigeret motilitet 9,41,51,52,54-58.

Til dato er der ikke en etableret metode til at udføre automatiseret sporing af celle migration. Dette er et resultat af vanskeligheder i beregningsmæssigt analysere celle-ECM grænser, der er konsekvent skiftende som sår-edge celler polarisere og migrere. Mens mange programmer er i stand til at spore fluorescensmærkede celler 59-64, populationen af fluorescensmærket HUVEC'er i sår-edge migrationseksperimenter er ca. 30-40% af den samlede HUVEC befolkning, og derfor hovedparten af sår-edge celler skal visualiseres ved fase-kontrast eller DIC billeddannelse. Desuden er det vigtigt ved sår-kant migration til evaluering fluorescerende og ikke-fluorescerende celler inden for samme sår for at identificere specifikkevirkninger af udtryk konstruerer både inden eksperimentelle studiegrupper og mellem eksperimentelle studiegrupper. I øjeblikket er den bedste fremgangsmåde til at måle HUVEC migration er at bruge en hånd sporing metode, hvor et sår-kant celle først identificeres og derefter kernen og nucleolus identificeres (figur 4B). Nucleolus anvendes som positionen determinant for celle sporing grund af sin høje lysspredning densitet og relativt lille størrelse. Disse to funktioner i nucleolus gør det lettere at identificere og reducere målefejl ved at begrænse det område, hvor brugeren kan placere individuelle spor positioner. HUVEC migration spor derefter genereres ved at klikke på nucleolus i successive time-lapse billedrammer. Endelig migration hastighed og migration afstand til oprindelse måles og analyseres for kontrol og eksperimentelle cellegrupper (figur 4B).

Figur 4 Figur 4: Analyse af sår-edge HUVEC'er og migration sporing (A) 20X fase-kontrast billeder af en 11 timers tid-lapse imaging række scratch sår-kant HUVEC'er (aka "Migration Assay").. Såret og retning migration er angivet i panel t = 0 timer. HUVEC'er er vist at krydse såret kant og rykke ind i såret, indtil et monolag af celler er dannet (t = 3,5 timer - t = 11 timer). (B) Analyse af migration assay tid bortfalder billeddannelse (som vist i A) kræver først identifikation af en sporbar sår-edge HUVEC baseret på celle placering (dvs. celler fysisk på kanten af såret) og udtryk profil (dvs. , vælg grøn sårkanten celle hvis eksperimentet involverer ekspression af GFP). Brug af fase kontrast billede, identificere kernen og nucleolus. Hånd spore nucleolus i successive time-lapse billeder med ennotationer og målinger ansøgning i NIS Elements software til at bestemme migration hastighed og afstand til oprindelse. Scale barer = 100 um (A), 20 pm (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Brug HUVEC'er i morfologi og Migration Eksperimenter.
Live-cell imaging af EB3-mærket MT vækstdynamikken inden HUVEC'er kræver passende og reproducerbare celle dyrkningsbetingelser for at måle og evaluere ændringer i MT vækst og HUVEC morfologi, således at de derefter kan tildeles til en ECM signalering cue. HUVEC'er repræsenterer en fremragende model til undersøgelse celleform og motilitet. De er meget modtagelig for transfektion med fluorescens-mærkede cDNA, udviser de dramatiske morfologier som reaktion på både opløselige og fysiske signalsystemer signaler, og de ​​opretholder evnen til at organisere sig i vaskulære rør når opstilles passende celle dyrkningsbetingelser 65-70. Primære cellekulturer, såsom HUVEC'er, kræver omhyggelig håndtering og overvågning af celle passage nummer for at sikre, at cellerne er sunde, og at de vil opføre sig normalt under eksperimenter. For eksempel når der udføres forsøg undersøger cytoskeleton og / eller cellemorfologi, bør HUVEC'er ikke anvendes til forsøg ud over den tiende cellekultur passage, som HUVEC'er typisk begynder at vise ikke-ensartede morfologier ved passage tolv til femten.

Celledensitet er også et kritisk regulator af HUVEC sundhed og proliferation. HUVEC branching undersøgelser (se protokol 10.1-10.4, ovenfor) anvender kulturer relativt lave celletæthed for at give cellerne fysisk plads til at interagere med deres ECM og udvide forgrenede fremspring. I modsætning hertil sår-edge migrationsstudier (se protokol 10,5-10,8), HUVEC'er er kultur på et monolag inden sårdannelse. Som sådan sår-edge HUVEC'er vise en forholdsvis un-forgrenet morfologi, udvide forkant fremspring, og udviser celle-celle-interaktioner med deres umiddelbare naboer, når de trækker ind i såret.

