Introduction
Las proteínas son las macromoléculas más abundantes en las células, y juegan un papel esencial en casi todos los procesos biológicos. La actividad biológica de la mayoría de las proteínas requiere de su plegado en, y mantener, las estructuras nativas tridimensionales. Las proteínas con conformaciones aberrantes no sólo pierden sus funciones normales, sino que también forman con frecuencia especies oligoméricas solubles o agregados que deterioran las funciones de otras proteínas y que son tóxicos para las células 1,2. Para contrarrestar el mal plegamiento de proteínas, las células emplean ambas chaperonas moleculares, que ayudan polipéptidos no plegados o parcialmente plegadas para alcanzar su conformación nativa, y las vías de degradación, que eliminan las proteínas mal plegadas 3. Dada la complejidad y la naturaleza estocástica del proceso de plegado, el mal plegamiento de proteínas es inevitable, y no se puede invertir en el caso de las mutaciones, errores biosintéticas, y los daños posteriores a la traducción 1. Por lo tanto, en última instancia, las células se basan en degradacvías de iones para mantener su calidad de la proteína.
La importancia del control de calidad de la proteína celular (PQC) sistemas es subrayada por la prevalencia de enfermedades en proteínas misfolding, incluyendo cáncer, diabetes, y muchos trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington (HD), y degeneración espinocerebelosa (SCA) 4,5. Por ejemplo, las mutaciones en el p53 supresor de tumores es la lesión más frecuentemente genética única en tumores, asociado a ~ 50-70% de todos los casos 6. Una fracción sustancial de las mutaciones de p53 son mutaciones de sentido erróneo que alteran la conformación de p53, lo que lleva a la formación de agregados 7. Por otra parte, las proteínas con tramos polyQ expandido están asociados genéticamente y patológicamente con HD y SCA. Estas enfermedades progresivas y, a menudo fatales manifiesto cuando la longitud del tramo polyQ en las proteínas afectadas supera determinados thresmantenga, y se vuelve cada vez más graves como la longitud del tramo polyQ prolonga 8.
Un enfoque atractivo para el tratamiento de estas enfermedades es para reforzar terapéuticamente sistemas celulares PQC, especialmente las vías de degradación. Sin embargo, las vías de señalización implicadas en la degradación de proteínas defectuosas, en particular los de las células de mamíferos, siguen siendo poco conocidos. Aunque se ha reconocido que el proteasoma es críticamente importante para la degradación de las proteínas mal plegadas, una cuestión vital permanece indefinido: cómo las proteínas mal plegadas son reconocidos específicamente y destinada a la degradación. Por otra parte, aunque los sistemas PQC se han identificado en los compartimentos celulares, incluyendo el citoplasma, retículo endoplásmico, y la mitocondria, los sistemas PQC en el núcleo siguen sin estar claros 2.
Estudios recientes realizados por nuestro laboratorio han identificado un sistema que reconoce y se degrada una variedad de proteínas mal plegadas en el núcleode células de mamíferos 9. Este sistema se compone de la proteína promielocítica (PML), una proteína nuclear y un miembro de la familia de proteínas tripartito motivo que contienen (TRIM), y RNF4, un anillo-dominio que contienen proteínas. PML, y varias otras proteínas TRIM, poseen SUMO (pequeño modificador semejante a la ubiquitina) la actividad de ligasa E3, lo que facilita la especificidad y la eficiencia de Sumoylation proteína 10. RNF4 pertenece a un pequeño grupo de ubiquitina ligasas de SUMO-dirigida (Stubl), que contienen uno o más motivos de sumo-interactuando (SIMS), además del anillo de dominio que les brinda la actividad de ubiquitina ligasa 11. Se encontró que la PML reconoce específicamente las proteínas mal plegadas a través de sitios de reconocimiento de sustrato discretos que pueden discernir características distintas de las proteínas mal plegadas. Tras la unión, las etiquetas de PML mal plegadas proteínas con poli-cadenas de SUMO2 / 3, dos proteínas de mamíferos SUMO casi idénticos que pueden formar poli-cadenas debido a la existencia de un sitio de Sumoylation interna. Sproteínas mal plegadas UMOylated son luego reconocidos por RNF4, lo que conduce a su ubiquitinación y degradación proteasomal. Además, demostró que el sistema de PML-RNF4 es importante para la protección contra la neurodegeneración, como la deficiencia en PML exacerba los defectos de comportamiento y neuropatológicas de un modelo de ratón de tipo SCA 1 (SCA1) 9.
Para distinguir la degradación de proteínas de otros mecanismos celulares que pueden regular los niveles de proteína, las tasas de rotación de proteínas se midió 9. Entre los métodos más frecuentemente utilizados para determinar el volumen de negocios de proteínas son la persecución de pulso y persecución cicloheximida (CHX). Estos dos métodos examinan con el tiempo, respectivamente, las proteínas marcados con radioisótopos de interés en las células de traducción-competente y proteínas preexistentes totales de interés en las células de traducción inhibido. Sin embargo, un reto importante para el estudio de proteínas patógenas y misfolding propensos es que la vida media de estas proteínas puede ser extremadamente long. Por ejemplo, Ataxina-1, Ataxina-7, huntingtina, α-sinucleína, y TDP-43 todos tienen vidas medias de más de 12 a 24 h 9,12-16. Las tasas de rotación lenta de estas proteínas no permitan la utilización del análisis CHX persecución porque las células que albergan estas proteínas pueden no sobrevivir inhibición de la traducción prolongado, especialmente debido a que las proteínas mal plegadas a sí mismos pueden ser altamente tóxicos para las células. El análisis de pulso-caza con marcaje isotópico también puede ser un reto para las proteínas que son altamente propensas a la agregación. La mayoría de los ensayos de pulso-caza se basan en la inmunoprecipitación para separar la proteína de interés de todas las otras proteínas que también están etiquetados radioactivamente. Este procedimiento incluye normalmente largos procedimientos de inmunoprecipitación y de lavado, durante los cuales pueden formar agregados insolubles en SDS, haciendo que el análisis con electroforesis en SDS-PAGE incorrecto.
Aquí un protocolo para analizar las proteínas mal plegadas nucleares con una tasa de rotación lenta se describe 9. Una forma patógena de Ataxina-1 (ATXN1) que contiene un tramo de 82 glutaminas (ATXN1 82Q) se utiliza para este fin 8. Cuando se expresa en las células, una proteína fluorescente (GFP) de fusión verde mejorada de formas ATXN1 82Q microscópicamente inclusiones visibles en el núcleo (Figura 1A). El análisis de persecución de impulsos revela que la vida media de Ataxn1 82Q es mayor de 18 h 9. ATXN1 82Q se compone de especies con conformaciones mal plegadas de diferentes características, así como las especies con conformación nativa. Es probable que estas especies se degradan a diferentes velocidades, y por lo tanto debe ser analizado por separado. Los lisados de ATXN1 82Q-GFP-expresando células se fraccionan en NP-40 soluble (soluble o NS, representando probablemente proteínas nativas o proteínas monoméricas / oligomérica mal plegadas) y (NI, agregado / mal plegadas) porciones NP-40 insoluble. Este último puede ser dividida en SDS-soluble (SS; probables agregados desordenados) o SDS-resistente (SR; fibrillas amiloides probablesFracciones) (Figura 1B). fracciones NS y SS pueden ser analizadas por SDS-PAGE seguida de Western Blot, mientras que la fracción SR puede ser detectada por ensayos de retardo en el filtro, seguido de inmunotransferencia. Persecución CHX se combina con el método de fraccionamiento detergente, y descubrió que la vida media de SS ATXN1 82Q es mucho más corta que la de NS ATXN1 82Q y el total de ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando que la fracción de SS puede ser fácilmente reconocido y degradado en las células 9. Por lo tanto, este método proporciona una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de proteínas mal plegadas y comparar su patrón de degradación.
También describimos un método que es adecuado para la selección de alto rendimiento para la identificación de las macromoléculas o compuestos pequeños que pueden modular el degradación de las proteínas mal plegadas. Este método se basa en un mutante conformacionalmente desestabilizado de la luciferasa de luciérnaga (LucDM) 17, un sustrato de modelo de chaperona. Tenemos fusibled LucDM a una señal de localización nuclear (NLS) para investigar los sistemas PQC en este compartimento celular, y GFP (NLS-LucDM-GFP) para la conveniencia de la detección. Formas NLS-LucDM-GFP agregados nucleares microscópicamente visibles en un pequeño porcentaje de células (Figura 3A). Al igual que en ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP, pero no su homólogo de tipo salvaje NLS-LucWT-GFP-es modificado por SUMO2 / 3 y regulada por la vía de PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP también forma SS y SR especies, aunque las cantidades relativas de las especies SS y SR son mínimos en comparación con NS, usando las condiciones descritas en el protocolo 3 a continuación. Para simplificar el ensayo, sólo analizamos SDS LucDM soluble (incluyendo tanto los NS y fracciones SS) por SDS-PAGE y Western blot. Es importante destacar que, el ensayo de persecución CHX mostró que la vida media de SDS-soluble NLS-LucDM-GFP es mucho más corta que la de su homólogo de tipo salvaje (Figura 3B), lo que sugiere que LucDM es un sustrato específico para el sistema que reconoce y se degradaproteínas mal plegadas.
La degradación de LucDM-GFP causa una caída significativa de la señal global de fluorescencia. Por lo tanto, también hemos desarrollado un protocolo para la detección en tiempo real de celular LucDM-GFP usando un ensayo basado en la fluorescencia de microplacas. Muchos sistemas de alto rendimiento pantalla (HTS) son desarrollados por los medicamentos o genes modificadores agregados celulares y la viabilidad celular causado por las proteínas aberrantes 18-20. Sin embargo, muy pocos HTS están diseñados específicamente para la orientación degradación en células de mamífero. Este protocolo sirve como un sistema robusto para el análisis rápido y en gran escala de los efectos de la expresión de proteínas, desmontables, y el tratamiento de drogas en la proteína mal plegada celular degradación. El uso de células HeLa como ejemplo, a continuación se describen los protocolos para el análisis de estas dos proteínas mal plegadas. Los ensayos también se pueden aplicar a otras líneas celulares, aunque pueden necesitar ser optimizado para líneas celulares individuales condiciones de transfección y el curso del tiempo.
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Protocol
1. Preparación de Reactivo
- Preparar tampón de lisis celular (50 mM Tris, pH 8,8, NaCl 100 mM, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Suplemento DTT 2 mM, 1x cóctel completo de la proteasa, y 250 IU / ml benzonasa antes de su uso.
- Preparar el tampón de precipitado (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Suplemento DTT 2 mM, 1x cóctel completo de proteasa y 250 IU / ml benzonasa antes de su uso.
- Preparar tampón de ebullición 3x (6% de SDS, Tris 20 mM, pH 8,0). Suplemento de DTT 150 mM antes de su uso.
- Preparar medio DMEM bajo fluorescencia para ensayos usando lector de fluorescencia de microplacas. Mezclar glucosa 25 mM, glicina 0,4 mM, arginina 0,4 mM, cisteína 0,2 mM, glutamina 4,0 mM, histidina 0,2 mM, isoleucina 0,8 mM, leucina 0,8 mM, lisina 0,8 mM, metionina 0,2 mM, fenilalanina 0,4 mM, serina 0,4 mM, 0,8 treonina mM, triptófano 0,078 mM, 0,4 mM tirosina, valina 0,8 mM, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, KCl 5,33 mM, 44,0 mM NaHCO3, NaCl 110 mM, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Ajustar el pH de la solución usando HCl o NaOH a un pH de 7,4. Esterilizar el medio a través de filtración.
NOTA: Este medio contiene componentes del medio estándar DMEM con alta glucosa excepto en que Fe (NO 3) 3, se omiten las vitaminas y rojo de fenol. Rojo fenol, riboflavina y piridoxal en medio de cultivo DMEM normal interfiera significativamente con la detección de señal de fluorescencia 21. El medio de cultivo sin esos componentes es crucial para el éxito de imágenes en vivo de células GFP. El medio es estable durante 12 meses cuando se almacena refrigerado.
Ensayo 2. La degradación de ATXN1 82Q GFP
- Placa de aproximadamente 3 x 10 5 células HeLa en placas de 35 mm con medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), por lo que después de O / N cultivar células crecen hasta una confluencia del 40-60% en el momento de la transfección.
NOTA: El número de placas necesarias se basa en el número de puntos de tiempo y los tratamientos described continuación. - Transfectar células HeLa con 0,3 g de ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plásmido en cada reactivo de transfección bien el uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante 9. Haga una mezcla de transfección maestra que contiene el reactivo de ADN y transfección y se alícuota de cada pocillo.
- 4-5 horas después de la transfección, examinar las células vivas bajo un microscopio de fluorescencia invertido para la expresión de GFP con onda de excitación 450-490 nm. Volver de nuevo a las células de la incubadora después de la impresión.
NOTA: Se deben observar los dos GFP señales difusas y pequeñas motas de señales de GFP en el núcleo en este momento. - Se elimina el medio por aspiración al vacío y añadir 2 ml de DMEM fresco que contiene 50 mg / ml CHX. Tratar las células durante 0, 4, 8, 12 y 16 h con CHX antes de la cosecha. Para examinar la degradación proteasomal, incluir proteasoma MG132 inhibidor (10 mM) en una placa tratada durante 16 h como control.
- Cosechar una placa de células en cada punto de tiempo. Retire el medio de vacío por una aspiraciónd lavar las placas dos veces con 3 ml de fosfato enfriado con hielo 1x solución salina tamponada (PBS). Snap-congelar la placa en hielo seco.
- Después de que el último punto de tiempo (16 h), raspar las células congeladas (desde todos los puntos de tiempo) en 150 l de tampón de lisis celular enfriada en hielo y se incubaron en hielo durante 30 min.
- Centrifugar los lisados de células en una centrífuga de mesa a 17,000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante, que contiene las proteínas NP-40-solubles (NS), a otro tubo con una pipeta.
NOTA: Utilice sobrenadantes para medir las concentraciones de proteína mediante el ensayo de Bradford, si es necesario. - Enjuagar los gránulos añadiendo suavemente aproximadamente 200 l de 1x PBS a los tubos sin molestar a los pellets. Retirar con cuidado PBS mediante aspiración por vacío o pipeta. ellos Vuelva a suspender en 150 l de tampón de sedimento de células enfriado con hielo, seguido de 15 a 30 min de incubación en hielo.
NOTA: La fracción del sedimento resuspendido contiene NP-40 proteínas insolubles (NI). Véase la Figura 1B para una diagcarnero de fraccionamiento detergente. - Añadir 75 l de tampón de ebullición 3x en fracciones NS 40 y NP-fracciones insolubles (NI) se volvieron a suspender a partir de los gránulos. Calentar las muestras a 95 ° C en un bloque de calor durante 5 minutos.
NOTA: Los montones en los NP-40 fracciones insolubles se disuelven después del calentamiento y las muestras se pondrán de manifiesto. - Añadir tampón de carga SDS-gel a una alícuota de NS hervidas y NI. Cargar un volumen igual de muestras recogidas de todos los puntos de tiempo a gel de SDS-PAGE. Los corresponde volumen cargado a aproximadamente 20 g de NS de muestra recogida en el tiempo 0. NOTA: NS, así como proteínas SDS solubles (SS) de NI facción, pueden ser resueltas por SDS gel de separación. Por el contrario, SDS-resistente (SR) agregados a partir de la fracción de NI están atrapados en los pozos de carga de gel (Figura 1B). Para mejorar la detección de transferencia Western, volumen doble de NI se puede cargar.
- Detectar NS y SS ATXN1 82Q-GFP mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-GFP y un aumento de quimioluminiscencia (ECL).
NOTA: ATXN1 82Q en la fracción de SS es generalmente menor en comparación con la fracción NS utilizando este protocolo. Es necesario un mayor exposición ECL para las señales óptimas. - Examinar SR ATXN1 82Q de la fracción de sedimento por ensayos de retardo en filtro utilizando un aparato de dot-blot (Figura 1B). En pocas palabras, establecer un aparato de transferencia de puntos que sostiene una membrana de acetato de celulosa de 0,2 micras. De carga 80 a 120 l de NI hervida en cada pocillo del aparato dot-blot.
NOTA: Como sólo pequeñas cantidades de agregados SR se forman en las células, para el ensayo de transferencia de puntos, cargar un volumen de la fracción SR que es de aproximadamente 10 a 15 veces del volumen de la fracción NS utilizado para el análisis de transferencia Western.- Después de filtrar las muestras a través de la membrana por vacío, los agregados ATXN1 82Q-GFP pegados en la membrana se pueden detectar por inmunotransferencia anti-GFP 9,12,22.
NOTA: Véanse los informes anteriores 9,12,22 para una descripción detallada del ensayo de retardo en el filtro. Este paso es opcionalporque SR ATXN1 82Q es mínimo en comparación con las fracciones de las SS y NS siguientes corto transfección se describe en este protocolo. Además, los niveles de SR ATXN1 82Q permanecen en gran parte la misma sobre CHX Chase (Figura 2B). Sin embargo, todavía es crucial para examinar si las cantidades de SS ATXN1 82Q se ven afectados con el tiempo para cualquier tratamiento de drogas o la expresión génica en los experimentos iniciales. SS especies de proteínas permanecen en pozos de carga de gel SDS-PAGE puede ser detectado por Western blot. Sin embargo, este método es menos sensible y genera resultados variables más (Figura 1B).
- Después de filtrar las muestras a través de la membrana por vacío, los agregados ATXN1 82Q-GFP pegados en la membrana se pueden detectar por inmunotransferencia anti-GFP 9,12,22.
3. Ensayo de Degradación de NLS-luciferasa-GFP usando SDS-PAGE y Western Blot
- Placa de aproximadamente 3 x 10 5 células HeLa en placas de 35 mm con medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Después de O / N de cultivo, una confluencia de 40-60% se alcanza en el momento de la transfección. El número de placas necesarias se basa en el número de time puntos y tratamientos descritos a continuación.
- Transfectar células HeLa con 1,0 g NLS-luciferasa-GFP / pRK5 plásmido en cada reactivo de transfección bien el uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante 9. Haga una mezcla maestra que contiene la transfección de ADN y reactivo de transfección para la alícuota de cada pocillo.
- Después de O / N transfección (alrededor de 15 horas), examinar las células vivas bajo un microscopio de fluorescencia invertido para la expresión de GFP con onda de excitación 450-490 nm. Volver de nuevo a las células de la incubadora después de la impresión.
NOTA: difusa señal GFP nuclear puede ser observado en la mayoría de las células (70%). Un pequeño porcentaje (5%) de las células tienen agregados nucleares. - Se elimina el medio por aspiración al vacío y añadir 2 ml de DMEM fresco que contiene 50 mg / ml CHX. Tratar las células durante 0, 1,5, 3, 4,5 y 6 horas con CHX antes de la cosecha. Para examinar la degradación proteasomal, incluir inhibidor del proteasoma MG132 adicional (10 mM) en una placa tratada durante 6 horas como control.
- Cosechar una placa de células en cada punto de tiempo. Eliminar el medio por aspiración al vacío y se lavan las placas dos veces con 3 ml de fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS). Snap-congelar la placa en hielo seco.
- Después del último punto de tiempo (6 horas) está terminado, las células se congelaron a todos los tiempos puntos se raspó en 150 l de tampón de lisis celular helada y se incubaron en hielo durante 30 min.
- Añadir tampón de carga de gel SDS de lisados de células enteras para una concentración final de 2% de SDS y DTT 50 mM. Incubar las muestras en un bloque de calor a 95 ° C durante 5 min.
- Analizar NLS-luciferasa-GFP por SDS-PAGE y transferencia de Western usando el anticuerpo anti-GFP. Cargar un volumen igual de muestras recogidas de todos los puntos de tiempo a gel de SDS-PAGE. El volumen de carga corresponde a aproximadamente 20 g de lisados de células enteras de muestra recogida en el tiempo 0.
Ensayo de Degradación 4. En tiempo real de NLS-luciferasa-GFP usando fluorescencia lector de microplacas
- Seed aproximadamente 1 x 10 4células HeLa en placas de cultivo tisular de 96 pocillos de color negro con fondo transparente. Después de O / N de cultivo, una confluencia de 50-70% se alcanza en el momento de la transfección.
NOTA: 60 l de medio que contiene células HeLa completamente en suspensión se sembraron directamente en cada pocillo. No agregue placa de medio roca o de ida y vuelta adicional después de la siembra, de lo contrario las células pueden ser distribuidos de manera desigual. - Transfectar células HeLa con 0,05 hasta 0,1 g de NLS-luciferasa-GFP / pRK5 plásmido 9 en cada reactivo de transfección bien el uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Haga una mezcla de transfección maestra que contiene el reactivo de ADN y transfección y se alícuota de cada pocillo. Tres pocillos con células no son transfectadas con el ADN, que sirve como control para la señal de fondo de fluorescencia para cada condición de tratamiento.
NOTA: Una forma alternativa para reducir la variación de la transfección es para transfectar células antes de la siembra. Sin embargo, una gran parte de las células transfectadas con la proteína mal plegadas fallan para unir o mostrar la viabilidad reducida usando este método. Es probable que algunas células pueden no soportar el estrés causado por la digestión con tripsina al expresar proteínas mal plegadas tóxicos. Como resultado, la señal fluorescente global se reduce significativamente. - 20-24 horas después de la transfección, examinar las células vivas bajo un microscopio de fluorescencia invertido para la expresión de GFP con onda de excitación 450-490 nm.
- Se elimina el medio por aspiración al vacío. Añadir aproximadamente 200 l 1x PBS a cada pocillo y a continuación, aspirar para eliminar cantidad residual de medio DMEM.
- Añadir 60 l de baja fluorescencia medio DMEM con FBS al 5% y 50 mg / ml CHX. Para examinar la degradación proteasomal, incluir inhibidor del proteasoma MG132 adicional (10 mM) en un conjunto de muestras. Conjunto de pozos por triplicado para cada tratamiento / estado.
NOTA: El tratamiento MG132 se incluye como controles para la degradación proteasomal porque es crucial para descartar otros factores que pueden causar gota de fluoseñal cencia, incluyendo la muerte celular y la extinción de la fluorescencia. - Medir la señal de fluorescencia de GFP inmediatamente en un lector de placas fluorescentes después de añadir CHX.
NOTA: Los ajustes de medición de software se muestran en la Tabla 1. - Leer la placa a cada hora durante un máximo de 8-10 horas. Después de leer, volver de nuevo a la placa de cultivo celular incubadora.
- Exportar los datos como un archivo de hoja de cálculo. Utilice valor medio de múltiples lecturas para cada uno, así como la intensidad de fluorescencia. Normalizar los valores de cada punto de datos para los valores medios de tiempo 0 en los grupos respectivos. Trazar la intensidad de fluorescencia normalizada en el tiempo como se muestra en la figura 4A y 4B, y la Figura 5, paneles de la derecha.
- Realizar el análisis estadístico de las tasas de degradación entre dos condiciones usando ANOVA de dos vías con medidas repetidas 23.
NOTA: En este análisis, "la intensidad de fluorescencia" es la variable dependiente, mientras que "tratamcondiciones ENT "y" tiempo "son los dos factores. En lugar de comparar los datos en los puntos de tiempo individuales, de dos vías ANOVA con medidas repetidas análisis de la diferencia entre los dos grupos de tratamiento durante todo el curso del tiempo.
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Representative Results
En un análisis de estado estable, microscópicamente visibles agregados nucleares ATXN1 82Q-GFP se puede observar en 30 - 50% de las células HeLa 20 horas después de la transfección (Figura 1A). El análisis de transferencia Western de NS y SS fracciones usando anticuerpo anti-GFP muestra una banda distinta de ATXN1 82Q-GFP entre 100 kDa y 150 kDa marcadores, correspondiente al peso molecular de la proteína (Figura 1B). ATXN1 82Q-GFP en la fracción SR se puede detectar ya sea por ensayo de retardo en filtro o por SDS-PAGE y Western blot como especies en la parte superior del gel de apilamiento (Figura 1B). Para el análisis de la vida media usando el protocolo descrito anteriormente, CHX chase comienza 4-5 horas después de la transfección inicial antes de que se forman los grandes agregados nucleares. La vida media de ATXN1 82Q-GFP en la fracción de SS es de alrededor de 5 horas, en contraste con una ligera o ninguna disminución de ATXN1 82Q-GFP en la fracción NS sobre 16 hr (Figura 2 A). la degradación de ATXN1 82Q-GFP se inhibe parcialmente por el tratamiento de las células con MG132 (Figura 2A). Anteriormente puso de manifiesto que la PML estimula la degradación de la proteína mal plegada, promoviendo su Sumoylation. Aquí utilizamos PML desmontables como un ejemplo de ruta de degradación alterado. PML siRNA tratamiento prolongó la vida media de ATXN1 82Q-GFP en la fracción de SS (Figura 2A). No hay cambios evidentes en SR ATXN1 82Q-GFP se detectan, ya sea en las células tratadas con siRNA PML (Figura 2B y 2C) o de control.
Veinte horas después de la transfección, los agregados NLS-LucDM-GFP se convierten microscópicamente visible en 5-15% de las células HeLa, pero esto puede variar dependiendo de las cantidades de ADN que son transfectadas (Figura 3A). La vida media de SDS soluble NLS-LucDM-GFP es 2-3 hr (Figura 3B y 3C). La intensidad de fluorescencia de las células transfectadas también disminuye con eltiempo tras el tratamiento CHX (Figura 4A y 4B). Seis horas después del tratamiento CHX, la intensidad de fluorescencia alcanza una etapa estable y deja de disminuir (Figura 4A y 4B). En el mismo punto de tiempo, soluble NLS-LucDM-GFP es en gran parte degradada (Figura 3B y 3C), lo que sugiere que la fluorescencia restante se genera a partir de especies de agregados resistentes a la degradación. Consistentemente, agregados, pero no difusa, GFP permanece en las células 9 horas después del tratamiento CHX (Figura 4C). Curiosamente, la transfección utilizando una mayor cantidad de NLS-LucDM-GFP plásmido genera más agregados nucleares, así como una mayor intensidad de fluorescencia restante, aunque la tasa de degradación no se ve afectada (Figura 4A y 4B). El uso de cualquiera de SDS-PAGE seguida de Western Blot o la lectura de fluorescencia, que son capaces de detectar la inhibición de la degradación de NLS-LucDM-GFP mediante tratamiento o MG132 PML siRNA (Figuras 3C, 4A, 4B y 5).
Figura 1. Detección de ATXN1 82Q-GFP mediante microscopía fluorescente y fraccionamiento detergente. (A) Las células HeLa fueron transfectadas con ATXN1 82Q-GFP y se tiñeron con DAPI. Se muestran las imágenes individuales y combinadas. Barra de escala = 10 micras. (B) Un diagrama que muestra el fraccionamiento con detergente de las células que expresan Atxn1-82Q como se describe en el protocolo 2. Los marcadores de peso molecular se indican a la izquierda de las imágenes de Western blot de ATXN1-ATXn 82Q. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
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. Figura 2. Ensayo de Degradación de ATXN1 82Q-GFP usando fraccionamiento detergente células HeLa fueron tratados previamente con el control (-) o PML siRNA (A y C) o-un tratado (B). Las células fueron transfectadas con ATXN1 82Q-GFP y tratados con CHX, en ausencia o presencia de MG132. Fracciones de lisados celulares se analizaron por SDS-PAGE seguida de Western blot (A, para las fracciones NS y SS) o ensayo de retardo del filtro (B y C, para la fracción SR) usando el anticuerpo anti-GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de la degradación de NLS-LucDM-GFP mediante fluorescencia micrLas células HeLa (A) oscopy y Western blot. transfectadas con NLS-LucDM-GFP se tiñeron con DAPI. Se muestran las imágenes individuales y combinadas. Barra de escala = 25 micras. Punta de flecha indica una celda con los agregados nucleares. Las células (B y C) HeLa fueron transfectadas con NLS-LucDM-GFP y la proteína de fusión de luciferasa de tipo silvestre NLS-LucWT-GFP (B), o transfectadas con control o PML siRNA, seguido por la transfección con NLS-LucDM-GFP ( C). Las células se trataron con CHX y MG132 como se indica. Lisados de células enteras fueron analizados por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-GFP. La imagen se modificó a partir de la publicación anterior con el permiso 9. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. ensayo basado en una microplaca fluorescente de la degradación de NLS-LucDM-GFP. Células HeLa se sembraron en placas de 96 pocillos se transfectaron con 0,05 g (A) o 0,1 g (B y C) NLS-LucDM-GFP y se trató con CHX en el presencia o ausencia de MG132. (A y B) intensidades de fluorescencia de los pocillos se midieron a los puntos de tiempo indicados (valores medios ± desviación estándar, n = 3). Los paneles de la izquierda muestran la lectura de fluorescencia original, mientras que los paneles de la derecha muestran los valores normalizados para lecturas en el tiempo 0 en los respectivos grupos de tratamiento. La diferencia entre los grupos tratados con y sin MG132 se analizó mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas. Los valores de P entre los dos grupos de tratamiento se indican. (C) Los pocillos se examinaron antes o después del tratamiento CHX 9 hr, o después del tratamiento CHX y MG132, por microscopio de fluorescencia. Para mostrar mejor las dos células con brillantes agregada NLC-LucDM-GFP y los que tienen la proteína difusa tenue, el valor gamma de 1,5 se aplicó a todas las imágenes. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Una velocidad de degradación de NLS-LucDM-GFP reduce en las células de PML desmontables. Células HeLa previamente tratados con control o PML siRNA se sembraron en placas de 96 pocillos. Se analizó la degradación de NLS-LucDM-GFP como se describe en la Figura 4 (ANOVA de dos vías; p <0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. La fluorescencia de ATXN1 82Q-GFP permanece sin cambios durante la persecución CHX. Células HeLa fueron transfectadas con ATXN1 82Q-GFP. 24 horas después de la transfección, la degradación de ATXN1 82Q-GFP se analizó como se describe en la Figura 4. La figura muestra la lectura de fluorescencia originales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. ensayo basado en una microplaca fluorescente para la degradación de las células citoplásmicas LucDM-GFP. HeLa sembradas en placas de 96 pocillos se transfectaron con 0,1 g LucDM-GFP tratados con CHX, en presencia o ausencia de MG132. Los resultados se analizaron como se describe en la Figura 4 (ANOVA de dos vías; p <0,0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1 .: Configuración de mediciones en un lector de microplacas de fluorescencia.
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Los mecanismos que regulan la degradación de las proteínas mal plegadas son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis de las proteínas celulares, y probablemente representan objetivos farmacológicos valiosos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y otras enfermedades en proteínas misfolding. Aquí, se describen ensayos que examinan la degradación de las proteínas mal plegadas, utilizando una proteína patógena ATXN1 (ATXN1 82Q) y un mutante nuclear localizada luciferasa (NLS-LucDM) como ejemplos.
Para examinar la degradación ATXN1 82Q, que tiene una vida media de más de 18 horas, se introdujo un nuevo método mediante la combinación de fraccionamiento celular con CHX clásica 9. Este método reveló un aclaramiento más rápido de las especies mal plegadas de ATXN1 82Q lo largo del tiempo. Además, la introducción de LucDM proporciona un sustrato mal plegadas modelo para estudiar los mecanismos de degradación generales de proteínas mal plegadas. Para hacer frente a la necesidad de un sistema HTS para la detección de la degradación de proteínas mal plegadas en células de mamífeross, hemos desarrollado un ensayo de degradación rápida para LucDM usando un lector de microplacas de fluorescencia. El sistema sirve como una herramienta poderosa para pantallas químicos y genéticos.
La proteína ATXN1 82Q está presente en NS, SS, y las fracciones de SR de lisados celulares. Las fracciones SR se vuelven cada vez más frecuente durante el cultivo prolongado después de la transfección, lo que sugiere que está en una forma que es difícil de ser respetado o degradado, por ejemplo, las fibrillas de amiloide. Generación de especies mal plegadas tóxicos o agregados que no pueden ser fácilmente degradados puede bloquear las vías de degradación de proteínas, lo que impide el análisis de la maquinaria celular endógeno control de proteínas aberrantes 24, 25,26. Para evitar la formación de una gran cantidad de SR, comenzamos CHX persecución de 4-5 horas después de la transfección inicial. Hemos encontrado que esto es crítico para el análisis de condiciones celulares que pueden retrasar la degradación de la fracción de SS. Además del tiempo de transfección, también es crucial no a más deWhelm células expresando la proteína ATXN1 82Q en niveles muy altos. Si no se observa o muy lenta degradación de todas las fracciones, menos cantidad de ATXN1 82Q plásmido se debe utilizar para la transfección. Idealmente, el ensayo debe acabar en el plazo de 12 horas como células apoptóticas se notan más allá de este punto en el tiempo. En la Figura 2A, la cantidad de SS ATXN1 82 en las células control es notablemente diferente de la de las células tratadas con siRNA PML tan cortos como de 8 horas. Precaución necesita ser tomada si la diferencia en el grupo tratado sólo se observa más allá de 12 horas, ya que puede ser causada por otros factores que afectan a la viabilidad celular en lugar de la degradación de proteínas.
En comparación con NS ATXN1 82Q, 82Q ATXN1 en la fracción de SS se elimina rápidamente, lo que indica que representa una especie de mal plegadas que pueden ser fácilmente degradadas por el proteasoma (Figura 2A). En contraste, los niveles de SR ATXN1 82Q permanecen sin cambios durante el mismo transcurso de tiempo (Figura 2B), lo que confirmaque es una especie no-degradables. Sin embargo, el análisis de la fracción SR debe ser importante para el análisis de los mecanismos que elimina directamente agregados citoplasmáticos (por ejemplo, la autofagia) o afectar a la formación de estos agregados. Notablemente, MG132 parece ser menos eficaz en la prevención ATXN1 82Q disminución de la fracción de SS. Esto puede ser causado por la elevación en los niveles de ROS sobre la inhibición del proteasoma 27, lo que podría promover la agregación de ATXN1 82Q.
Una gran ventaja de ensayo LucDM-GFP es que se puede adaptar a análisis HTS utilizando un lector de placas de fluorescencia. Inicialmente se intentó desarrollar un sistema HTS para ATXN1 82Q. Sin embargo, debido a que sólo una pequeña fracción de proteína total ATXN1 82Q se degrada con el tiempo, la fluorescencia de las células que expresan GFP-ATXN1 82Q permanece en gran medida sin cambios a lo largo de persecución CHX (Figura 6). Otras proteínas mal plegadas con larga vida media global tendrían problemas similares con fluor en tiempo realescent ensayo. Por el contrario, se observa una marcada disminución de la proteína total NLS-lucDM-GFP (figuras 3 y 4). Esta característica, junto con su corta vida media (2-3 h), permite a este sustrato chaperona modelo que se detecta fácilmente por espectroscopia de fluorescencia. En estudios previos, la proteína de CPT, GFP fusionada a una degradación de la señal constructiva (CL-1), se ha empleado ampliamente como reportero para la funcionalidad del sistema ubiquitina-proteasoma 28,29. También es una proteína mal plegada sustituto prominente en modelos celulares y animales 30. En comparación con CPT, una de las ventajas del ensayo de degradación descrito aquí es que la luciferasa mal plegada es un sustrato modelo chaperona utilizado ampliamente. Mediante el examen de la actividad de luciferasa, se puede evaluar fácilmente las conformaciones nativas, desnaturalizados, y replegadas de luciferasa in vitro e in vivo. Por lo tanto, nuestro sistema sirve como una plataforma de gran utilidad para conectar de unión de proteínas y ensayos de plegado consistema de degradación celular utilizando el mismo sustrato 9.
A través de la medición en tiempo real de fluorescencia los siguientes valores se pueden obtener: La intensidad de fluorescencia de partida, la intensidad de fluorescencia restante estable, y proteínas de vida media. Estos valores están correlacionados respectivamente con la cantidad de proteína total antes de persecución, la cantidad de proteínas resistentes a la degradación, y la tasa de recambio de proteínas. Por lo tanto, es posible utilizar ensayo de fluorescencia en tiempo real para hacer un análisis exhaustivo de los niveles y la dinámica de las diferentes especies de proteínas mal plegadas. De vez en cuando, se observa una variación relativamente grande de la fluorescencia a partir de entre repeticiones (por ejemplo, la Figura 5, panel izquierdo). Esto es probable que sea causada por la variabilidad en la siembra de células o transfección. Sin embargo, a pesar de la diferencia en la intensidad de fluorescencia de partida, la señal de todas las repeticiones gotas a un ritmo muy similar. La normalización de las señales de aquí para allám cada vez que apunta a la intensidad en el tiempo 0 pueden reducir la variación del pozo a pozo y refleja con mayor precisión las velocidades de degradación (Figura 4A, 4B y la figura 5, a la izquierda frente a la derecha paneles).
Además de la forma nuclear, también se analizó citoplasmática LucDM-GFP. Citoplasmática LucDM-GFP tiene un patrón de degradación similar, excepto se observó mayor porcentaje de fluorescencia restante cuando se aplicó el mismo procedimiento experimental tal como se describe en el Protocolo 4 (Figura 7). La degradación se pudo inhibir completamente MG132, lo que indica este ensayo se puede utilizar para monitorear el control de calidad de la proteína citoplasmática a través de la degradación proteasomal. Para los estudios futuros, sería interesante explorar si LucDM-GFP se puede aplicar a otros compartimentos celulares, por ejemplo, mitocondrias o retículo endoplasmático, cuando se fusiona a las señales específicas de localización de compartimiento celular.
Como se ha señalado en el protocolo de ensayo basado en fluorescencia, es fundamental utilizar medio-bajo-fluorescente para reducir el fondo fluorescente y utilizar maestro de la mezcla de reactivo de transfección de ADN y transfección para reducir la variación del pozo a pozo. El control de ganancia se puede ajustar en algunos lectores de placas fluorescentes. Es importante establecer la ganancia a manual en lugar de optimizado y utilizar el mismo valor a través de todo el ensayo (Tabla 1). El valor de la ganancia se puede ajustar para maximizar la lectura de la fluorescencia de GFP celular siempre que la lectura no va más allá del límite de detección.
En la etapa actual, seguimos confiando en la transfección para expresar LucDM. Para reducir la variación y simplificar el ensayo para HTS, una meta futura es establecer una línea celular estable con expresión inducible de LucDM. Sin embargo, como microplaca y medio de cultivo que ambos tienen fluorescencia de fondo, que es fundamental contar con GFP señal significativamente más alto que el fondo. Unfordamente, las líneas estables que establecimos recientemente todos tienen baja expresión de LucDM. Por lo tanto, el desarrollo de una línea estable con una mayor expresión de la proteína mejorará significativamente la eficiencia de cribado.
Los ensayos de degradación descritos aquí también se pueden aplicar a otras proteínas mal plegadas. Debido a la característica dinámica de proteínas mal plegadas, estos ensayos deben complementarse con otros análisis para descubrir los mecanismos a fondo de los controles de calidad de proteína. Estos análisis incluyen la medición de los niveles de estado estacionario de los agregados y sus particiones en diferentes fracciones de células (Figura 1) y el análisis de proteínas plegables o agregación utilizando proteínas recombinantes purificadas. Estos ensayos ayudarán a distinguir los efectos directos o indirectos de la expresión fármaco o gen en la degradación de proteínas o agregación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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