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Biology

Haute résolution Time-lapse d'imagerie et d'analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

L'angiogénèse est déclenchée par des signaux de signalisation extracellulaire qui favorisent les cellules endothéliales (EC) pour polariser la migration directionnelle avec une spécificité et de former de nouveaux vaisseaux dans les tissus qui nécessitent une alimentation en sang. Les facteurs contributifs pensé à conduire l'angiogenèse sont des signaux à partir de la matrice extracellulaire (ECM). En réponse à des signaux physiques, CEs étendre de nouvelles branches avec une spécificité directionnelle pour guider le mouvement directionnel dans la formation du 1,2 du réseau vasculaire. L'architecture de la morphologie CE et ramification est défini par la réglementation localisée du cytosquelette de microtubules (MT) d'une manière qui est coordonnée avec la réglementation des acto-myosine contractilité 3. Pour les branches CE pour former, myosine-II doit être downregulated localement, ce qui entraîne des protubérances membranaires localisées 4. Dans le même temps et au même endroit dans la cellule, la dynamique de croissance MT se modifient résultant de la croissance de MT lente et persistante de promouvoir la branche elontion et de la stabilité 5. Ce règlement cytosquelette coordonné permet ECs de polariser leur morphologie pour faciliter la migration directionnelle.

Le développement d'une morphologie cellulaire polarisée monter MT polarisée 6. Dans la migration des cellules épithéliales, MTs se développent lentement et de façon persistante spécifiquement à la fine pointe de la cellule 7-9; tandis que dans les neurones, l'initiation et de l' allongement des axones ou dendrites exige que MTs sont non seulement présents, mais qu'ils subissent dynamiquement les processus de montage et de démontage 10-15. De cette façon, le contrôle localisé de la dynamique de croissance MT détermine l'architecture de la cellule et permet un remodelage rapide de la morphologie des cellules comme CEs naviguer à travers leur ECM.

la dynamique de croissance MT sont réglementées par des familles de protéines motrices moléculaires et des protéines non-motrices, appelées microtubules Associated Proteins ou microtubules protéines interagissant (désormais réféRRED comme MAPs). Les cartes peuvent être activées localement ou inactivé, généralement par des cascades initiées à l'interface cellule-ECM 16,17 signalisation. Fonction Une fois activé, MAPs en se liant à la MT et de modifier la cinétique de MT montage et le démontage; fonctionnant ainsi de réguler localement la dynamique MT afin de promouvoir la forme des cellules et de la polarité 18-20. Mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) est un MAP Kinesin-13 famille qui se lie aux extrémités et les couples d'hydrolyse de l' ATP à MT désassemblage 21-23 MT. Ce rôle fonctionnel de MCAK est connue pour être critique dans le fuseau mitotique 24-28, ainsi que pendant l' interphase 29,30. Dans interphase CEs, MCAK médiée MT désassemblage est régulée par localisée Aurora-A phosphorylation induite par des MCAK en réponse à remontage bord activation induite de la petite GTPase Rac1. Le résultat de cette cascade de signalisation est l'inhibition de MCAK à la fine pointe de la COCOM, entraînant une croissance de MT polarisée vers le leading bord et induits MCAK-MT désassemblage au niveau du bord de fuite de la migration 31 CEs.

méthodes traditionnelles de mesure de la dynamique de croissance MT ont généralement utilisé le suivi de la main de l'une ou l'autre tubuline marqué par fluorescence ou, plus récemment, marqué par fluorescence MT Fin protéine de liaison 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivement). L'approche de la tubuline fluorescente a l'avantage d'étiqueter l'ensemble du réseau de MT. Cependant, comme la plupart des types de cellules mitotiques à maintenir un réseau radial de MTs pendant l' interphase 8,32,33, MTs près du centrosome sont très denses, et en conséquence, le suivi de l' évolution de la MT et le démontage avec la tubuline fluorescente est généralement limitée à la périphérie des régions de la cellule. En raison de ces limitations, l'utilisation des protéines EB marquées par fluorescence (EB1 ou EB3) a été l'approche plus commune pour mesurer la dynamique de MT. Parce que EBs seule l'étiquette les plus-extrémités croissantes de MTs, ils apparaissent comme de petite taille (1-3 pm), fluorescent brillamment venirts, fournissant ainsi un marqueur facilement discernable de polymérisation MT avec un fond très limité fluorescence 34-37. Bien que le fait que l'étiquette EB seulement un sous-ensemble du réseau MT représente un atout majeur de l'approche EB, il met également en évidence une limitation importante, que les MTs non-croissance ne sont pas marqués par l'approche de EB3. Néanmoins, la capacité de mesurer et de suivre les comètes EB3 au fil du temps et de visualiser la croissance MT dans les régions sub-cellulaires font de cette approche idéale pour les applications qui nécessitent une évaluation régionale de l'organisation MT.

Une autre limitation critique des méthodes traditionnelles de mesure dynamique de croissance MT a été très grands ensembles de données et le temps nécessaire à l'analyse des données. Cette limitation découle de la nécessité pour le suivi de la main de centaines de comètes EB à haute résolution temporelle. En outre, ces mesures doivent être effectuées dans un nombre statistiquement significatif de cellules et également réalisée sous une variété de contrôle et experimeconditions NTAL. Récemment, ces contraintes ont été surmontées grâce à des techniques d'analyse de calcul spécifiquement destinés aux comètes suivi EB3 utilisant la microscopie time-lapse dans les cellules vivantes 35. Lorsqu'il est utilisé de manière appropriée, cette approche de calcul sert à la fois de restreindre les possibilités d'erreur humaine associée à la main suivi en plus de fournir une méthode à haut débit de mesure polymérisation MT. Analyse computationnelle de la dynamique MT en utilisant le progiciel basé sur MatLab, plusTipTracker, permet des mesures de croissance MT par le suivi des comètes EB3 marqués par fluorescence 5,31,35,38. En outre, le logiciel plusTipTracker permet de calculer des événements catastrophiques MT (aka démontage) basé sur la disparition des comètes EB3 dans une piste de MT de plus en plus, et permet une analyse sub-cellulaire (aka régionale) de la dynamique de croissance MT dans les régions définies par l' utilisateur d'intérêt . Pour nos études, la dynamique de croissance MT ont été comparés dans lesrégions ramifiées par rapport à des régions non-ramifiés, ou dans menant contre les bords de fuite des cellules. La sortie de données à partir du logiciel plusTipTracker peut également être utilisé pour générer des superpositions de piste à code couleur pour les cellules individuelles et les régions sub-cellulaires.

Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour étudier le rôle de MCAK dans la modulation de la dynamique de croissance de MT et la contribution de ce MT dépolymérase à la réglementation des CE ramification morphologie et migration directionnelle. Notre approche a utilisé une première ligne de cellules humaines, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont faciles à cultiver et se prêtent très bien à induit électroporation, transfection transitoire du plasmide d'ADNc. Nous avons ensuite utilisé à haute résolution, time-lapse de microscopie par fluorescence de HUVEC transfectées avec MT End Binding Protein 3 (EB3) et mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) ADNc spécifique de constructions pour évaluer les effets sur la dynamique MT transfectées HUVEC. analyse d'image de calcul basée sur PlusTipTracker de EB3MT, plus marqué au extrémités était de mesurer la vitesse de croissance MT et la durée de vie de croissance MT dans les images en accéléré, de mesurer et de comparer les effets des manipulations expérimentales sur la dynamique de croissance MT. Cette méthodologie permet l'étude de la dynamique MT et l'identification de la façon dont la régulation localisée de la dynamique MT dans les régions sous-cellulaires contribue aux processus angiogéniques des CE de ramification et de la migration. Ces techniques sont applicables aux enquêtes de toute carte qui peuvent être marquées par fluorescence et exprimés dans les cellules vivantes.