Forbehold og Fordele ved Tracking MT Dynamics i Living HUVEC'er.
Roterende skive mikroskopi er en fremragende tilgang tilafprøve eksperimentelle hypoteser, der kræver konfokal billede klarhed med høje tid-opløsning. Med den passende kamera og laser modul, denne mikroskopi tilgang er følsomt over for lav emission fluorescens og kan støtte i reduceret fotoblegning sammenlignet med andre typer af fluorescensmikroskopi. Vigtigere er denne tilgang også velegnet til moderat til høj tid-opløsning billeddannelse som er nødvendig for at generere omfattende målinger af MT vækstdynamik ved hjælp af EB3 tilgang mærkning, i en række forskellige celletyper.

Mens EB3 metode til mærkning voksende MT plus-ender har forskellige fordele frem for andre metoder til fluorescens mærkning MTS, det har også unikke ulemper. For eksempel er der en del af MT-array, der ikke aktivt voksende på et givet tidspunkt, herunder både populationen af demontering MT'er og populationen af stabile, ikke-dynamiske MT'er 71-74. EB3 ville ikke mærke disse to populationer af MTS ogderfor bidraget fra disse to populationer vil ikke blive inkluderet i eksperimentel dataanalyse. Alternative metoder til evaluering af hele MT-array har fokuseret på ekspressionen af ​​fluorescens-mærkede tubulin, som inkorporerer i alle populationer MTS og giver mulighed for identifikation af dyrkning, faldende, og stabile MTS. På grund af den relativt høje tæthed af MT arrayet nær centrum af cellen og støder op til mikrotubulus organisere centrum (MTOC), mærkning hele MT arrayet skaber en ulempe i at udføre billedanalyse af MT ender, er ikke nær cellen periferien 75-77. Eksperimenter under anvendelse af to-farve co-mærkning af MT'er med fluorescerende tubulin og fluorescerende EB3 med levende celler har afsløret, kvalitativt, at langt størstedelen af tubulin-mærkede MT'er er også EB3-mærket 78. Derudover har der ikke været en effektiv metode til automatiseret sporing af MT'er mærket med fluorescerende tubulin. Det betyder, at data Samlingernetion og målinger af MT dynamik i celler, der udtrykker fluorescerende tubulin kræver hånd sporing af individuelle MTS, en proces, der er risiko for fejl og kedelig. Som følge heraf er automatiseret beregningsmæssig analyse af EB3 mærkede MT'er blevet den foretrukne metode til måling MT dynamik, som det kan anvendes til MT dynamics eksperimenter på tværs af forskellige celletyper og inden for en række eksperimentelle regimer 35,79.

Sammenkædning MT Growth Dynamics til HUVEC morfologi og Migration.
Set fra et cytoskelet investigator, en særdeles nyttig tilpasning af plusTipTracker automatiseret sporing analyse er evnen til at måle og evaluere både hele celle- og regionale ændringer i MT vækstdynamik. Kravet om en celle til at blive polariseret er en væsentlig forudsætning for retningsbestemt celle migration. Som sådan, polariserede signalsystemer tidskoder længe har været kendt som centrale drivkræfter for retningsbestemt cellemigration 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. Derudover er der i respons på fysiske interaktioner med ECM (f.eks overholdelse og dimensionalitet mechanosensing), HUVEC'er modulere deres MT dynamik ved lokalt at regulere MAP'er at fremme MT vækst inden forlængende forgrenede fremspring, og dette tjener til at styre HUVEC migration i retning af cue 5,31,88. , Polarisering som reaktion på ekstracellulære signalsystemer tidskoder fremhæver således behovet for eksperimentel evaluering af lokaliserede ændringer i cytoskeletale dynamik.

Samtidig live-cell imaging af MT vækstdynamik (ved hjælp af EB3 tilgang) og HUVEC celle migration er yderst vanskeligt at udføre, fordi MTS vokse på en tidsskala sekunder, mens ændringer i cellemorfologi og retningsbestemt migration forekommer på en tidsskala timer. Men begge processer er intimt Linked. Desuden kontinuerlig, hurtig billeddannelse af fluorescens-mærket EB3 på anden tidsskala fører til fotoblegning af EB3 signal. Forsøg på at overvinde dette problem ved at gennemføre korte imaging række EB3 (1-2 min erhvervelse serien) hver 30 minutter har været en succes, men kunne kun ske i et lille antal EC'er, der havde optimale udtryk for EB3 og det gjorde ikke vise negativ effekter til gentagen laserbelysning 5.

En alternativ metode, der giver mulighed for fortolkninger af, hvordan MT vækstdynamik bidrager til ændringer i cellemorfologi og migration er plusTipTracker Region of Interest (ROI) værktøj 35 (se protokol 6.6). Denne metode giver mulighed for hel celle MT vækst spor at være opdelt i brugerdefinerede områder, hvorfra MT vækst spor derefter kan udvindes og analyseres. For eksempel har sammenligninger af "forgrenet" kontra "ikke-forgrenede" regioner af cellen vist, at MT'er vokse mere sringe og mere vedholdende inden forgrenede regioner sammenlignet med den ikke-forgrenede celleperiferi 5. I polariseret sår-kant HUVEC'er, sammenligninger af de førende kant og bagkant MT vækstdynamik afslørede, at MCAK-induceret MT demontering hæmmes specifikt i forkanten, men ikke bagkanten. Regional evaluering af førende og bagkant MT vækstdynamikken i HUVEC'er udtrykker Rac1 og / eller phosphoryleringsbegivenheder mutanter af MCAK afslørede endvidere, at Rac1-induceret aktivering af Aurora-A kinase specifikt og lokalt hæmmer MCAK aktivitet i forkanten til at køre HUVEC polarisering og retningsbestemt migration 31. Således har kombinationen af ​​automatiserede sporing af MT vækstdynamik og regional evaluering af MT vækstdynamikken inden de forgrenede fremspring og / eller forkanten af ​​sår-kant HUVEC'er tilladt os at linke MT vækstdynamikken til HUVEC morfologi og migration.

De beskrevne protokoller er designed at tilvejebringe et generelt ligetil og yderst repeterbar metode til HUVEC kultur og eksperimentel undersøgelse. Alligevel er mange af de protokoller detaljer er komplekse og tidskrævende, hvilket på sin side giver mulighed for fejl eller problemer med at gennemføre den eksperimentelle metode. Mens det blev forsøgt at løse potentielle problemer i hele protokollen, her gives yderligere, detaljeret fejlfinding af potentielle problemer, der er mindre almindelige eller på anden måde forkortet noter inden metodologicentre protokoller.

Relateret til coating dækglas med polyacrylamid-substrater (protokol 2,2), et fælles problem, der opstår, er den komplekse karakter af aktiverende dækglas, kobling polyacrylamid til glasset, aktiverende polyacrylamid, og derefter kobling af ECM til polyacrylamid. En særlig vanskelig og potentielt problematisk trin dyrkning HUVEC'er onto fibronectin / polyacrylamidgel efter eksponering af polyAcrylamide-overtrukne dækglas til 2 mM sulfo-SANPAH (trin 2.2.2.6, ovenfor). Det er afgørende for succes for dyrkning HUVEC'er på disse substrater, sulfo-SANPAH fjernes helt fra det eksperimentelle system efter ECM konjugation. Dette kan bedst opnås ved vask med Hedeselskabet 2 O og inkubere dækglassene i Hedeselskabet 2 O på et rysteapparat natten over. Hvis celler dyrket på polyacrylamid ECM'er ikke overlever, eller hvis levedygtighed er mindre end forventet, forøget og gentagen vask af sulfo-SANPAH efter konjugering til fibronectin (trin 2.2.2.9) anbefales til potentielt afhjælpe dette problem.

Relateret til protokol 3 (cDNA transfektion og HUVEC kultur på et dækglas), en stor indflydelse på succesen af ​​elektroporation procedure er håndteringen af ​​HUVEC'er både under trypsinisering af cellerne for at fjerne dem fra plastflaske, og efter indgåelsen af elektroporation (trin 3,3-3,4, ovenfor). Det er afgørende at plejefuldt overvåge HUVEC'er mens i trypsin, og ikke at overskride den nødvendige tid til cellerne til "rund-up" på overfladen af ​​flasken (typisk 1-2 min). Overdreven tid i trypsin er en væsentlig årsag til HUVEC dødsfald, der ikke er typisk realiseres, før cellerne udpladet på fibronectincoatede dækglas (trin 3.4) og derefter ikke vedhæfte til substratet.

Lige så vigtig, behøver HUVEC'er (og de fleste primære celletyper) ikke klare sig godt, når suspenderet for lange gange i elektroporation buffer. Under større målestok eksperimenter, for eksempel, hvor brugeren har fem eller flere tilstande, der kræver elektroporering, er det bedre at holde cellerne pelleteret i individuelle rør (1 tube pr transfektion) og at blande dem, one-at-a-time , i elektroporation buffer umiddelbart før elektroporering. Denne fremgangsmåde minimerer inkubationstid i elektroporation puffer og maksimeret HUVEC overlevelse. Derudover øjeblikkelig redning i komplet dyrkningsmedier er også crtiske efter elektroporering. Rescue forsinkelser på et minut eller mere efter elektroporation kan resultere i næsten fuldstændig HUVEC død og derfor bør undgås.

