Introduction
角膜上皮细胞（CEC上）不断脱落到泪膜，而他们同时由角膜缘和角膜上皮基底层细胞所替代。1各种外在压力能促使中欧国家的凋亡和脱屑。2热休克蛋白（HSP）是高度保守的，并且可以根据分子大小被分为两个家族。3最大HSP家族包括HSP90，HSP70和HSP60，而较小的家族包括HSP27 4 HSP27的磷酸化是已知在细胞存活中起重要作用和所需的细胞迁移，因为这种蛋白在肌动蛋白重塑的作用。5-7。因此，我们试图测试上皮伤口愈合的体外模型HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡的潜在作用。
RNA干扰或者使用小或短干扰RNA（RNAi）技术（siRNA）的有GE在基础和应用生物学nerated兴趣，因为它可能允许击倒任何感兴趣的基因的表达。8在此，我们使用的特定HSP27-siRNA转以评估HSP27的给CEC伤口愈合和细胞凋亡的贡献。传统的RNAi方法在细胞中的基因敲除使用合成的RNA双链体，包括可组装到创建的siRNAs 2未修饰21聚体寡核苷酸。所述RNAi的siRNA，我们在此本研究中使用的是转染细胞的简单高效的方法，以及该试剂可与各种永生化细胞系。在此研究中，我们证明用于该分析的方法，包括一个刮诱导定向伤口测定法，western印迹，siRNA转染测定法，免疫荧光测定法，和流式细胞术。
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Protocol
1.细胞系
- 培养10 6端粒酶永生化人角膜上皮在一个6孔板的细胞（HCECs）：在37℃培养箱中使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）于5％CO 2气氛（密度1039.9细胞/毫米2），直到他们达到95％汇合。
2. Western印迹分析创建上皮擦伤伤口后，
- 横跨汇合培养HCECs的阱的表面上的条纹无菌200μl的枪头每个培养皿四次在生物安全柜（II级，A2型）和在37℃培养箱用5％ 的 CO 2气氛中分别孵育HCECs 1，5，10，30，60，和120分钟。
- 根据角膜上皮创伤后的孵育时间用一个6孔板为六个不同的样品。
- 洗负伤HCEC单层三次用1×PBS，然后加入2.0毫升的BEGM到每个孔中。
- 分离使用2 HCECs毫升0.25％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA），每孔5分钟，离心，在900×g离心在一个15毫升管5分钟，并吸出胰蛋白酶-EDTA使用1毫升吸移管。
- 暂停HCECs用1ml 1×PBS中，并将它们传送到1.5ml管中。
- 以10,000×g离心15秒离心机HCECs和吸出1×PBS中使用1毫升吸管。
- 悬浮HCECs在100μl冰冷的裂解缓冲液（10mM的Tris，10 mM氯化钠，2mM EDTA的，25毫氟化钠，2毫的Na 3 VO 4，1mM的苯甲基磺酰氟[PMSF]，蛋白酶抑制剂[1μM的胃酶抑素A， 1μM的亮肽素，和0.1μM的抑肽酶]和0.5％的Triton X-100 [pH为7]），并将它们混合均匀。
- 孵育细胞30分钟，在冰上以诱导细胞裂解。
- 离心裂解物在10,000×g离心15分钟，4℃，然后上清液转移至新的1.5毫升管（90微升等份），并将它们存储在-80℃。
- 确定使用Bradford PR细胞裂解物的总蛋白浓度otein检测。9
- 负载30微克总细胞蛋白质成10％或12％丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电泳转移分离蛋白带向硝酸纤维素滤膜用200毫安的电流1小时，在4℃ C到免疫印迹试验使用。
- 块硝酸纤维素滤膜，用5％脱脂在Tris缓冲盐水乳用吐温20（TBST）1小时后，添加初级兔多克隆抗体对非磷酸化的HSP27（1：1000稀释）或抗磷酸HSP27初级兔多克隆抗体（1 ：1,000稀释度），在5％牛血清白蛋白（BSA），并在4℃在摇床上过夜孵育该膜。
- 用TBST洗涤后5％BSA的10分钟3次：检测用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 - 兔抗体免疫反应条带（10,000稀释1）。
- 在免疫印迹鲁米诺试剂孵化膜（6-7米升每10cm×5厘米膜），在室温下1分钟。
- 移除试剂溶液的膜，除去多余的液体，具有吸收巾，并将其放置在一个塑料片保护。
- 在黑暗的房间提供一个安全的工作灯，将覆盖膜在胶卷暗盒与蛋白质的一面朝上。
- 放置在膜顶部X射线胶片和暴露1分钟。
3. siRNA转染分析10
- 在5×10 5细胞培养HCECs /孔在37℃孵化用BEGM直到他们达到95％汇合于5％CO 2气氛中的6孔板中。
- 稀释转染试剂（2.5或7.5微升）与转（稀释倍数为41或14.3）100微升减少血清中和溶解HSP27特异性的，并在100微升炒对照siRNA降低血清中创建的10或50纳米HSP27特异性和炒对照siRNA。
- 混合100μ;用100μl稀释转染试剂升siRNA溶液（1：1的比例），并孵育混合物在室温下15分钟。
- 所述siRNA脂质复合物添加到细胞中。然后经过4小时改变介质在37℃下完成BEGM孵育细胞2天。
- 通过Western印迹分析转染细胞从4.1节所述4.7。
4. Western blot检测用于siRNA转染细胞11
- 提取HSP27特异性和使用100μl的冰冷的裂解缓冲液（10mM的Tris，10 mM氯化钠，2mM的乙二胺四乙酸（EDTA），25mM的氟化钠，2毫的Na 3 VO加扰对照siRNA转染HCECs在生物安全柜4，1mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），蛋白酶抑制剂，和0.5％的Triton X-100，pH 7）中。
- 孵育细胞30分钟，在冰上以诱导细胞裂解。
- 以10,000 xg离心沉淀裂解物15分钟，然后上清转移至新的1.5mL桶ES（90微升等份），并将它们存储在-80℃。
- 确定使用Bradford蛋白测定的细胞裂解物的蛋白浓度。9
- 与在10％或12％丙烯酰胺凝胶等量总细胞蛋白的负荷样品，若使凝胶进行SDS-PAGE，并电泳以200毫安的电流，在4℃下传送所分离的蛋白带向硝酸纤维素滤膜1小时至在免疫印迹试验使用。
- 块硝酸纤维素滤膜，用5％脱脂在Tris缓冲盐水乳用吐温20（TBST）1小时后，添加抗磷酸和未磷酸化HSP27初级抗体（1：1000稀释度），磷酸化Akt（1：1,000稀释度），非磷酸化的Akt（1：1000稀释，用作细胞存活标记物），Bcl-2的相关X蛋白（1：1000稀释，用作促凋亡蛋白），和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH; 1 1:200稀释，用作上样对照）的5％牛血清白蛋白（BSA），并过夜孵育所述膜于4℃在振荡器上。
- 检测用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 - 兔抗体免疫反应条带（1：10,000稀释），在5％的BSA洗涤后用TBST 3次，每次10分钟洗涤。
- 在室温下1分钟孵育的印迹鲁米诺试剂膜（6-7毫升每10cm×5厘米膜）。
- 移除试剂溶液的膜，除去多余的液体，具有吸收巾，并将其放置在一个塑料片保护。
- 在黑暗的房间提供一个安全的工作灯，将覆盖膜与蛋白质面朝上胶片盒。
- 放置在膜的顶部X射线胶片和暴露1分钟。
5.划痕引起的定向伤人分析评估细胞迁移12
- 在生物安全柜，通过在表面上拖动的汇合培养物的孔中的一个无菌枪头使伤口HSP27特异性siRNA转染或炒对照siRNA转染HCECs。
- 伤人后立即，洗细胞两次用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），并保持它们在BEGM培养在37℃培养箱用5％ 的 CO 2气氛中24小时伤人后。
- 照片使用正置显微镜放大100倍的图像HCEC伤后24小时，进行使用过滤背景压扁 在图像分析软件命令。
- 使用选择测量命令，确定利息（AOI）与同尺寸的多边形形状，可以从一端垂直覆盖，结束初期伤口的区域，并在每个样品的受伤面积确定三个不同的AOI。
- 自动计数使用计算/尺寸测量菜单选项在各个领域的手机号码。
凋亡6.流式细胞仪分析
- 文化HSP27特异性siRNA转染和CONTROL S的iRNA转染的含有各10nM的siRNA的HCECs在/孔在6孔板5×10 5个细胞的浓度，直到细胞达到在37℃培养箱中，在BEGM一个5％CO 2气氛中95％汇合。
- 使用1毫升吸管分离使用每孔2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA HCECs 5分钟，离心，在900×g离心在一个15毫升管5分钟，并吸出胰蛋白酶-EDTA。
- 用冷PBS洗涤细胞两次，然后以10 6个细胞/ ml的浓度重悬在1×细胞结合缓冲液（0.1M HEPES /氢氧化钠[pH为7.4]，1.4 M氯化钠，和25mM 氯化钙 ）。
- 转移100μl的细胞悬浮液（1×10 5个细胞）到5ml的培养管中。
- 添加5μl的异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V和5μl碘化丙啶。
- 轻轻涡旋细胞，并培育他们在黑暗中室温下15分钟。
- 通过流动Ç加入200μl1X结合缓冲液中向每个管和分析细胞1小时内ytometer。
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Representative Results
在5，10磷酸化HSP27的表达显著上升，划痕后30分钟，未受伤的HCECs 13伤人比较。免疫印迹分析表明，磷酸HSP27和磷酸化Akt的表达均被显著降低，而Bax的表达在特定HSP27-siRNA转染HCECs（ 图1A-E）中的显著增加。减少了30％，在10nM的40％和HSP27特异性为50nM的siRNA转染的细胞，分别与对照siRNA转染的细胞，但磷酸化HSP27表达相比没有减少（ 图1A-B中的磷酸化的HSP27表达）。此外，降低了非磷酸HSP27表达了20％和30％中为10nM和50nM HSP27特异性siRNA转染的细胞，分别，但非磷酸HSP27表达没有减少（ 图1A和C的</ STRONG>）。
刮擦诱导定向伤人分析表明，在伤人，HSP27特异性siRNA转染细胞24小时后在10和50处具有降低的迁移（ 图2）。此外，特定的HSP27-siRNA转染HCECs与通过流式细胞术（ 图3）加扰对照siRNA转染的细胞相比，接受更多的凋亡和坏死性细胞死亡。
使用抗磷酸化的HSP27（对HSP27），非磷酸化HSP27（非对HSP27），磷酸化Akt（磷酸化Akt），为细胞存活标记，非磷酸化的Akt（ 图1的Western印迹分析的非p-Akt蛋白），BCL-2eassociated X蛋白（BAX）作为促凋亡蛋白和GAPDH（A）。磷酸化和非磷酸化HSP27的表达磷酸化Akt显著下降（B - D）中 ，但是，Bax的表达在具体的HSP27-siRNA转染HCECs（E）的显著增加，与在对照siRNA转染的细胞中观察到相比（所有的p <0.05）。用30％和10nM的40％，与模拟控制，分别比较HSP27特异性为50nM的siRNA转染的细胞减少磷酸化的HSP27的表达，但磷酸化HSP27表达没有在10nM的减少和对照siRNA的50nM的-transfected细胞（B）。 **，*; †，††; ‡，‡‡; §，§§：组间有统计学显著差异（p <0.05）。误差条表示标准偏差（SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.划痕引起的定向伤人检测siRNA转染HCECs伤人后评估细胞迁移。划痕伤口是在控制和特定HSP27-siRNA转染细胞（A）创建的。细胞从“拖”区域移除。在受伤后24小时，具体HSP27-siRNA转染细胞的10和50处具有迁移细胞与10和50nM对照siRNA转染的细胞（B）相比的数字低。 ** *和指示组之间有统计学显著差异（p <0.05）。数据显示为平均值±标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
<加扰控制siRNA和标记的膜联蛋白V和PI（A和B）特定HSP27-siRNA转染的人角膜上皮细胞（HCECs）的50纳米的登记/> 图3.流式细胞术。总细胞的象限的百分比对应于早期凋亡细胞（膜联蛋白V阳性和PI阴性细胞，Q4，右下），晚期凋亡细胞（膜联蛋白V阳性和PI阳性细胞，Q2，右上），和坏死细胞（膜联蛋白V-阴性和PI阳性细胞中，Q 1，左上）。具体HSP27-的siRNA转染HCECs具有比对照siRNA转染的细胞更凋亡和坏死的细胞死亡。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
笔者在本研究中提及的任何材料或方法没有财务或专有权益。
Acknowledgments
这项研究是由医学，韩国首尔，蔚山大学学院的学生研究资助（13-14），并从峨山生命科学研究所，韩国首尔赠款（2014-464）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | CHC LAB Co.Ltd, Daejeon, Republic of Korea | CHC-777A2-06 | Class II, Type A2 |
| Stealth RNAi™ siRNA | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA | |
| BEGMTM | Lonza, Inc., Walkersville, MD | CC-3171, CC4175 | Bronchial epithelium growth medium |
| Protease inhibitor | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | P8340 ,P7626 | 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin |
| Bradford protein assay | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | #500-0001 | Bradford protein assay |
| Nitrocellulose filters | Amersham, Little Chalfont, UK | RPN3032D | Western blotting membrane |
| Non-phosphorylated HSP27 | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab12351 | 1:1,000 dilution (Total HSP27) |
| Phosphorylated HSP27 (Ser85) | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab5594 | 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85 |
| Lipofectamine® RNAiMAX reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA | 13-778-075 | Transfection reagent |
| Phosphorylated Akt (Ser473) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4060 | 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker) |
| Non-phosphorylated Akt | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4061 | 1:1,000 dilution (Total Akt) |
| Bcl-2-associated X protein | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4062 | 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker) |
| GAPDH | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | No. 4063 | 1:1,000 loading control marker (house keeping gene) |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | NCI1460KR | 1:10,000 dilution |
| OPTI-MEM | Invitrogen, Carlsbad, CA | 31985 | reduced serum medium for transfection |
| Image analysis software | Olympus, Inc., Tokyo, Japan | Image-Pro Plus 5.0 | |
| Skimed milk powder | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany | T145.2 | |
| Tris | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0497 | |
| Sodium Chloride | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0241 | |
| Six well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 140675 | 35.00 mm diameter / well |
| 24-well culuture dish | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 142475 | |
| Orbital shaker | N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea | NB1015 | |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2323 | |
| BDFACSCantoTM II | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | Flow cytometry | |
| X-Ray Film | Kodak, Rochester, NY | Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen | |
| western blotting luminol reagent | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2048 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 556547 |
References
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