Protocol

1. HUVEC Culture et entretien

  1. Préparer le milieu de base endothéliale complète en ajoutant la totalité du contenu du paquet moyen de supplément de croissance endothélial cellulaire et 5% de pénicilline / streptomycine mélange d'antibiotiques au phénol médias basale endothéliale rouge libre (voir Matériaux / Liste d'équipement pour plus de détails). Chauffer un milieu de base endothelial complet à 37 ° C dans un bain d'eau.
  2. Enlever une cryofiole HUVEC de stockage d'azote liquide et décongeler rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 min. Lorsque ~ 80-90% décongelé, ajouter 500 pi de milieu basal endothelial complète chauffée à l'cryovial, mélanger par pipetage, et distribuer les cellules uniformément dans une boîte de culture de tissu en plastique de 100 mm contenant 15 ml de milieu de base endothéliale complète réchauffé.
  3. Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2. Permettre aux cellules d'adhérer pendant une nuit. Ne pas supprimer ou modifier le milieu de culture cellulaire.
  4. Lorsque la boîte de 100 mm est> 90% confluentes, transférer HUVEC into 75 cm 2 de culture de tissus traités flacon et maintenir à> 60% de confluence à tout moment (voir l' étape 1.5).
    Remarque: Lorsque maintenu à une densité> 60%, HUVEC temps de doublement est toujours 18-20 h.
    1. Pour les situations où les cellules repiquage est pas nécessaire (ie la densité est <90%), aspirez le moyen et le remplacer par du milieu frais basale endothéliale complète toutes les 48 h.
  5. Lorsque HUVEC atteint> 90% de confluence, rincer 2 fois avec 10 ml de PBS 1x, puis retirer les cellules de la boîte de culture de tissu en les traitant de 1,5 ml de 0,25% de trypsine pendant 1-2 min à 37 ° C. Remarque: La viabilité des HUVEC est fortement réduite par l'extension de la durée d'exposition à la trypsine.
  6. les cellules de secours en ajoutant un milieu de base endothelial 8,5 ml complet du / HUVEC mélange de trypsine dans un rapport de 4: 1 basal endothelial complète de support: trypsine (rapport minimal), et recueillir dans un tube conique de 15 ml.
  7. Centrifuger à 1400 xg pendant 4 min. Aspirerle surnageant.
  8. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de milieu de base endothelial complet et ajouter les cellules à un nouveau 225 cm 2 flacon de culture de tissu contenant 25 ml de milieu de base endothelial complet.

2. Coverslip Préparation Avant HUVEC Culture

  1. Lamelles de revêtement avec fibronectine Substrats.
    1. Préparer grinçant-propre 22 mm No. 1,5 lamelles 39 et conserver à température ambiante (RT) dans 100% d' éthanol.
    2. Utilisez un brûleur Bunsen à la flamme d'une lamelle et le placer dans une boîte de Pétri de 35 mm en utilisant une pince à épiler.
    3. Préparer un / mélange PBS fibronectine en mélangeant 10 ul de fibronectine stock (1 mg / ml) avec 990 pi de PBS.
    4. Introduire à la pipette 250 ul de PBS / mélange de fibronectine sur la lamelle couvre-objet dans la cuvette de 35 mm. Étendre uniformément pour couvrir la surface de la lamelle.
    5. Laisser incuber le plat pendant un minimum de 3 heures à 37 ° C et rinçage 3 fois avec 2 ml de 1 x PBS avant de les utiliser.
  2. activation Coverslip
    1. Placez un 22 mm No. 1,5 lamelle dans 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane pendant 10 min sur une plaque d'agitation. Après incubation, laver 10 fois pendant 2 minutes chacun en double distillée H 2 O (ddH 2 O).
    2. Incuber la lamelle à 0,5% de glutaraldéhyde pendant 30 minutes sur une plaque d'agitation. Après incubation, laver 10 fois pendant 2 min dans ddH 2 O.
  3. polyacrylamide Préparation
    1. Préparer un gel PA avec une conformité de 0,7 kilopascals (kPa) en ajoutant 3,75 ml de 40% d' acrylamide, 0,3 ml de 2% bis-acrylamide, et 0,95 ml de ddH 2 O.
    2. Préparer une solution de travail de 10% de persulfate d'ammonium (APS) et stocker sur la glace jusqu'à utilisation.
    3. Pour préparer la solution PA pour 1 lamelle (volume total = 166,7 pi), ajouter 0,83 ul de ddH 2 O, 41,7 pi de la solution de bis-acrylamide (faite à l' étape 2.2.2.1), 124 pi de 10% APS, et0,25 ul de TEMED.
    4. Immédiatement servir de pipettes 15 pi de solution PA sur une lame de verre hydrophobe (voir la liste des réactifs) et couvrir avec un actif de 22 mm No. 1,5 lamelle. Laisser le PA à polymériser pendant 20 min à température ambiante.
    5. Retirez la lamelle et transférer à un plat de 35 mm. Laver 3 fois avec 2 ml de 1 x PBS. Stocker pour <2 semaines à 4 ° C.
    6. À lier la fibronectine sur le gel de polyacrylamide, d'exposer les lamelles de polyacrylamide enrobées à 2 mM sulfo- SANPAH à 7500 J de lumière UV (254 nm). Rincer une fois avec ddH 2 O.
    7. Préparer un / mélange PBS fibronectine en mélangeant 10 ul de fibronectine stock (1 mg / ml) avec 990 pi de PBS.
    8. Pipette 250 pi de la fibronectine / mélange PBS sur la lamelle (s) dans une boîte de Pétri de 35 mm. Étendre uniformément pour couvrir la surface de la lamelle.
    9. Laisser incuber le plat pendant un minimum de 3 heures à 37 ° C et rinçage 3 fois avec 2 ml de 1 x PBS avant de les utiliser.
class = "jove_title"> 3. ADNc Transfection et HUVEC Culture sur Coverslip

  1. Suivez les étapes 1,5-1,6.
  2. L'utilisation d'un hémocytomètre, compter le nombre de cellules et de recueillir un volume contenant 100.000 cellules / lamelle (pour des expériences non-migration) ou 500 000 cellules / lamelle (pour les expériences de migration). Pellet les cellules par centrifugation à 1400 g pendant 4 min.
    Remarque: le protocole de migration est décrite dans la section 9, ci-dessous.
  3. Resuspendre les cellules doivent être transfectées avec 100 ul de tampon d'électroporation. Mélanger avec 1 pg d'ADNc et la placer dans cuvette d'électroporation. Cellules électroporation: mélange d'ADN en utilisant le programme désigné pour HUVEC électroporation (par exemple le programme #: A-034).
  4. Sauvetage des cellules avec 500 pi de cellules complètes de milieu et de la plaque de base endothéliales transfecté sur une 22 mm No. 1,5 lamelle de fibronectine (voir le protocole 2.1, ci-dessus). Incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures pour laisser le temps pour l'expression de constructions d'ADNc.
le "> 4. Préparation des échantillons pour l'imagerie

  1. Couper un ruban double face en 2,5 cm x 0,65 cm bandes.
  2. Obtenir une lame de verre propre. Prenez deux bandes de ruban adhésif double face et fixez-les horizontalement le long du bord supérieur et inférieur de la diapositive. Remarque: Il est important de permettre à une petite quantité d'espace entre la bande et le bord de glissière pour fermer hermétiquement la chambre de la manière décrite dans l'étape 4.5).
  3. Mont lamelle (de l'étape 3.4; cellule vers le bas) de telle sorte que 2 bords de la lamelle reste sur la bande. Utilisez une pince pour presser doucement vers le bas pour fixer la lamelle.
  4. À l'aide d'une micropipette, ajouter 40 ul de milieu d'imagerie (milieu basal endothelial complet supplémenté avec 25 uM HEPES) entre la lamelle et la lame. Faire en sorte que l'espace entre la lamelle et la lame est complètement rempli avec un milieu de formation d'image. support d'imagerie excès Aspirer (si nécessaire).
  5. Sceller tous bords avec valap chaud (1: 1: 1 pétrole gelée: lanoline: paraffine). Vérifiez les fuites en poussant GenTLy sur la lamelle en verre.
  6. Lieu monté et scellé sur lamelle préchauffé (37 ° C) stade de microscope.

5. Microscopie

  1. À l'aide d'un microscope disque rotatif confocal équipé d'un 60X, 1,40 Ouverture Numérique (NA) Contraste interférentiel différentiel (DIC) immersion dans l'huile lentille d'objectif, un système de surveillance automatisée de mise au point (PSF), un obturateur électronique pour l'éclairage transmis, X et Y motored étape, les filtres passe-bande logés dans une roue de filtre électronique, et un module de combinateur laser monolithique, concentrer le microscope à l'interface de la cellule / lamelle et utiliser la manette de platine du microscope pour localiser une seule cellule.
  2. Cliquez sur "Paramètres de la caméra" panneau dans le logiciel d'image. Dans la fenêtre déroulante "temps d'exposition" du panneau Réglages de l'appareil, sélectionnez 400 msec.
    Note: Les temps d'exposition peuvent varier et doivent être déterminées empiriquement.
  3. Cliquez sur le panneau "ND Acquisition" dans lalogiciel d'image de programme. Dans l'onglet lambda (λ) du panneau ND Acquisition, cliquez sur les cases à cocher pour sélectionner les lasers nm 488 et 561. Dans l'onglet «temps» du panneau ND Acquisition, définissez le temps d'acquisition de 2 sec et le temps total de 2 min.
  4. Cliquez sur le bouton "Exécuter maintenant" dans le panneau ND Acquisition d'acquérir un time-lapse séquence d'images de 2 min à 2 intervalles d'acquisition de sec en utilisant un msec temps d'exposition de 400 pour les deux l'éclairage 488- et 561 nm.
  5. Dans le panneau "Config optique" du programme de logiciel d'image et en utilisant les réglages de l'appareil décrit à l'étape 5.2, cliquez sur le bouton laser de 405 nm, puis cliquez sur "Acquérir" pour capturer une image unique de la protéine fluorescente bleue (BFP) Les protéines marqués au .
    Remarque: Il est en général souhaitable de limiter l'exposition de la cellule (fréquence de capture d'image et / ou le temps d'exposition) à 405 nm illumination laser comme cette longueur d'onde peuvent endommager les cellules au cours du temps.
    1. Pour les études MCAK-shRNA, uncquire une seule image 405 nm pour vérifier l'expression du shRNA BFP marqué.
  6. Dans le panneau "Config optique" du programme de logiciel d'image et en utilisant les réglages de l'appareil décrit à l'étape 5.2, cliquez sur le bouton DIC puis cliquez sur "Acquérir" pour capturer une seule image DIC de la cellule pour ramification analyse de la morphologie (voir la section 10 , au dessous de).
  7. Suite à l'acquisition de l'image, utiliser la fonction «luminosité / contraste" dans le programme de logiciel d'image pour augmenter numériquement le signal d'image.
  8. Export de la luminosité et des images à contraste ajusté. Cliquez sur "Fichier" puis cliquez sur "Enregistrer sous", puis cliquez pour sélectionner ".tif" pour le type de fichier image.
    Note: Ceci génère habituellement 61 .tif fichiers image à partir d'un temps d'acquisition-lapse 2 min unique lorsqu'il a été capturé comme décrit à l'étape 5.4.

6. MT Dynamics Analysis

  1. Pour le suivi de EB3, utilisez le logiciel plusTipTracker 35, open-source,logiciel de calcul à base de MatLab conçu pour la détection automatique, le suivi, l'analyse et la visualisation de marquage fluorescent EB.
  2. plusTipGetTracks interface graphique utilisateur (GUI)
    1. Pour accéder à l'interface graphique plusTipGetTracks, plusTipGetTracks type.
    2. Pour la détection de EB3 comète, utiliser l'interface graphique pour parcourir et sélectionner le répertoire parent qui contient les images .tif.
    3. Dans le panneau de l'interface graphique plusTipGetTracks des paramètres de suivi, entrez les valeurs suivantes: Recherche Gamme Radius = 5-10; Longueur minimale Sous-Track = 3; Max Gap Longueur (Frames) = 12; Max Rétrécissement Factor = 1,0; Angle maximum Forward = 25; Angle maximum arrière = 10; Fluctuation Rayon (Pixels) = 2; Frame Rate (s) = 2; Pixel Taille (pm) = 110.
      Remarque: d'abord vérifier les paramètres de suivi optimaux en utilisant le plusTipParamSweepGUI sur un ensemble représentatif de .tif fichiers image. La valeur indiquée pour la taille de pixel est spécifique à l'objectif utilisé pour acquérir l'image time-lapses (voir les étapes 5.1-5.2, ci-dessus).
    4. Pour la région d'intérêt (ROI) la sélection, de créer des masques binaires de la cellule entière en traçant manuellement le bord de cellule en utilisant l'image DIC de la cellule pour former un polygone.
    5. Pour la sous-région d'intérêt (sous-ROI) sélection, créez avant et arrière masques de bord en tirant manuellement une ligne épaisse de 2 points à travers la cellule enroulée bord d'intérêt à l'aide d'un outil de sélection de sous-ROI plusTipTracker modifié.
      Remarque: La ligne doit être tracée parallèlement au bord de la plaie à l'endroit où la cellule d'intérêt va au - delà des cellules plaie bord 31 voisine.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Vérifier et inspecter visuellement les superpositions de piste des images .tif stockées dans le dossier "ROI" en cliquant sur le bouton "Plot Tracks" dans la colonne de piste surimpressions. Répétez l'opération pour tous les recouvrements de piste.
    2. Effectuer le regroupement de données en cliquant sur le bouton "Créer des groupes" dans la colonne Options. Sélectionnez le expérimdonnées entales qui appartiennent au même ensemble de données en cliquant sur les fichiers de données. Enregistrer la sélection en donnant le «groupe» un nom qui peut être facilement identifié (par exemple, «groupe de contrôle»).
    3. Pour sous-ROI MT dynamique de croissance des mesures, entrez le nombre minimum de trames d'image que l'on EB3 comète piste doit être détectée dans le sous-ROI afin de se qualifier comme une «piste» et extraire des excursions de croissance MT dans le avant et arrière ROI de bord en cliquant sur "sélection manuelle" dans le panneau "Sub-ROIs" de l'interface graphique.
      Remarque: Par exemple, utiliser 3 images (6 secondes) que la longueur minimale de détection à extraire comme une «piste». pistes extraites des sous-ROIs sont stockés dans un dossier sous-projet dans le dossier de retour sur investissement d'origine pour chaque cellule.
    4. croissance MT sous-piste et de l'analyse des sous-populations
      1. Calculer la vitesse moyenne de croissance MT et MT durée de vie de croissance pour les ensembles de données "groupe" (voir étape 6.3.2), pour chaque ROI moyenne (voir step 6.2.4), et pour chaque sous-ROI (voir étape 6.2.5).
    5. Dans les parcelles Scatter colonne Quadrant du plusTipSeeTracks GUI, cliquez sur "Sélectionner les groupes" et cliquez sur les groupes (créé à l'étape 6.3.2) à comparer.
      1. Sélectionnez "Vitesse de croissance" pour l'option de l'axe des x et tapez la valeur moyenne pour la vitesse de croissance (de l'étape 6.3.4) dans la boîte. Sélectionnez «durée de vie de croissance" pour l'option de l'axe y et tapez la valeur moyenne pour la durée de vie de croissance (de l'étape 6.3.4) dans la boîte.
    6. Cochez la case à côté de "Supprimer les pistes au début / fin» et à côté de "Traitement par lots sur les groupes." Cliquez sur "Make Parcelles" pour générer un profil de distribution pour les pistes de croissance MT pour l'ensemble de la cellule, les bords d'attaque et bords de fuite sous-ROI.
      Note: Pour les études décrites ici, les pistes de croissance MT sont répartis en quatre sous-populations: lente et de courte durée, lente et longue durée de vie, rapide et de courte durée, et rapide et de longue durée.
    7. Cliquez sur "Data", puis cliquez sur "Analyse des données" dans la fenêtre déroulante de données. Sélectionnez "test t: deux échantillons supposant des variances égales" pour comparer les vitesses moyennes de croissance de MT et la durée de vie de croissance MT. Mettez en surbrillance les cellules de données dans la feuille de calcul où les comparaisons t-tests aboutissent à une valeur de p <0,001.

7. colocalisation Analyse

  1. Pour soustraction de fond, en utilisant l'outil "ligne" du programme de logiciel d'imagerie, dessiner une région d'intérêt (ROI) en cliquant sur ​​l'écran pour créer une forme carrée qui est de 10 um 2 sur l'image verte de canal (488 nm excitation) à une position dans laquelle il n'y a pas de fluorescence des cellules (le fond). Répétez cette opération pour l'image de canal rouge (561 nm d'excitation) en utilisant les images de l'étape 5.8.
  2. Utilisation du pr logiciel d'imagerieogramme, cliquez droit sur le retour sur investissement de l'étape 7.1 et sélectionnez "Définir comme fond ROI." Cliquez sur "Image", puis cliquez sur "fond soustraction" dans la fenêtre déroulante pour soustraire les valeurs de fond moyennes (de l'étape 7.1) de l'ensemble image. Effectuer soustraction de fond pour les cellules co-exprimant Em-Aurora A et soit mCherry-MCAK, Mapple-EB3, ou Mapple-tubuline.
  3. Dans l'image du canal rouge de fond soustrait seulement, cliquez sur le ruban binaire et sélectionnez "Définir Seuil", puis sélectionnez la fonction "par canal" pour exclure le marqueur fluorescent désigné.
    Remarque: L'étape de seuillage a été réalisée soit sur le mCherry-MCAK, Mapple-EB3, ou l'image Mapple-tubuline pour permettre de tracer des lignes qui ont marqué spécifiquement l'objet seuillée pour l'analyse co-localisation (voir étape 7.4).
  4. Utilisation de l'outil de ligne dans le logiciel d'imagerie, tracer une ligne épaisse de 2 points sur les objets exclus au sein de l'image seuillée.
  5. Sélectionnez les objets de ligne tracée à l'étape 7.4. Copiez et collez les objets de ligne du canal rouge sur son (Em-Aurora A) image correspondant de canal vert.
  6. Mesurer les valeurs d'intensité de pixels en niveaux de gris sous la ligne des objets pour calculer la co-localisation et la valeur totale Em-Aurora-A pour chaque cellule individuelle en sélectionnant "Mesure", puis "Profil de l'intensité" de la fenêtre déroulante dans le logiciel d'imagerie.
    1. Organisez les données par traitement expérimental et de la région sub-cellulaire en exportant vers un logiciel de tableur et d'enregistrer le fichier en tant que type .xls (par exemple, "control_grayscale_intensity.xls").
      Remarque: Les données présentées de cette manière représente la fraction de co-localisation de Em-Aurora-A mesurée totale par région sub-cellulaire.
  7. En utilisant les valeurs mesurées à l'étape 7.6, répétez l'étape 6.3.7 pour calculer la signification statistique en utilisant p <0,05 comme seuil de signification.
  1. Fixer les cellules (voir étape 3.4) avec paraformaldéhyde / glutaraldéhyde co-extraction / tampon de fixation (PGF-MEHP; paraformaldéhyde 4%, 0,15% de glutaraldéhyde, 0,2% de détergent dans 60 TUYAUX mM, HEPES 27,3 mM EGTA 10, et mM MgSO 8.2 4, pH 7,0) pendant 10 min à température ambiante.
  2. Rinçage 3 fois pendant 5 min avec 2 ml de 1 x PBS.
  3. Traiter 2 fois pendant 15 minutes avec 0,01 g / ml de NaBH4 dans PBS 1x pour étancher les aldéhydes réactifs.
    Note: NaBH 4 forme des bulles qui peuvent causer les lamelles de flotter. Il est essentiel que les lamelles restent submergées au cours de ces incubations. Si les lamelles commencent à flotter, utiliser une pince pour élever un bord de la lamelle afin de permettre aux bulles d'échapper.
  4. Rincer 2 fois avec PBS 1x avant de bloquer avec du lait sans gras 5% en 1x PBS sur une plate-forme à bascule pendant 1 heure à température ambiante.
  5. Incuber les cellules dans des anticorps primaires (lapin anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) et le rat anti-α-tubuline (1: 500) préparée dans une solution PBS 1x. Incuber à 4 ° C sur une plate-forme pendant une nuit à bascule.
  6. Retirer les anticorps primaires et rincer 3 fois pendant 5 minutes dans 1 x PBS avant incubation avec des anticorps secondaires (âne anti-lapin (1: 1000) et de chèvre anti-rat (1: 1000)) préparé dans le lait sans gras 5% pendant 2 heures à 37 ° C.
  7. Mont lamelle sur une lame de verre en milieu de montage fluorescence optimisé. Sceller les bords de lamelle à la diapositive à l'aide de vernis à ongles transparent, et stocker dans l'obscurité à 4 ° C.

9. migration cellulaire Assay

  1. Effectuer la culture HUVEC pour les essais de migration tels que décrits ci-dessus (protocole n ° 3: ADNc Transfection et HUVEC Culture sur Coverslip, étapes 3,2-3,3).
  2. Après la transfection des cellules, des cellules de secours transfectées avec un milieu de base endothelial 80 ul complet. Pipeter l'échantillon 80 pi d'une seule goutte sur le centre d'un sèche fibronectine 22 mm ronde n ° 1,5 lamelle. Ne pas diffuser le dro 80 pip. Incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures pour laisser le temps à l'adhérence des cellules en une monocouche confluentes.
    Remarque: Le séchage de la lamelle couvre-objet est nécessaire pour empêcher la chute de 80 ul de se propager au contact de la lamelle. Cette approche permet d'HUVEC à se concentrer dans une petite zone de la lamelle et favorise ainsi la formation rapide d'une monocouche confluente de cellules.
  3. Rincer 2 fois en milieu de base endothéliale complète pour éliminer les cellules non attachées.
  4. Pour créer un "bord de la plaie," gratter la lamelle avec une lame de rasoir stérilisée par doucement glisser une lame de rasoir propre à travers la monocouche HUVEC (de l'étape 9.2). Maintenir la lamelle doucement en place avec des pinces pour empêcher un glissement de la lame de rasoir en cours de grattage.
  5. Permettre aux cellules de se rétablir dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 h. Assembler et lamelle (s) pour l'imagerie de montage (voir protocole n ° 4).
  6. Acquérir contraste de phase et des images 488 nm à 10 minutes d'intervalle pendant 12 heures sur le microscope en utilisant un10x phase de 0,45 NA objectif et un condenseur NA LWD 0,52 en utilisant le panneau "ND Acquisition" du logiciel d'acquisition d'image (décrit à l'étape 5.3).

10. Quantification des HUVEC Branching et migration

  1. Pour ramification analyse et pour permettre un éclairage uniforme de la cellule et la quantification objective, acquérir une image microscopique d'un HUVEC transfectées (voir l'étape 3.3) et exprimant le Mapple-C1 construction d'ADNc, un marqueur de volume cellulaire.
  2. Utilisation du logiciel d'imagerie, ouvrez l'image Mapple-C1 et étiqueter la position des deux côtés de la branche où la membrane affiche le plus grand angle de courbure. Connectez ces deux points par une ligne droite. Cette ligne est l ' «origine de la branche."
  3. Utilisation de l'outil de ligne du logiciel d'imagerie, identifier visuellement les branches qui mesurent> 10 mm de longueur de l ' «origine de la branche" déterminée à l'étape 10.2. Calculer la longueur de la branche en mesurant la distance entre ee "origine de la branche" au point le plus distal de la pointe de la branche (voir la figure 4).
  4. Comptez le nombre de saillies ramifiées qui mesurent> 10 mm de longueur pour obtenir "numéro de la succursale de la cellule."
  5. Pour l' analyse de la migration, en utilisant les images recueillies à l' étape 9.6, identifier visuellement une HUVEC enroulée bord sur la base de l' emplacement physique ( à savoir des cellules physiquement sur ​​le bord de la plaie) et le profil d'expression ( par exemple, sélectionner une cellule du bord de la plaie verte si l'expérience implique expression de la GFP).
  6. En utilisant les images à contraste de phase de la cellule, identifier visuellement le noyau (la structure sphérique semi-transparent à proximité du centre de la cellule), puis identifier visuellement le nucléole (petit, de couleur foncée, de la structure sphérique dans le noyau) à le premier point des images de time-lapse de temps. Cliquer sur la position du nucléole pour marquer les coordonnées x et y du nucléole.
  7. En utilisant le logiciel d'imagerie, la main-suivre lanucléole images time-lapse successifs en cliquant sur ​​la position du nucléole pour marquer les coordonnées x et y du nucléole dans chaque trame du film time-lapse (Figure 4).
  8. Utilisation du logiciel d'imagerie, cliquez sur "Fichier" puis cliquez sur Enregistrer sous "puis cliquez sur pour sélectionner le type de fichier image" .xls ".
  9. Ouvrez le fichier de données à la main suivi (de l'étape 10.8) à l'aide d'un logiciel de tableur. Calculer la vitesse de migration moyenne et la distance moyenne de la migration à l'origine.
  10. L'utilisation d'un logiciel de feuille de calcul, cliquez sur «Données», puis cliquez sur "Analyse des données" dans la fenêtre déroulante de données. Sélectionnez Bonferroni corrigée, l'analyse d'un mode de test de variance avec> 95% comme seuil de signification statistique.

Representative Results

culture HUVEC pour la microscopie de cellules vivantes
Imagerie des cellules vivantes des cellules HUVEC exprimant des protéines fluorescentes exige que les HUVEC sont maintenues dans un milieu approprié pour la croissance cellulaire normale et l' entretien, ainsi que l' expression des protéines et la fonction normale. La figure 1 montre une représentation schématique du protocole utilisé pour préparer un tampon et un système fermé qui maintient optimisé les caractéristiques optiques pour collecter des images en accéléré des cellules vivantes. Bandes minces de ruban adhésif double face sont placés sur une lame de verre (figure 1A) et la lamelle contenant le HUVEC cultivées est inversée sur le dessus de la bande de telle sorte que les cellules sont confrontés à la diapositive (figure 1B). De cette manière, la bande offre un petit espace entre les deux surfaces de verre, et crée un espace dans lequel les cellules peuvent être baignés dans les milieux de culture cellulaire appropriée (figure 1C; voir le protocole 4, ci - dessus). jena étape finale, la lamelle de verre est scellée sur la lame de verre à l' aide d' une vaseline: lanoline: cire de paraffine (1: 1: 1 mélange valap, la figure 1D) pour établir un système fermé. Cette méthode de culture cellulaire a été utilisée à la fois la plus courte imagerie séquence temporelle des comètes EB3 et pour la séquence de temps plus longue ramification et les expériences de migration. En outre, la consistance de la cire de valap permet un retrait facile de la lame de verre et la lamelle couvre-objet à la fin d'une imagerie des expériences telles que des approches supplémentaires, y compris la fixation et immunomarquage (voir protocole n ° 8), peut être effectuée sur la même lamelle couvre-objet et de l'échantillon de cellules qui a été visualisée en utilisant l'approche d'imagerie des cellules vivantes.

Figure 1
Figure 1:. Méthodologie de la culture HUVEC pour des cellules vivantes imagerie microscopique (A) Couper 2 morceaux de ruban adhésif double face en 0,65 cm x 2.50 cm bandes rectangulaires et obtenir un morceau de ruban adhésif double face horizontalement le long du bord supérieur de la lame, et l'autre pièce, le long du bord inférieur de la diapositive. Il est important de permettre à une petite quantité d'espace entre la bande et le bord de glissière pour fermer hermétiquement la chambre , comme décrit en (D). (B) En utilisant une pince retirer la lamelle contenant HUVEC et inversent la lamelle (côté de la cellule vers le bas) sur le dessus des morceaux de ruban adhésif. (C) En utilisant une micro - pipette, ajouter 40 ul de milieu d'imagerie (milieu basal endothelial complet supplémenté avec 25 uM HEPES) entre la lamelle et la lame de verre. Assurez-vous que l'espace entre la lamelle et coulissant est complètement rempli avec les médias d'imagerie et d'éviter les bulles. Utiliser un aspirateur le long du bord de la lamelle couvre-objet pour éliminer l'excès de support, si nécessaire. (D) Utilisez valap chaud (1: 1: 1 Vaseline: lanoline: paraffine) pour sceller autour des bords de la lamelle. Vérifier les fuites des médias d'imageries en poussant autour doucement sur la lamelle. Utilisez valap supplémentaires pour remédier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

suivi automatique de EB3 marqué par fluorescence permet une analyse complète de la cellule entière et la dynamique régionale de croissance de MT. La collection d'images microscopiques, claire, distincte et très temps et résolue dans l'espace de la protéine EB3 est essentielle pour l'analyse des mouvements EB3 dans la cellule. l'expression de HUVEC EB3 marqué par fluorescence varie considérablement d'une cellule à l'intensité de fluorescence et augmente généralement au sein de la même cellule sur une période d'une heure. Ainsi, il est important d'examiner et de surveiller ces changements dans le profil d'expression afin d'identifier les effets potentiels de l'augmentation de l'expression EB sur la dynamique de croissance MT. Ce mieux est accompli en évaluant de gris fluorescence intensitles profils y pour chaque cellule imagée, puis restreindre l'analyse des données à ces cellules qui présentent une plage définie de profils d'expression de gris. L'évaluation initiale du profil d'expression des ensembles de données est critique et doit être comparée à MT dynamique de croissance des données qui sont obtenues par le logiciel plusTipTracker pour chaque cellule. Les profils d'expression peuvent être représentées graphiquement en fonction MT vitesse de croissance et la durée de vie de la croissance MT pour chaque cellule au sein d'un groupe expérimental, afin de déterminer l'intervalle désiré d'expression d'échelle de gris et d'identifier d'éventuelles valeurs aberrantes.

La figure 2 met en évidence une HUVEC cultivées sur un substrat de fibronectine (voir le protocole 2.1, ci - dessus) et en exprimant près des niveaux optimaux de EB3 Mapple marqué. Comètes EB3 fluorescentes sont présentés dans une série time-lapse d'images sur une période de 12 sec (figure 2A). Analyse des comètes EB3 utilisant le logiciel plusTipTracker implique un automatisé, EB3 comète dete trame par tramection (points verts et jaunes, la figure 2B). Les comètes détectées à l' intérieur de chaque trame sont ensuite reliés, en fonction de leur changement de position de trame à trame, pour générer des pistes EB3 et une superposition de piste EB3 visuelle (figure 2C-F). superpositions de piste sont codés par couleur et les distinctions de couleur peuvent être déterminées par des paramètres entrés par l'utilisateur. Généralement, ces distinctions utilisent la moyenne globale de MT vitesse de croissance et la croissance MT vie 5,31 et ainsi diviser les données en quatre groupes: lente et de courte durée (rouge), lent et long terme (jaune), rapide et court vécu (vert), et la croissance de MT rapide et longue durée de vie (bleu; Figure 2G). suivi PlusTipTracker médiée MT dynamique de croissance EB3 marqué permet également les régions définies par l'utilisateur d'intérêt (ROIs). PlusTipTracker extrait les données de la piste de croissance de MT à partir du retour sur investissement défini par l' utilisateur (figure 2A, B et F), permettant ainsi de comparer les MT dynam de croissanceci à l'intérieur des régions différentes de la même cellule.

Figure 2
Figure 2: détection de la comète de EB3, le suivi et la sortie des données plusTipTracker (A) movie time-lapse d'un HUVEC Mapple exprimant EB3.. Le panneau de gauche montre une vue de cellules entières et le masque de cellule entière (ligne blanche) démarquage les limites des cellules. Boîte rouge représente la région agrandie montre les images de time-lapse (panneaux de droite). Panneaux de droite montrent de gris des images brutes time-lapse de comètes EB3 dans des cadres d'imagerie successifs (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) la détection de plusTipTracker des comètes EB3 des images présentées dans (A). Le panneau de gauche montre une vue entière de la cellule des comètes détectées (points jaunes). Boîte rouge représente la région agrandie montre les images de time-lapse (panneaux de droite). Panneaux de droite mettent en évidence cinq comètes EB3 détectées (flèches rouges) et oligo ces cinq comètes sur la période d'imagerie 12 sec. vert Les points représentent les comètes détectées EB3 qui n'existaient pas (ou ne sont pas détectés) dans l'intervalle de temps précédent. (C) de projection d'intensité maximale de 61 images (2 films min) des comètes EB3 indiquées dans (A). (D) plusTipTracker MT piste de superposition des mêmes 61 images (film 2 min) figurant dans (C). (E) Zoom de projection d'intensité maximale (boîte rouge C). (F) Zoom de plusTipTracker MT piste de superposition de projection d'intensité maximale (boîte rouge D). Légende pour les superpositions de piste figurant dans (D) et (F) (G) Color-codée. Désignation aussi lent, rapide et de courte durée ou de longue durée est basée sur la valeur moyenne pour toutes les pistes de croissance mesurées dans un groupe de dix Mapple-EB3 HUVEC exprimant. Pour faciliter la visualisation, les superpositions de piste (D) et (F) sont générées en utilisant les intensités de pixel de l'image inversée de la cellule représentée en (A). Les barres d'échelle = 20 pm./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

HUVEC ramification et les schémas de migration sont sensibles aux Mécano-physiques des signaux de l'ECM.

HUVEC sont bien connus pour répondre à différents types de signalisation des indices et, ce faisant, de subir des altérations morphologiques qui dictent une réponse cellulaire appropriée à la queue de signalisation particulière (s) 36,40-42. HUVEC cultivées sur des substrats revêtus de fibronectine de verre (figure 3A), ou rigides ECMs de polyacrylamide deux dimensions (55 kPa) affichent typiquement une morphologie ronde ou allongée , avec quelques parties saillantes ramifiées distinctes (figure 3B). Cependant, lorsqu'elle est cultivée sur de polyacrylamide ECMs 2 dimensions très souples (0,7 kPa), HUVEC afficher une morphologie très ramifié qui est connu pour résulter d'une application induite par le basla régulation de la myosine-II contractilité 4,5,31 (figure 3C). Ainsi, HUVEC réguler leur morphologie cellulaire par ECM mechanosensing, et ceci est réalisé grâce à la modulation localisée de la dynamique MT et acto-myosine contractilité.

Parce HUVEC afficher une grande variété d'attributs morphologiques, afin de mesurer HUVEC ramification, il est essentiel de définir d'abord ce que une saillie est ramifié, puis de définir comment une saillie ramifiée sera mesurée objectivement. Une technique utilise une méthode en quatre étapes par lequel une frontière de cellule ou "masque" est généré en traçant les bords de la cellule en utilisant une image d'une cellule exprimant un marqueur de volume fluorescent pour définir les bords des cellules (Figure 3D) à la main. À la suite de la génération de masque, les origines de la branche sont définies en localisant plus grand angle de courbure entre la saillie ramifiée et le corps de la cellule. Une ligne est tracée à Demark le «origine de la branche" (lignes obliques violettes; Figure 3E). Numéro de la Direction générale est mesurée simplement en comptant le nombre de branches avec une origine de branche définie (Figure 3F). Longueur de la Direction générale est mesurée comme la distance à l'origine de la branche à la pointe de la branche distale (figure 3G). Afin d' éviter l' inclusion de petites projections lamellipodial de l' analyse des données, critère supplémentaire exigent que les branches doivent être plus longue ( "longueur de branche") que larges (à l ' «origine de branche"), et que les branches doivent être d' au moins dix microns de longueur 5 31.

Figure 3
. Figure 3: Analyse de la morphologie des cellules HUVEC ramification (A - C) des exemples d'images de DIC HUVEC cultivées sur fibronectine verre revêtu d' ECM (A) rigide (55 kPa) des messages ECM de polyacrylamide (B) et souples (0,7kPa) ECMs de polyacrylamide (C). Ramification est augmenté de façon spectaculaire dans les HUVEC cultivées sur 0,7 kPa ECM de polyacrylamide (C) par rapport à ECM plus sévères (A, B). (D). DIC image microscopique (image de gauche) d'un HUVEC transfectées exprimant un Mapple-C1 construction d'ADNc (un marqueur de volume cellulaire; image de droite). (E) Définir l'origine de la branche en plaçant le plus grand angle de courbure (la position où la membrane affiche la plus forte courbure, les lignes de couleur pourpre) de chaque côté de la branche, puis connectez les angles avec une ligne droite (lignes bleues) . (F) Identifier et sélectionner des saillies ramifiées qui étendent> 10 um à partir de la «origine de la branche" (définie dans E). Comptez le nombre de saillies ramifiées pour obtenir le "numéro de la succursale." (G) Mesurer la distance entre le centre de l ' «origine de la branche" à la most point distal de la branche en utilisant l'outil de ligne dans les annotations et les mesures application de NIS Elements Software pour obtenir la "longueur de la branche." Barres d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Outre le respect de l'ECM de détection, HUVEC détecter et de répondre à l'élimination des contacts cellulaires adjacents comme induite par zéro blessure aussi. Dans le test de migration, HUVEC cultivées en monocouche sont soumis à une blessure à la rayure et les caractéristiques de migration sont mesurés (voir Protocole 9, ci-dessus). Après l' induction de la plaie en grattant la monocouche, HUVEC blessure pointe polarisent en développant un bord d' attaque protrusion qui se prolonge dans la plaie (figure 4A, t = 0 h). Pendant une période de temps de 10-12 heures, polarisés HUVEC plaie pointe migrent dans la zone de la plaie et de combler leblessure, l' établissement d' une nouvelle monocouche confluentes (figure 4A, t = 11 h). Comme HUVEC ramification, les données actuelles indiquent que la polarisation et de la migration dépend essentiellement de la réorganisation coordonnée de la MT et le cytosquelette d' actine 43-49. Ceci est réalisé, en partie, par l' inhibition induite localisée de MCAK-MT désassemblage à la fine pointe, mais pas au bord de fuite de la plaie bord HUVEC 31. La sensibilité de la dynamique MT enroulée induite par polarisation est initiée par le Rac1 GTPase, qui cible de nombreuses protéines régulatrices en aval, y compris les Aurora-A kinase qui phosphoryle et inhibe MCAK au niveau du bord d'attaque, ainsi que d'autres kinases qui sont capables d'inhiber ou d'activer MAPs localement MT moduler la croissance et le retrait 18,31,36,48,50-53. preuve expérimentale étendue soutient l'idée que la coordination de bord d'attaque et de fuite saillie contraction de bord est régie par des cycles d'activation Rac1de promouvoir MT assemblage à la fine pointe et de l' activation RhoA à acto-myosine contractilité au bord de fuite, entraînant ainsi la motilité dirigée 9,41,51,52,54-58.

À ce jour, il n'y a pas une méthodologie établie pour effectuer le suivi automatisé de la migration cellulaire. Ceci est le résultat de la difficulté d'analyser informatiquement les limites des cellules ECM qui sont constamment en train de changer la plaie sous forme de cellules de pointe polarisent et migrent. Alors que de nombreux programmes de logiciels sont capables de suivre les cellules marquées par fluorescence 59-64, la population de HUVEC marqué par fluorescence dans des expériences de migration plaie de pointe est d' environ 30-40% de la population totale HUVEC, et donc la majorité des cellules plaie bord doit visualiser par contraste de phase ou d'imagerie DIC. En outre, il est important lorsque l'on mesure la migration des plaies bord pour évaluer les cellules fluorescentes et non fluorescentes à l'intérieur de la même blessure afin d'identifier spécifiqueeffets de constructions d'expression à la fois au sein des groupes d'études expérimentales et entre groupes d'études expérimentales. À l' heure actuelle, la meilleure approche pour mesurer la migration HUVEC est d'utiliser une approche de suivi de la main dans lequel une cellule enroulée bord est d' abord identifié, puis le noyau et nucléole sont identifiés (figure 4B). Le nucléole est utilisé comme facteur déterminant de position pour le suivi des cellules en raison de sa densité élevée de diffusion de la lumière et de taille relativement petite. Ces deux caractéristiques du nucléole facilitent l'identification et de réduire les erreurs de mesure en limitant la zone dans laquelle l'utilisateur peut placer les positions individuelles de la voie. HUVEC pistes de migration sont ensuite générés en cliquant sur le nucléole dans successives time-lapse trames d'image. Enfin, la vitesse de migration et la distance de migration à l' origine sont mesurés et analysés pour le contrôle et les groupes de cellules expérimentales (figure 4B).

Figure 4 Figure 4: Analyse des HUVEC plaie de pointe et le suivi de la migration des images (A) 20X contraste de phase d'un time-lapse série d'imagerie 11 h de zéro blessure pointe HUVEC (aka "Migration Assay").. La blessure et la direction de la migration sont indiqués dans le tableau t = 0 h. HUVEC sont présentées pour traverser la plaie de pointe et avance dans la plaie jusqu'à ce qu'une monocouche de cellules est formée (t = 3,5 h - t = 11 h). (B) Analyse de test de migration laps de temps d' imagerie (comme indiqué en A) exige d' abord l'identification d'un HUVEC plaie bord traçable selon l'emplacement de la cellule ( à savoir les cellules physiquement au bord de la plaie) et le profil d'expression (i .e. , sélectionnez une cellule de bord de la plaie vert si l'expérience implique l' expression de la GFP). En utilisant l'image de contraste de phase, d'identifier le noyau et le nucléole. suivre la main le nucléole dans les images en accéléré successives en utilisant la unenotations et mesures application dans le logiciel NIS Elements pour déterminer la vitesse de migration et de la distance à l'origine. Les barres d'échelle = 100 um (A), 20 um (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Utilisation de HUVEC en Morphologie et migration expériences.
imagerie des cellules vivantes de la dynamique de croissance de MT EB3 marqué au sein de HUVEC nécessite des conditions de culture cellulaire appropriés et reproductibles afin de mesurer et d'évaluer les changements dans la croissance MT et HUVEC morphologie, de telle sorte qu'ils peuvent être affectés à une signalisation de la MEC cue. HUVEC représentent un excellent modèle pour l'étude de la forme des cellules et la motilité. Ils sont extrêmement sensibles à la transfection avec des ADNc marquées par fluorescence, ils présentent des morphologies dramatiques en réponse aux deux signaux de signalisation solubles et physiques, et ils maintiennent la capacité à s'organiser dans des tubes vasculaires lorsqu'ils bénéficient de conditions de culture de cellules appropriées 65-70. des cultures de cellules primaires, telles que HUVEC, nécessitent un traitement et le suivi du numéro de passage cellulaire prudent afin d'assurer que les cellules sont en bonne santé et qu'ils se comportent normalement lors de l'expérimentation. Par exemple, lors d'expériences portant sur l'cytoskeletonne et / ou la morphologie des cellules, des cellules HUVEC ne doivent pas être utilisés pour des expériences au-delà du dixième passage de la culture cellulaire, comme HUVEC commencent généralement à afficher des morphologies non uniformes autour de passage de douze à quinze.

La densité cellulaire est également un régulateur essentiel de la santé et de la prolifération HUVEC. enquêtes de branchement HUVEC (voir Protocole 10.01 à 10.04, ci-dessus) utilisent des cultures de densité relativement faible de la cellule afin de fournir les cellules d'espace physique pour interagir avec leur ECM et d'étendre les saillies ramifiées. En revanche, dans les études de migration plaie de pointe (voir Protocole 10/05 au 10/08), les HUVEC sont la culture en monocouche avant la blessure. En tant que tel, HUVEC blessure pointe affichent une morphologie relativement non-ramifié, étendre menant des saillies de bord, et présentent des interactions cellule-cellule avec leurs voisins immédiats comme ils migrent dans la plaie.

Mises en garde et avantages de suivi MT Dynamics dans Living HUVEC.
Spinning microscopie disque est une excellente approche pourtester des hypothèses expérimentales qui nécessitent image confocale clarté haute résolution temporelle. Avec le module de caméra et laser approprié, cette approche de microscopie est sensible à une faible émission de fluorescence et peut aider à photoblanchiment réduite par rapport à d'autres types de microscopie à fluorescence. Fait important, cette approche est également bien adapté à modéré à élevé résolution temporelle imagerie est nécessaire pour générer des mesures complètes de la dynamique de croissance MT en utilisant l'approche de l'étiquetage EB3, dans une variété de différents types de cellules.

Bien que la méthodologie de EB3 de l'étiquetage croissante MT plus-extrémités présente des avantages distincts par rapport à d'autres méthodes d'étiquetage par fluorescence MTs, elle a aussi des inconvénients uniques. Par exemple, il y a une partie de la gamme MT qui ne sont pas en croissance active à un moment donné, y compris à la fois la population de MTs désassemblage et la population de stabile, MTs non dynamiques 71-74. EB3 ne serait pas étiqueter ces deux populations de MTs etdonc la contribution de ces deux populations ne serait pas inclus dans l'analyse des données expérimentales. méthodes alternatives pour l'évaluation de l'ensemble du réseau de MT ont mis l'accent sur l'expression de la tubuline marquée par fluorescence, qui incorpore dans toutes les populations de MTs et permet l'identification de plus en plus, le rétrécissement, et stabile MTs. Cependant, en raison de la densité relativement élevée de la matrice MT près du centre de la cellule et à côté du centre organisateur des microtubules (MTOC), marquage de l'ensemble de la matrice MT crée un inconvénient dans l'exécution de l'analyse d'image des extrémités MT qui ne sont pas à proximité de la cellule périphérie 75-77. Des expériences utilisant deux couleurs co-marquage de MTs avec la tubuline fluorescente et EB3 fluorescente dans les cellules vivantes ont révélé, qualitativement, que la grande majorité des MTs de tubuline marqués sont également EB3 marqué 78. En outre, il n'a pas été une méthode efficace de suivi automatisé des MTs étiquetés avec la tubuline fluorescente. Cela signifie que les données collection et de mesures de la dynamique MT dans les cellules exprimant la tubuline fluorescente nécessitent un suivi de main de MTs individuels, un processus qui est sujette aux erreurs et fastidieux. Par conséquent, l' analyse automatisée de calcul EB3 marqué MTs est devenue la méthode préférée pour la mesure de la dynamique des MT , car il peut être appliqué à TA dynamique des expériences sur de nombreux types cellulaires et dans une variété de régimes expérimentaux 35,79.

Lier MT Growth Dynamics à HUVEC Morphologie et migration.
Du point de vue d'un enquêteur du cytosquelette, une adaptation extrêmement utile de l'plusTipTracker analyse automatisée de suivi est la capacité de mesurer et d'évaluer les deux cellules et régionales des changements entiers dans la dynamique de croissance MT. L'exigence d'une cellule à devenir polarisée est une condition préalable essentielle pour la migration cellulaire directionnelle. En tant que tel, les indices de signalisation polarisées sont connus depuis longtemps comme des facteurs clés de conduite pour la migration cellulaire directionnelle 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. En outre, en réponse à des interactions physiques avec l'ECM (par exemple, la conformité et la dimensionnalité mechanosensing), HUVEC moduler leur dynamique de MT en régulant localement MAPs pour promouvoir la croissance de MT dans les allongeant saillies ramifiées, et cela sert à guider la migration HUVEC dans le sens de la cue 5,31,88. Ainsi, la polarisation en réponse à extracellulaires signalisation des indices met en évidence la nécessité d'une évaluation expérimentale des changements localisés dans la dynamique du cytosquelette.

Simultanée imagerie des cellules vivantes de la dynamique MT de croissance (en utilisant l'approche de EB3) et la migration des cellules HUVEC est extrêmement difficile à réaliser parce que MTs poussent sur une échelle de temps de secondes, tandis que les changements dans la morphologie cellulaire et la migration directionnelle se produisent sur une échelle de temps des heures. Pourtant, les deux processus sont intimement linkeré. De plus, en continu, l'imagerie rapide de EB3 d'marqué par fluorescence sur la seconde échelle de temps conduit à photoblanchiment du signal de EB3. Les tentatives de surmonter ce problème en effectuant de courtes séries d'imagerie de EB3 (série d'acquisition 1-2 min) toutes les 30 minutes ont été couronnés de succès, mais ne pouvait être accompli dans un petit nombre de ECs qui avait une expression optimale de EB3 et qui n'a pas afficher défavorable effets à répétition illumination laser 5.

Une approche alternative qui permet des interprétations de la façon dont la dynamique de croissance MT contribuent aux changements dans la morphologie cellulaire et la migration est la région plusTipTracker d'intérêt (ROI) outil 35 (voir le protocole 6.6). Cette méthodologie permet une croissance entière de MT cellulaire pistes pour être sous-divisé en régions définies par l'utilisateur, à partir de laquelle les pistes de croissance MT peuvent ensuite être extraites et analysées. Par exemple, des comparaisons de «ramifié» par rapport à des régions «non-ramifiés" de la cellule ont révélé que MTs croître plus spetits et plus persistant au sein des régions ramifiées par rapport à la périphérie des cellules 5 non ramifié. Dans la plaie de pointe polarisée HUVEC, les comparaisons des principaux bord de fuite et la dynamique de croissance bord de MT a révélé que induit MCAK-MT désassemblage est inhibée spécifiquement dans le bord d'attaque, mais pas le bord de fuite. évaluation régionale de début et de fin dynamique de croissance bord de MT dans HUVEC exprimant Rac1 et / ou mutants de phosphorylation de MCAK a en outre révélé que l'activation Rac1-induite de kinase Aurora-A spécifiquement et localement inhibe l'activité de MCAK dans le bord d'attaque pour conduire HUVEC polarisation et migration directionnelle 31. Ainsi, la combinaison de suivi automatisé de la dynamique de croissance MT et de l'évaluation régionale du MT dynamique de croissance dans les saillies ramifiés et / ou le bord d'attaque de la plaie bord HUVEC nous a permis de relier la dynamique de croissance MT à HUVEC morphologie et de la migration.

Les protocoles décrits sont designed de fournir une méthodologie généralement simple et hautement reproductible pour la culture HUVEC et investigation expérimentale. Néanmoins, la plupart des détails du protocole sont complexes et prennent du temps, ce qui, à son tour, offre la possibilité d'erreurs ou de difficultés dans la conduite de la méthode expérimentale. Bien qu'il ait été tenté de résoudre les problèmes potentiels à travers le protocole, est ici fourni, le dépannage détaillé des problèmes potentiels qui sont moins courants ou autrement abrégé en notes dans les protocoles méthodologiques.

Associées à des lamelles de revêtement avec des substrats de polyacrylamide (protocole de 2,2), un problème commun qui se pose est la complexité de l'activation des lamelles de verre, le couplage de polyacrylamide au verre, en activant le polyacrylamide, puis le couplage ECM à l'polyacrylamide. Une étape particulièrement difficile et potentiellement problématique est la culture de HUVEC sur le gel de fibronectine / polyacrylamide après une exposition de l'polyades lamelles couvre-crylamide revêtu à 2 mM sulfo- SANPAH (étape 2.2.2.6, ci-dessus). Il est critique pour le succès de la mise en culture des cellules HUVEC sur ces substrats sulfo- SANPAH être complètement retiré du système expérimental suivant ECM conjugaison. Ceci peut être mieux accomplie par lavage à l' ddH 2 O et en incubant les lamelles en ddH 2 O sur un agitateur pendant une nuit. Si les cellules cultivées sur les ECM de polyacrylamide ne survivent pas, ou si la viabilité est moins que prévu, a augmenté et a répété le lavage des sulfo-SANPAH après conjugaison à la fibronectine (étape 2.2.2.9) est recommandée pour atténuer potentiellement ce problème.

Associés au protocole 3 (ADNc transfection et culture HUVEC sur une lamelle), une influence majeure au succès de la procédure d'électroporation est la manipulation des HUVEC à la fois pendant la trypsine des cellules pour les retirer de la fiole en plastique, et après la conclusion de l'électroporation (étapes 3.3 à 3.4 ci-dessus). Il est essentiel de prendre soincontrôler complètement le HUVEC tandis que la trypsine, et ne pas dépasser le temps nécessaire pour que les cellules «round-up" à la surface du ballon (généralement 1-2 minutes). temps excessif dans la trypsine est une cause majeure de HUVEC la mort, qui est généralement pas réalisé jusqu'à ce que les cellules sont étalées sur des lamelles revêtues de fibronectine (étape 3.4) et ne parviennent pas à fixer sur le substrat.

D'une importance similaire, HUVEC (et la plupart des types de cellules primaires) ne se portent pas bien lorsqu'ils sont suspendus pendant de longues heures dans le tampon d'électroporation. Au cours d'expériences à grande échelle, par exemple, où l'utilisateur dispose de cinq ou plusieurs conditions qui nécessitent une électroporation, il est préférable de garder les cellules sédimentées dans des tubes individuels (1 tube par transfection) et de les mélanger, un à-un-temps , dans le tampon d'électroporation immédiatement avant électroporation. Cette approche réduit le temps d'incubation dans le tampon d'électroporation et de survie HUVEC maximisée. En outre, le sauvetage immédiat dans les milieux de culture complet est aussi critical électroporation suivant. retards de sauvetage d'une minute ou plus électroporation suivantes peuvent entraîner près de la mort complète HUVEC et doivent donc être évités.

Liés détermination de migration cellulaire (Protocole 9), la technique de culture de cellules HUVEC à une densité extrêmement élevée dépend d'une modification critique (décrit à l'étape 9.2) de la méthode de culture de cellules HUVEC classique (décrite dans le protocole n ° 3) qui nécessite un séchage de la fibronectine enduit lamelle afin de permettre à la culture de HUVEC dans une très petite zone de la lamelle couvre-objet. Souvent, si la lamelle couvre-objet ne soit pas complètement séché, ou si le revêtement préalable de la lamelle couvre-objet avec de la fibronectine (étapes 2.1 ou 2.2) n'a pas été efficace, les cellules contenant un milieu qui est placée sur la lamelle couvre-objet vont perdre sa tension de surface et augmenter la les bords de la lamelle, ce qui réduit la densité des cellules sur la lamelle. Une méthode pour résoudre ce problème potentiel est d'aspirer les médias de la lamelle, puisplacer la lamelle (encore dans son plat de 35 mm) à l'arrière de l'enceinte de sécurité biologique pendant 5-10 min. Cette adaptation peut contribuer à permettre l'écoulement d'air à l'intérieur du coffret pour faciliter le séchage de la vaisselle. Si un liquide visible reste sur la lamelle après séchage à l'air, aspirez les taches liquides et encore laisser sécher pendant 5-10 minutes supplémentaires dans l'armoire de biosécurité. Il est important de noter qu'il n'y a aucun moyen d'éviter complètement ce problème potentiel, mais il ne devient moins d'un problème avec la pratique répétée du protocole. Il est également une recommandation de dépannage lors de la préparation des lamelles pour le dosage de la migration des cellules (ou tout dosage, en général), pour préparer des lamelles supplémentaires et ont HUVEC supplémentaires prêt-à-aller en cas de problèmes le long du chemin.

Avec ces considérations de dépannage à l'esprit, il est également important de mettre en évidence l'utilité des protocoles discutés et leurs implications dans les futures recherches sur la biologie cellulaire. L'applicabilité à l'polyacrapproche ylamide est vaste et comprend non seulement des études en deux dimensions de l' engagement cellule-ECM (décrit ci - dessus), mais aussi des enquêtes en trois dimensions 5. Cette application est essentielle pour accroître notre compréhension de la façon dont HUVEC régulent la forme des cellules et de la migration dans des environnements physiologiques et devrait fournir aux chercheurs une compréhension de base de la façon dont les changements morphologiques sont coordonnés avec les changements du cytosquelette. Bien que les protocoles décrits ici se concentrent sur des mesures de la dynamique de croissance MT, la majorité des protocoles peut et doit être adapté pour mesurer un certain nombre d'autres aspects des interactions microscopiques mesurables cellule-ECM. En ce qui concerne la dynamique MT, il existe de nombreuses cartes, y compris au moins 14 familles de kinésines 89, chacun ayant un rôle potentiel dans la contribution à HUVEC polarité et migration dirigée, et qui peuvent tous être étudiés en utilisant les protocoles présentés.

Les recherches futures devraient uneLSO être ciblées sur l'engagement des cellules ECM dans des conditions normales par rapport à des états pathologiques. protocoles HUVEC présentés ici sont applicables aux enquêtes sur les processus homéostatique vasculaires normales, ainsi que des états pathologiques, y compris les maladies cardiaques, la rétinopathie, la croissance tumorale et les métastases, pour ne citer que quelques-uns. Conjuguer ECM et polyacrylamide substrats visiblement transparents de conformité se prêtent à des études microscopiques permettra des études d'engagement cellulaire ECM tels que l'angiogenèse des cellules endothéliales vasculaires peut être contrôlé avec une résolution spatiale et temporelle. Ces types d'approches expérimentales ont déjà commencé à révéler d' importantes différences dans la forme des cellules endothéliales, la polarité, la migration, et les effets des protéines qui régulent ces processus 5,31,90. Les efforts futurs devraient viser à déterminer comment la combinaison de la conformité ECM et dimensionnalité mechanosensing peut servir à localement des protéines de contrôle qui ciblent et régulent la dynamique du cytosquelette.

Acknowledgments

Un merci spécial à Dr. Clare M. Waterman pour le mentorat et les discussions, Michelle Baird et Mike Davidson pour fournir un grand nombre de constructions d'ADNc fluorescents utilisés dans ces études, et Kathryn Applegate et Gaudenz Danuser pour le développement de logiciels d'analyse plusTipTracker MT. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention à KAM du National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) et le National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

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Biologie cellulaire numéro 114 MCAK Aurora Rac1 microtubules cellules endothéliales l'angiogenèse l'électroporation la microscopie à fluorescence imagerie des cellules vivantes
Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine
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Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

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