Relateret cellemigrationsassay (protokol 9), teknikken med dyrkning HUVEC'er ved ekstremt høj tæthed afhænger af en kritisk modifikation (beskrevet i trin 9.2) af den traditionelle HUVEC cellekultur metode (beskrevet i protokol 3), der kræver tørring af fibronectin coatede dækglas således at HUVEC kultur i et meget lille område af dækglasset. Ofte gange, hvis dækglasset ikke er helt tør, eller hvis en forudgående belægning af dækglasset med fibronectin (trin 2.1 eller 2.2) var ikke effektive, medierne-holdige celler, der er placeret på dækglasset vil miste sin overfladespænding og udvide til kanter af dækglasset, og derved reducere densiteten af ​​celler på dækglasset. En metode til at foretage fejlfinding af dette potentielle problem er at aspirere mediet fra dækglasset og derefterplacere dækglasset (stadig i sin 35mm skål) i bagsiden af ​​biosikkerhed kabinet til 5-10 min. Denne tilpasning kan bidrage til at tillade strømmen af ​​luft i kabinettet for at hjælpe med tørring af skålen. Hvis nogen synlig væske forbliver på dækglasset efter lufttørring, suge væsken pletter og igen lad det lufttørre i 5-10 ekstra minutter i biosikkerhed kabinet. Det er vigtigt at bemærke, at der er ingen måde helt at undgå dette potentielle problem, men det bliver mindre af et problem med gentagne praksis af protokollen. Det er også en fejlfinding anbefaling, at når de forbereder dækglas for cellemigrationsassay (eller en hvilken som helst assay, i almindelighed), for at forberede ekstra dækglas og har ekstra HUVEC'er klar til at gå i tilfælde af problemer undervejs.

Med disse fejlfinding overvejelser i tankerne, er det også vigtigt at understrege nytten af ​​de protokoller, der diskuteres og deres konsekvenser i fremtiden cellebiologi forskning. Anvendeligheden til polyacrylamid tilgang er omfattende, og omfatter ikke blot todimensionale studier af celle-ECM engagement (beskrevet ovenfor), men også tredimensionale undersøgelser 5. Denne applikation er afgørende for at øge vores forståelse af, hvordan HUVEC'er regulere celle form og migration i fysiologiske miljøer og bør give efterforskerne en grundlæggende forståelse af, hvordan morfologiske ændringer koordineres med cytoskeletændringer. Mens de protokoller, der er beskrevet her, er fokuseret på målinger af MT vækstdynamik, at størstedelen af ​​de protokoller kan og bør tilpasses til at måle en række andre mikroskopisk målbare aspekter af celle-ECM interaktioner. Med hensyn til MT dynamik, der er mange kort, herunder mindst 14 familier af kinesiner 89, hver med en potentiel rolle ved at bidrage til HUVEC polaritet og instrueret migration, og som alle kan undersøges ved hjælp af de protokoller, der præsenteres.

Fremtidige undersøgelser bør enLSO være rettet mod celle-ECM engagement i normal versus sygdomstilstande. HUVEC protokoller præsenteres her gælder for undersøgelser af normale vaskulære homeostatiske processer, samt til sygdomstilstande, herunder hjertesygdomme, retinopati, tumorvækst og metastase, for at nævne nogle få. Konjugerende synligt gennemsigtige ECMS og polyacrylamid substrater af medgørlige overholdelse mikroskopiske undersøgelser vil give mulighed for celle-ECM engagement undersøgelser således at endotelceller vaskulær angiogenese kan overvåges med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Disse typer af eksperimentelle tilgange er allerede begyndt at afsløre væsentlige forskelle i endotelceller form, polaritet, migration, og virkningerne af proteiner, der regulerer disse processer 5,31,90. Den fremtidige indsats bør sigte mod at identificere, hvordan kombinationen af ​​ECM overholdelse og dimensionalitet mechanosensing kan tjene til lokalt kontrol proteiner, der er målrettet og regulerer cytoskeletale dynamik.

Acknowledgments

Særlig tak til Dr. Clare M. Waterman for mentorskab og diskussioner, Michelle Baird og Mike Davidson til at give mange af de fluorescerende cDNA-konstruktioner, der anvendes i disse undersøgelser, og Kathryn Applegate og Gaudenz Danuser til udvikling plusTipTracker MT analysesoftware. Dette arbejde blev støttet delvist af en bevilling til KAM fra National Heart Lung og Blood Institute (NHLBI) og National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Tags

Cellular Biology MCAK Aurora Rac1 mikrotubulus endotelcelle angiogenese elektroporering fluorescensmikroskopi live-cell imaging
Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter