Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

RNA interferens-basert undersøkelse av funksjon av Heat Shock Protein 27 under hornhinneepitel Wound Healing

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

Hornhinnen epitelceller (CECs) kontinuerlig kaste inn tear film, mens de samtidig erstattet av celler fra limbus og hornhinneepitelet basale lag. 1 Forskjellige ytre stressfaktorer kan indusere apoptose og avskalling av CECs. 2 varmesjokkproteiner (HSP) er høyt konservert og kan deles inn i to familier i henhold til molekylstørrelse. 3 den største HSP-familien omfatter HSP90, HSP70, og hsp60, og den mindre familien omfatter HSP27. 4 fosforyleringen av HSP27 er kjent for å spille en viktig rolle i celleoverlevelse og er nødvendig for cellevandring på grunn av den rollen dette proteinet i aktin remodeling. 5-7 derfor vi forsøkte å teste potensielle rolle av HSP27-fosforylering i CEC migrasjon og apoptose i en in vitro modell av epitelial sårheling.

RNA interferens (RNAi) ved hjelp av enten små eller korte forstyrrende RNA (siRNA) har generated interesse for både grunnforskning og anvendt biologi, som det potensielt kan uttrykket av noen genet av interesse å bli slått ned. 8 Heri, brukte vi HSP27-spesifikke siRNA å vurdere bidraget av HSP27 til CEC sårtilheling og apoptose. Tradisjonelle RNAi metoder for gen knock-down i cellene bruker syntetiske RNA tomannsboliger, inkludert to umodifiserte 21-mer oligonukleotider som kan settes sammen for å skape sirnas. RNAi siRNA som vi anvendt i denne studien er en enkel og svært effektiv metode for å transfektere celler, og dette reagenset arbeider med forskjellige immortaliserte cellelinjer. I denne studien, viser vi de metoder som brukes for denne analysen, inkludert en ripe indusert retnings såret analysen, western blotting, siRNA transfeksjon analysen, immunfluorescens analysen, og flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellelinje

  1. Kultur 10 6 telomerase-udødeliggjort human corneale epitelceller (HCECs) i en 6-brønns plate (densitet: 1039,9 celle / mm 2) i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 atmosfære ved hjelp av bronkiale epitel vekstmedium (BEGM) inntil de når 95% samløpet.

2. Western Blot analyse etter Opprette Epithelial Skrape Wounds

  1. Serie en steril 200 mL pipettespissen over overflaten av en brønn av konfluente dyrkede HCECs fire ganger pr tallerken i en biologisk trygghetskabinett (klasse II, type A2) og inkuber HCECs separat i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 atmosfære i 1, 5, 10, 30, 60 og 120 min.
  2. Bruke en 6-brønns plate i seks forskjellige prøver i henhold til den inkubasjonstid etter hornhinneepitel såret.
  3. Vask sårede HCEC monolagene tre ganger med 1 x PBS og deretter tilsett 2,0 ml BEGM til hver brønn.
  4. Ta HCECs bruker 2ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) per brønn i 5 minutter, sentrifuger ved 900 xg i 5 min i et 15 ml rør, og aspireres trypsin-EDTA ved anvendelse av en 1 ml pipette.
  5. Suspendere HCECs med 1 ml 1x PBS og overføre dem til et 1,5 ml tube.
  6. Sentrifuger HCECs på 10 000 xg i 15 sek og aspirer 1x PBS med en 1 ml pipette.
  7. Resuspender HCECs i 100 ul iskald lyseringsbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid [PMSF], proteaseinhibitorer [1 uM pepstatin A, 1 pM leupeptin og 0,1 pM aprotinin] og 0,5% Triton X-100 [pH 7]) og blander dem godt.
  8. Inkuber cellene i 30 minutter på is for å indusere cellelyse.
  9. Sentrifuger lysatene ved 4 ° C ved 10 000 xg i 15 min, og deretter overføre supernatants til ferske 1,5 ml rør (90 ul porsjoner) og lagre dem ved -80 ° C.
  10. Bestemme total proteinkonsentrasjon av cellelysater ved anvendelse av Bradford protein analysen. 9
  11. Last 30 ug totalcelleproteiner til en 10% eller 12% akrylamidgel for natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og deretter elektroforetisk overføring separert proteinbånd til nitrocellulosefiltere med en 200 mA strøm i 1 time ved 4 ° C for å bruke i Western blot analyser.
  12. Blokker nitrocellulosefiltermembraner med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST) i 1 time, tilsett primært kanin polyklonale antistoffer mot ikke-fosforylert HSP27 (1: 1000 fortynning) eller primært kanin-polyklonalt antistoff mot fosforylert HSP27 (1 : 1000 fortynning) i 5% bovint serumalbumin (BSA), og inkubere membranene over natten ved 4 ° C på en ristemaskin.
  13. Detektere immunoreaktive bånd ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-antistoff (1: 10.000 fortynning) i 5% BSA etter vask i 10 minutter 3 ganger med TBST.
  14. Inkuber membranen i den vestlige blotting luminalen reagenser (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membran) i 1 min ved romtemperatur.
  15. Fjern membranen fra reagent løsning, fjerne overflødig væske med en absorberende håndkle, og plasser i en plastplate beskytter.
  16. Arbeid i et mørkt rom med en trygg lys, plasserer dekket membran i en film kassett med protein siden opp.
  17. Plasser røntgenfilm på toppen av membranen og eksponere i 1 min.

3. siRNA Transfeksjon analysen 10

  1. Kultur HCECs på 5 x 10 5 celler / brønn i en 6-brønns plate i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 atmosfære ved hjelp av BEGM inntil de når 95% konfluens.
  2. Fortynn transfeksjon reagens (2,5 eller 7,5 ul) med 100 ul redusert serummedium for transfeksjon (fortynningsfaktoren ble 41 eller 14,3) og oppløse det HSP27-spesifikke og kryptert kontroll siRNA i 100 pl redusert serummedium for å lage 10 eller 50 nM HSP27-spesifikke og egge kontroll siRNA.
  3. Bland 100 μ; L siRNA oppløsningen med 100 pl fortynnet reagens transfeksjon (1: 1 forhold) og inkuberes blandingen i 15 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett siRNA-lipid komplekser til celler. Deretter etter 4 timer endringsmateriale for å fullføre BEGM og inkuberes cellene i 2 dager ved 37 ° C.
  5. Analyser transfekterte celler ved western blotting, som beskrevet fra kapittel 4.1 til 4.7.

4. Western Blot analysen for siRNA-transfekterte celler 11

  1. Ekstraher HSP27-spesifikke og kryptert kontroll siRNA-transfektert HCECs i en biologisk sikkerhetskabinett ved anvendelse av 100 ul iskald lyseringsbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), proteaseinhibitorer, og 0,5% Triton X-100, pH 7).
  2. Inkuber cellene i 30 minutter på is for å indusere cellelyse.
  3. Pellet lysatene på 10.000 xg i 15 minutter og deretter overføre supernatants til fersk 1,5 ml kares (90 ul porsjoner) og lagre dem ved -80 ° C.
  4. Bestem proteinkonsentrasjonen av cellelysatene ved hjelp av Bradford-proteinanalysen. 9
  5. Last prøver med like mengder av de totale celleproteiner på en 10% eller 12% akrylamidgel, utsette gelen for SDS-PAGE og elektroforetisk overføring av de separerte proteinbåndene til nitrocellulosefiltere med en 200 mA strøm i 1 time ved 4 ° C for å bruk i Western blot analyser.
  6. Blokk-nitrocellulosefiltermembraner med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST) i 1 time, tilsett primære antistoffer mot fosforylert og ikke-fosforylert HSP27 (1: 1000 fortynning), fosforylert Akt (1: 1000 fortynning), ikke-fosforylert Akt (1: 1000 fortynning, brukt som en celleoverlevelse markør), Bcl-2-assosiert X-protein (1: 1000 fortynning, anvendt som en pro-apoptotisk protein), og glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200 fortynning, anvendt som en lasting kontroll) i 5% bovint serumalbumin (BSA), oginkubere membranene over natten ved 4 ° C på en ristemaskin.
  7. Detektere immunoreaktive bånd ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-antistoff (1: 10.000 fortynning) i 5% BSA etter vasking 3 ganger med TBST, 10 min hver vask.
  8. Inkuber membranen i Western blotting reagenser luminol (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membran) i 1 min ved romtemperatur.
  9. Fjern membranen fra reagent løsning, fjerne overflødig væske med en absorberende håndkle, og plasser i en plastplate beskytter.
  10. Arbeid i et mørkt rom med en trygg lys, plasserer dekket membran i en film kassett med proteinsiden opp.
  11. Plasser røntgenfilm på toppen av membranen og eksponere i 1 min.

5. Scratch-indusert Directional såret analyse Evaluering av celle migrasjon 12

  1. I et biologisk trygghetskabinett, lage et sår ved å dra en steril pipette over overflaten av en brønn av konfluente kulturer avHSP27-spesifikke siRNA-transfektert eller egge kontroll siRNA-transfektert HCECs.
  2. Umiddelbart etter at såret, vaskes cellene to ganger med 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) og holde dem i BEGM kulturer i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 atmosfære i 24 timer etter at såret.
  3. Fotografere HCEC bilder ved hjelp av en oppreist mikroskop med 100X forstørrelse 24 timer etter såret og utføre bakgrunn utflating hjelp av Filter kommandoen i bildeanalyse programvare.
  4. Bruke Velg Målinger kommandoen definerer området av interesse (AOI) med samme størrelse kantet form som kan dekke vinkelrett fra ende til ende av første såret, og bestemme tre forskjellige AOI i såret området av hver prøve.
  5. telle automatisk celle nummer i hvert felt ved hjelp av grev / Størrelse Mål menyalternativene.

6. Flowcytometri Analyse av apoptose

  1. Kultur HSP27-spesifikke siRNA-transfektert og kontroll syIRNA-transfekterte HCECs inneholdende hver 10 nM siRNA ved en konsentrasjon på 5 x 10 5 celler / brønn i 6-brønns plater inntil cellene når 95% konfluens i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 atmosfære i BEGM.
  2. Løsrive HCECs anvendelse av 2 ml 0,25% trypsin-EDTA per brønn i 5 minutter, sentrifuger ved 900 xg i 5 min i et 15 ml rør, og aspireres trypsin-EDTA ved anvendelse av en 1 ml pipette.
  3. Vask cellene to ganger med kald PBS og deretter resuspender cellene i 1 x bindingsbuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, og 25 mM CaCl2) til en konsentrasjon på 10 6 celler / ml.
  4. Overføre 100 ul cellesuspensjon (1 x 10 5 celler) i en 5 ml dyrkningsrør.
  5. Tilsett 5 mL fluoresceinisotiocyanat-konjugert Annexin V og 5 mL propidiumjodid.
  6. Forsiktig vortex celler og inkuber dem i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
  7. Tilsett 200 ul av 1 x bindingsbuffer til hvert rør og analysere cellene ved en strømnings cytometer innen 1 time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekspresjonen av fosforylert HSP27 betydelig økt ved 5, 10 og 30 min etter ripe sår sammenlignet med unwounded HCECs 13. Western blot-analyse avslørte at ekspresjonen av fosforylert HSP27 og fosforylert Akt ble begge vesentlig redusert, mens ekspresjonen av Bax var signifikant økt i HSP27-spesifikk siRNA-transfektert HCECs (figur 1A-E). Det fosforylerte HSP27-ekspresjon ble redusert med 30% og 40% i 10 nM og 50 nM av HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte celler, respektivt, sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler, men det fosforylerte HSP27-ekspresjon ble ikke redusert (figur 1A-B ). Dessuten ble det ikke-fosforylerte HSP27 ekspresjon redusert med 20% og 30% i 10 nM og 50 nM av HSP27-spesifikke siRNA transfekterte celler, henholdsvis, men den ikke-fosforylerte HSP27-ekspresjon ble ikke redusert (figur 1A og C </ Strong>).

Scratch-indusert retnings såret analyse indikerte at på 24 timer etter såret, HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte celler på 10 og 50 nM utstilt redusert migrasjon (figur 2). Videre HSP27-spesifikke siRNA-transfektert HCECs gikk mer apoptotiske og nekrotisk celledød sammenlignet med eggekontroll siRNA-transfekterte celler ved flowcytometri (figur 3).

Figur 1
Figur 1. Western blot-analyse ved anvendelse av antistoff mot fosforylert HSP27 (p-HSP27), ikke-fosforylert HSP27 (non-p-HSP27), fosforylert Akt (p-Akt) som en celle-overlevelse markør, ikke-fosforylert Akt (ikke- p-Akt), BCL-2eassociated X protein (Bax) som en pro-apoptotiske proteiner, og GAPDH (A). Ekspresjonen av fosforylert og nonphosphorylated HSP27 og fosforylert Akt betydelig redusert (B - D), men uttrykket av Bax betydelig økt i HSP27-spesifikke siRNA-transfektert HCECs (E), sammenlignet med det som ble observert hos kontroll siRNA-transfekterte celler (alle p <0,05). Det fosforylerte HSP27-ekspresjon ble redusert med 30% og 40% i 10 nM og 50 nM av HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte celler sammenlignet med mock-kontroll, respektivt, men det fosforylerte HSP27-ekspresjon ble ikke redusert i 10 nM og 50 nM av kontroll siRNA -transfected-celler (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: en statistisk signifikant forskjell mellom gruppene (p <0,05). Feilstolpene representerer standardavvik (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"> Figur 2
Figur 2. Scratch-indusert retnings såret analyse for å vurdere cellemigrasjon etter såret i siRNA-transfektert HCECs. En ripe såret ble opprettet i kontroll og HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte celler (A). Celler ble fjernet fra 'dratt' områder. Ved 24 timer etter såret, 10 og 50 nM av HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte celler oppviste lavere antall migrerende celler sammenlignet med 10 og 50 nM kontroll siRNA-transfekterte celler (B). ** Og * indikerer en statistisk signifikant forskjell mellom gruppene (p <0,05). Dataene er vist som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 <br /> Figur 3. Flow-cytometri av 50 nM av egge kontroll siRNA og HSP27-spesifikke siRNA-transfekterte humane corneale epitelceller (HCECs) merket med annexin V og PI (A og B). Prosentandelen av det totale antall celler i kvadranter tilsvarte tidlige apoptotiske celler (annexin V-positive og PI-negative celler, Q4, nederst til høyre), sen apoptotiske celler (annexin-V-positive og PI-positive celler, Q2, øverst til høyre), og nekrotiske celler (Annexin V-negative og PI-positive celler, Q1, øverst til venstre). HSP27-spesifikke siRNA-transfektere HCECs hadde mer apoptotiske og nekrotiske celledød enn kontroll siRNA-transfekterte celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske eller eierinteresser i noen materialer eller metoder som er nevnt i denne studien.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Studentstipend (13-14) fra University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea og et stipend (2014-464) fra Asan Institute for miljø- og biovitenskap, Seoul, Korea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

Genetikk heat shock protein 27 hornhinnen epitel hornhinneepitel sårheling epitelial celle apoptose epitel migrasjon RNA interferens siRNA molekylærbiologi
RNA interferens-basert undersøkelse av funksjon av Heat Shock Protein 27 under hornhinneepitel Wound Healing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter