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Genetics

कॉर्नियल उपकला घाव भरने के दौरान गर्मी झटका प्रोटीन 27 के समारोह के शाही सेना के हस्तक्षेप के आधार पर जांच

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (सीईसी) लगातार आंसू फिल्म में बहा रहे हैं, जबकि वे एक साथ किनारी और corneal उपकला बेसल परतों से कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं। 1 विभिन्न बाह्य तनाव apoptosis और सीईसी की विशल्कन पैदा कर सकते हैं। 2 गर्मी झटका प्रोटीन (HSPs) अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं और आणविक आकार के अनुसार दो परिवारों में बांटा जा सकता है। 3 सबसे बड़ा HSP परिवार HSP90, HSP70, और HSP60, और छोटे परिवार HSP27 भी शामिल है। 4 HSP27 के फोस्फोराइलेशन सेल अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और actin remodeling में इस प्रोटीन की भूमिका की वजह से सेल प्रवास के लिए आवश्यक है। 5-7 इसलिए, हम उपकला घाव भरने की इन विट्रो मॉडल में मुख्य चुनाव आयुक्त प्रवास और apoptosis में HSP27 फोस्फोराइलेशन की संभावित भूमिका का परीक्षण करने का प्रयास किया।

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) या तो छोटे या कम दखल RNAs का उपयोग कर (siRNA) जीई हैदोनों बुनियादी और अनुप्रयुक्त जीव विज्ञान में nerated ब्याज, के रूप में यह संभवतः अनुमति देता हित के किसी भी जीन की अभिव्यक्ति खटखटाया नीचे जा सकता है। 8 के साथ साथ, हम सीईसी घाव भरने और apoptosis के लिए HSP27 के योगदान का आकलन करने के HSP27-विशिष्ट siRNA इस्तेमाल किया। कोशिकाओं में जीन तोड़े नीचे के लिए पारंपरिक तरीकों आरएनएआई दो असंशोधित 21-मेर ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स कि siRNAs बनाने के लिए इकट्ठा किया जा सकता सहित सिंथेटिक आरएनए duplexes, का उपयोग करें। आरएनएआई siRNA है कि हम इस वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल कोशिकाओं transfect करने के लिए एक सरल और अत्यधिक कारगर तरीका है, और इस अभिकर्मक विभिन्न अमर सेल लाइनों के साथ काम करता है। इस वर्तमान अध्ययन में, हम एक खरोंच प्रेरित दिशात्मक घाव परख, पश्चिमी सोख्ता, siRNA अभिकर्मक परख, immunofluorescence परख सहित इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, प्रदर्शन, और प्रवाह cytometry।

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Protocol

1. सेल लाइन

  1. संस्कृति 10 6 टेलोमिरेज-अमर मानव कॉर्निया उपकला कोशिकाओं (HCECs) 6 अच्छी तरह से थाली में (घनत्व: 1039.9 सेल / 2 मिमी) एक 5% सीओ 2 ब्रोन्कियल उपकला मध्यम विकास (BEGM) का उपयोग कर वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जब तक वे 95% संगम तक पहुँचने।

2. वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण उपकला स्क्रैच घाव बनाने के बाद

  1. मिला हुआ सुसंस्कृत HCECs की एक अच्छी तरह से सतह भर स्ट्रीक एक बाँझ 200 μl विंदुक टिप एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पकवान प्रति चार बार (द्वितीय श्रेणी, टाइप ए 2) और एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अलग से HCECs सेते 1, 5, 10, 30, 60, और 120 मिनट के लिए।
  2. कार्निया उपकला लोग घायल हो गए के बाद ऊष्मायन समय के अनुसार छह अलग नमूने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग करें।
  3. घायल HCEC monolayers 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 2.0 मिलीलीटर BEGM जोड़ें।
  4. 2 का उपयोग कर HCECs को अलग करेंमिलीलीटर 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति एसिड (EDTA), एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिनट के लिए 900 XG पर अपकेंद्रित्र, और महाप्राण trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग।
  5. पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर के साथ HCECs को निरस्त करने और उन्हें एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
  6. 15 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र HCECs और महाप्राण 1x पीबीएस 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग।
  7. 100 μl ठंडा lysis बफर में Resuspend HCECs (10 मिमी Tris, 10 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 25 मिमी NAF, 2 मिमी ना 3 वीओ 4, 1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड [PMSF], प्रोटीज अवरोधकों [1 माइक्रोन एक pepstatin, 1 माइक्रोन leupeptin, और 0.1 माइक्रोन के aprotinin] और 0.5% ट्राइटन X-100 [7 पीएच]) और उन्हें अच्छी तरह से मिला लें।
  8. सेल प्रेरित करने के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. 15 मिनट के लिए 10,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र lysates, और फिर नए सिरे से 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (90 μl aliquots) को supernatants हस्तांतरण और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  10. ब्रैडफोर्ड पीआर का उपयोग सेल lysates की कुल प्रोटीन सांद्रता निर्धारितotein परख। 9
  11. लोड 30 माइक्रोग्राम प्रति सोडियम dodecyl सल्फेट जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ), और फिर के लिए एक 10% या 12% acrylamide जेल में कुल सेल प्रोटीन electrophoretically हस्तांतरण प्रोटीन बैंड nitrocellulose फिल्टर करने के लिए एक 200 मा वर्तमान के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री पर अलग सी पश्चिमी धब्बा assays में उपयोग करें।
  12. 5% के साथ ब्लॉक nitrocellulose फिल्टर झिल्ली, 1 घंटे के लिए बीच 20 (TBST) के साथ Tris बफर खारा में स्किम्ड दूध गैर phosphorylated HSP27 के खिलाफ प्राथमिक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ने (1: 1,000 कमजोर पड़ने) या फॉस्फोरिलेटेड HSP27 के खिलाफ प्राथमिक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1 : 1,000 5% गोजातीय सीरम albumin में कमजोर पड़ने) (बीएसए), और एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली सेते हैं।
  13. TBST के साथ 10 मिनट के लिए धोने के बाद 5% BSA में 3 गुना: (10,000 कमजोर पड़ने 1) immunoreactive बैंड हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग का पता लगाने।
  14. पश्चिमी सोख्ता luminol अभिकर्मकों में झिल्ली सेते (6-7 मीटरकमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए × 5 सेमी झिल्ली 10 सेमी) के अनुसार एल।
  15. अभिकर्मक समाधान से झिल्ली निकालें, एक प्लास्टिक शीट रक्षक में एक शोषक तौलिया के साथ अतिरिक्त तरल, और जगह को हटा दें।
  16. एक सुरक्षित प्रकाश के साथ एक अंधेरे कमरे में कार्य करना, प्रोटीन पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक फिल्म कैसेट में कवर झिल्ली जगह है।
  17. झिल्ली के शीर्ष पर एक्स-रे फिल्म की जगह और 1 मिनट के लिए बेनकाब।

3. siRNA अभिकर्मक परख 10

  1. 5 × 10 5 कोशिकाओं में संस्कृति HCECs / में अच्छी तरह से एक 5% सीओ 2 BEGM का उपयोग कर जब तक वे 95% संगम तक पहुंचने के वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली।
  2. अभिकर्मक (कमजोर पड़ने कारक 41 या 14.3 था) के लिए 100 μl कम हो सीरम माध्यम के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक (2.5 या 7.5 μl) पतला और भंग HSP27 विशेष और कम सीरम माध्यम के 10 या 50 एनएम बनाने के लिए 100 μl में नियंत्रण siRNA तले HSP27 विशेष और नियंत्रण siRNA तले।
  3. 100 μ मिक्स; 100 μl पतला अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ एल siRNA समाधान (1: 1 के अनुपात) और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  4. कोशिकाओं को siRNA लिपिड परिसरों जोड़ें। फिर 4 घंटा परिवर्तन के बाद मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए BEGM को पूरा करने और कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. पश्चिमी सोख्ता द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का विश्लेषण वर्गों 4.1 से 4.7 के लिए वर्णित है।

SiRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 11 के लिए 4. वेस्टर्न ब्लाट परख

  1. HSP27 विशेष निकालें और 100 μl ठंडा lysis बफर (10 मिमी Tris, 10 मिमी NaCl, 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 25 मिमी NAF, 2 मिमी ना 3 VO का उपयोग कर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs तले 4, 1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF), प्रोटीज निरोधक, और 0.5% ट्राइटन X-100, पीएच 7)।
  2. सेल प्रेरित करने के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. 15 मिनट के लिए और फिर नए सिरे से 1.5 मिलीलीटर टब को supernatants स्थानांतरण 10,000 XG पर गोली lysateses (90 μl aliquots) और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  4. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग सेल lysates के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं। 9
  5. एक 10% या 12% एक्रिलामाइड जेल पर कुल सेल प्रोटीन के बराबर मात्रा के साथ लोड नमूने, एसडीएस पृष्ठ को जेल विषय, और electrophoretically nitrocellulose फिल्टर करने के लिए अलग प्रोटीन बैंड करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक 200 मा वर्तमान के साथ हस्तांतरण पश्चिमी धब्बा assays में उपयोग करें।
  6. ब्लॉक 5% के साथ nitrocellulose फिल्टर झिल्ली 1 घंटे के लिए बीच 20 (TBST) के साथ Tris बफर खारा में स्किम्ड दूध फॉस्फोरिलेटेड और गैर-फॉस्फोरिलेटेड HSP27 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने के लिए,: (1,000 कमजोर पड़ने 1) (1 1,000 कमजोर पड़ने), फॉस्फोरिलेटेड Akt गैर फॉस्फोरिलेटेड AKT (1: 1,000 कमजोर पड़ने, एक सेल अस्तित्व मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है), बीसीएल -2 जुड़े एक्स प्रोटीन (1: 1,000 कमजोर पड़ने, एक समर्थक apoptotic प्रोटीन के रूप में प्रयोग किया जाता है), और glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH, 1 : 200 कमजोर पड़ने, एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता) 5% गोजातीय सीरम albumin में (बीएसए), औरएक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली सेते हैं।
  7. धोने के बाद 5% BSA में, 10 मिनट प्रत्येक धोने TBST के साथ 3 बार: (10,000 कमजोर पड़ने 1) immunoreactive बैंड हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग का पता लगाने।
  8. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पश्चिमी सोख्ता luminol अभिकर्मकों में झिल्ली (6-7 मिलीलीटर प्रति 10 सेमी × 5 सेमी झिल्ली) सेते हैं।
  9. अभिकर्मक समाधान से झिल्ली निकालें, एक प्लास्टिक शीट रक्षक में एक शोषक तौलिया के साथ अतिरिक्त तरल, और जगह को हटा दें।
  10. एक सुरक्षित प्रकाश के साथ एक अंधेरे कमरे में कार्य करना, प्रोटीन पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक फिल्म कैसेट में कवर झिल्ली जगह है।
  11. झिल्ली के शीर्ष पर एक्स-रे फिल्म की जगह और 1 मिनट के लिए बेनकाब।

5. स्क्रैच प्रेरित सेल प्रवासन 12 के दिशात्मक लोग घायल हो गए परख मूल्यांकन

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, का मिला हुआ संस्कृतियों की एक अच्छी तरह से की सतह भर में एक बाँझ विंदुक टिप खींचकर एक घाव बनाHSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट या तले नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs।
  2. इसके तत्काल बाद लोग घायल हो गए के बाद, कोशिकाओं को दो बार 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ BEGM संस्कृतियों में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ 24 घंटे के लिए लोग घायल हो गए के बाद धोने और उन्हें बनाए रखना।
  3. घायल के बाद 24 घंटे 100X बढ़ाई पर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग HCEC छवियों फोटोग्राफ और पृष्ठभूमि का उपयोग कर फ़िल्टर सपाट प्रदर्शन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आदेश।
  4. माप का चयन करें आदेश का उपयोग करना, ब्याज (AOI) एक ही आकार बहुभुज आकार जो अंत से लंबरूप कवर कर सकते हैं प्रारंभिक घाव के अंत के साथ के क्षेत्र को परिभाषित, और प्रत्येक नमूने की घायल क्षेत्र में तीन अलग-अलग AOI निर्धारण करते हैं।
  5. गणना / आकार को मापने के मेनू विकल्पों का उपयोग कर प्रत्येक क्षेत्र में सेल नंबर स्वचालित रूप से गिनती।

6. से फ्लो Apoptosis के विश्लेषण

  1. संस्कृति HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट और नियंत्रण/ अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटों में 5 × 10 5 कोशिकाओं की एकाग्रता में IRNA ट्रांसफ़ेक्ट प्रत्येक 10 एनएम siRNA युक्त HCECs तक कोशिकाओं BEGM में एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 95% संगम तक पहुँचने।
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिनट, और महाप्राण trypsin EDTA के लिए 900 XG पर 5 मिनट, सेंट्रीफ्यूज के लिए अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर 0.25% trypsin EDTA का उपयोग HCECs को अलग करें 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग।
  3. कोशिकाओं ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोएं और फिर 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 1x में कोशिकाओं बाध्यकारी बफर (0.1 एम HEPES / NaOH [7.4 पीएच], 1.4 एम NaCl, और 25 मिमी 2 CaCl) resuspend।
  4. स्थानांतरण 100 सेल निलंबन (1 x 10 5 कोशिकाओं) μl एक 5 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में।
  5. 5 μl fluorescein आइसोथियोसाइनेट संयुग्मित Annexin वी और 5 μl propidium आयोडाइड जोड़ें।
  6. धीरे कोशिकाओं भंवर और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
  7. एक प्रवाह ग द्वारा कोशिकाओं प्रत्येक ट्यूब 1x बाध्यकारी बफर के 200 μl जोड़ें और विश्लेषण1 घंटा के भीतर ytometer।

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Representative Results

फॉस्फोरिलेटेड HSP27 की अभिव्यक्ति काफी 5, 10 में वृद्धि हुई है, और खरोंच के बाद 30 मिनट के unwounded HCECs 13 के साथ तुलना में घायल हो गए। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि फॉस्फोरिलेटेड HSP27 और फॉस्फोरिलेटेड Akt की अभिव्यक्ति दोनों काफी कम हो गई थी, जबकि Bax की अभिव्यक्ति काफी HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs (चित्रा 1 ए-ई) में वृद्धि की गई थी। फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति 30% और 10 एनएम में 40% और HSP27-विशिष्ट के 50 एनएम siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, क्रमशः, नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, लेकिन फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति के साथ तुलना में कम नहीं था (चित्रा 1 ए-बी की कमी थी )। इसके अलावा, गैर फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति 10 एनएम में 20% और 30% तक कम किया गया था और HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, क्रमशः, लेकिन गैर फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति कम नहीं था (चित्रा 1 ए और सी की 50 एनएम </ Strong>)।

खरोंच प्रेरित दिशात्मक लोग घायल हो गए परख संकेत दिया है कि लोग घायल हो गए, HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के बाद 24 घंटे में कम से 10 और 50 एनएम कम कर प्रदर्शन किया प्रवास (चित्रा 2)। इसके अलावा, HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs प्रवाह cytometry द्वारा तले नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (चित्रा 3) के साथ तुलना में अधिक apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु कराना पड़ा।

आकृति 1
चित्रा 1. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण फॉस्फोरिलेटेड HSP27 (पी-HSP27), गैर phosphorylated HSP27 (गैर-P-HSP27), फॉस्फोरिलेटेड AKT (पी-Akt) एक सेल अस्तित्व मार्कर के रूप में, गैर phosphorylated Akt खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग (गैर पी-Akt), बीसीएल 2eassociated एक्स प्रोटीन (Bax) एक समर्थक apoptotic प्रोटीन के रूप में, और GAPDH (ए)। फॉस्फोरिलेटेड और nonphosphorylated HSP27 की अभिव्यक्ति और फॉस्फोरिलेटेड Akt काफी कम (बी - डी), तथापि, Bax की अभिव्यक्ति काफी HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs (ई) में वृद्धि हुई नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में पाया गया है कि के साथ तुलना में (सभी पी <0.05)। फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति 30% और 10 एनएम में 40% और नकली नियंत्रण, क्रमशः के साथ तुलना में HSP27-विशिष्ट के 50 एनएम siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कमी थी, लेकिन फॉस्फोरिलेटेड HSP27 अभिव्यक्ति 10 एनएम में कम नहीं किया गया था और नियंत्रण siRNA के 50 एनएम -transfected कोशिकाओं (बी)। **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: समूहों के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.05)। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"> चित्र 2
चित्रा 2. स्क्रैच प्रेरित siRNA ट्रांसफ़ेक्ट HCECs में लोग घायल हो गए के बाद सेल प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए दिशात्मक लोग घायल हो गए परख। एक खरोंच घाव नियंत्रण और HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (ए) में बनाया गया था। 'कोशिकाओं घसीटा' क्षेत्रों से हटा दिया गया। घायल होने के बाद 24 घंटे में, HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के 10 और 50 एनएम 10 और 50 एनएम नियंत्रण siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (बी) के साथ तुलना में कोशिकाओं पलायन की कम संख्या का प्रदर्शन किया। ** और * समूहों के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.05) से संकेत मिलता है। डेटा ± मानक विचलन का मतलब है के रूप में। दिखाए जाते हैं, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन <br /> चित्रा 3. तले नियंत्रण siRNA और HSP27-विशिष्ट siRNA ट्रांसफ़ेक्ट मानव कॉर्निया उपकला कोशिकाओं (HCECs) Annexin वी और पीआई (ए और बी) के साथ लेबल की 50 एनएम के प्रवाह cytometry। quadrants में कुल कोशिकाओं का प्रतिशत (Annexin वी पॉजिटिव और पीआई नकारात्मक कोशिकाओं Q4, निचले सही) जल्दी apoptotic कोशिकाओं के लिए corresponded, देर apoptotic कोशिकाओं (Annexin वी पॉजिटिव और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं, Q2, ऊपरी दाएं), और परिगलित कोशिकाओं (Annexin वी के नकारात्मक और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं, Q1, ऊपरी बाएं)। HSP27-विशिष्ट siRNA-transfect HCECs siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं नियंत्रण से अधिक apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु की थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखक इस अध्ययन में कहा गया है किसी भी सामग्री या तरीकों में कोई वित्तीय या स्वामित्व हितों की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन में चिकित्सा, सोल, कोरिया के उल्सान कॉलेज विश्वविद्यालय के छात्र रिसर्च ग्रांट (13-14) और लाइफ साइंसेज के लिए आसन संस्थान, सोल, कोरिया से अनुदान (2014-464) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

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References

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आनुवंशिकी अंक 115 गर्मी झटका प्रोटीन 27 कार्निया उपकला कार्निया उपकला घाव भरने उपकला सेल apoptosis उपकला प्रवास आरएनए हस्तक्षेप siRNA आणविक जीव विज्ञान
कॉर्नियल उपकला घाव भरने के दौरान गर्मी झटका प्रोटीन 27 के समारोह के शाही सेना के हस्तक्षेप के आधार पर जांच
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Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

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