Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

RNA-interferens-baserede Undersøgelse af funktion Heat Shock Protein 27 under hornhindeepitelkulturer Sårheling

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

Hornhindeepitelceller (de central- og østeuropæiske) kontinuerligt kaste ind tårefilmen, medens de samtidig erstattes af celler fra limbus og hornhindeepitelceller basale lag. 1 Forskellige ydre stressfaktorer kan inducere apoptose og afskalning af CØE. 2 De varmechokproteiner (HSP'er) er stærkt konserverede og kan opdeles i to familier ifølge molekylstørrelse. 3 den største HSP familien omfatter HSP90, HSP70, og HSP60, og den mindre familie omfatter HSP27. 4 phosphorylering af HSP27 vides at spille en vigtig rolle i celle overlevelse og er nødvendig for cellemigrering på grund af den rolle, dette protein i actin remodeling. 5-7 Derfor forsøgte vi at teste potentielle rolle HSP27-phosphorylering i CEC migration og apoptose i en in vitro model af epitelial sårheling.

RNA-interferens (RNAi) under anvendelse af enten små eller lille interfererende RNA'er (siRNA) har genereres interesse i både basal og anvendt biologi, da den potentielt tillader ekspressionen af ethvert gen af interesse at blive slået ned. 8. Heri anvendte vi HSP27-specifikke siRNA at vurdere bidraget af HSP27 til CEC sårheling og apoptose. Traditionelle RNAi fremgangsmåder til gen-knockdown i celler bruger syntetiske RNA-duplekser, herunder to umodificerede 21-mer oligonucleotider, der kan samles til at skabe siRNAs. RNAi siRNA, som vi brugte i denne foreliggende undersøgelse er en enkel og meget effektiv metode til at transficere celler, og dette reagens virker med forskellige udødeliggjorte cellelinier. I denne foreliggende undersøgelse viser vi anvendte til denne analyse metoder, herunder en ridse-induceret retningsbestemt sår assay, western blotting, siRNA transfektionsassay, immunofluorescens assay og flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellelinie

  1. Kultur 10 6 telomerase-immortaliserede humane hornhindeepitelceller (HCECs) i en 6-brønds plade (densitet: 1039,9 celle / mm 2) i en 37 ° C inkubator med en 5% CO2-atmosfære ved anvendelse bronkieepitel vækstmedium (BEGM) indtil de når 95% konfluens.

2. Western blot analyse efter Oprettelse Epiteliale Skrab Sår

  1. Streak en steril 200 gl pipettespids hen over overfladen af en brønd af sammenflydende dyrkede HCECs fire gange om skålen i en biologisk sikkerhedsskab (klasse II, type A2) og inkuberes HCECs separat i en 37 ° C inkubator med en 5% CO2-atmosfære i 1, 5, 10, 30, 60 og 120 min.
  2. Brug en plade med 6 brønde i seks forskellige prøver efter den inkubationstiden efter hornhindeepitel sårdannelse.
  3. Vask såret HCEC monolag tre gange med 1 x PBS og derefter tilføje 2,0 ml BEGM til hver brønd.
  4. Frigør HCECs bruger 2ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pr i 5 minutter, centrifugeres ved 900 xg i 5 min i et 15 ml rør, og aspireres trypsin-EDTA under anvendelse af en 1 ml pipette.
  5. Suspender HCECs med 1 ml 1x PBS og overføre dem til et 1,5 ml rør.
  6. Centrifuger HCECs på 10.000 xg i 15 sek og aspirat 1x PBS ved hjælp af en 1 ml pipette.
  7. Resuspender HCECs i 100 pi iskold lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], proteaseinhibitorer [1 uM pepstatin A, 1 uM leupeptin og 0,1 uM aprotinin] og 0,5% Triton X-100 [pH 7]) og bland dem godt.
  8. Cellerne inkuberes i 30 minutter på is for at inducere cellelyse.
  9. Centrifuger lysater ved 4 ° C ved 10.000 xg i 15 min, og derefter overføre supernatanter friske 1,5 ml rør (90 pi prøver) og gemme dem ved -80 ° C.
  10. Bestemmelse af samlet proteinkoncentrationer på cellelysater under anvendelse af Bradford protein assay. 9
  11. Load 30 ug total celleproteiner i en 10% eller 12% acrylamid gel til natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter elektroforetisk overførsel separeret proteinbånd til nitrocellulosefiltre med en 200 mA i 1 time ved 4 ° C til brug i Western blot assays.
  12. Blok nitrocellulosefilter membraner med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST) i 1 time, tilsættes primære kanin polyklonale antistoffer mod ikke-phosphoryleret HSP27 (1: 1.000 fortynding) eller primær kanin polyklonalt antistof mod phosphoryleret HSP27 (1 : 1.000 fortynding) i 5% bovint serumalbumin (BSA), og inkuber membranerne natten over ved 4 ° C på en ryster.
  13. Detect immunreaktive bånd vha peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-kanin-antistoffer (1: 10.000 fortynding) i 5% BSA efter vask i 10 minutter 3 gange med TBST.
  14. Inkubér membranen i de vestlige blotting luminol reagenser (6-7 ml pr 10 cm x 5 cm membran) i 1 min ved stuetemperatur.
  15. Fjern membranen fra reagens løsning, fjerne overskydende væske med et absorberende håndklæde, og sted i en plastfolie beskytter.
  16. Arbejde i et mørkt rum med en sikker lys, placere dækket membran i en film kassette med protein opad.
  17. Placer røntgenfilm oven på membranen og eksponere i 1 min.

3. siRNA Transfektion Assay 10

  1. Kultur HCECs på 5 × 10 5 celler / brønd i en 6-brønds plade i en 37 ° C inkubator med en 5% CO2-atmosfære ved anvendelse BEGM indtil de når 95% konfluens.
  2. Fortyndes transfektion reagens (2.5 eller 7.5 pi) med 100 ul reduceret serum medium for transfektion (fortyndingsfaktoren var 41 eller 14.3), og opløse HSP27-specifikke og scrambled kontrol siRNA i 100 pi reduceret serum medium til at skabe 10 eller 50 nM HSP27-specifikke og krypterede kontrol siRNA.
  3. Bland 100 μL siRNA opløsning med 100 pi fortyndet transfektionsreagens (1: 1-forhold) og inkuber blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilsæt siRNA-lipid komplekser til cellerne. Så efter 4 timers skift medier for at fuldføre BEGM og inkuber cellerne i 2 dage ved 37 ° C.
  5. Analyser transficerede celler ved Western blotting, som beskrevet fra punkt 4.1 til 4.7.

4. Western blot assay for siRNA-transficerede celler 11

  1. Uddrag HSP27-specifikke og krypterede kontrol siRNA-transficerede HCECs i et biologisk sikkerhedsskab anvendelse af 100 pi iskold lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), proteaseinhibitorer, og 0,5% Triton X-100, pH 7).
  2. Cellerne inkuberes i 30 minutter på is for at inducere cellelyse.
  3. Pellet lysater på 10.000 xg i 15 minutter og derefter overføre supernatanter til frisk 1,5 ml karbades (90 pi prøver) og gemme dem ved -80 ° C.
  4. Bestem proteinkoncentrationer på cellelysaterne under anvendelse af Bradford protein assay. 9
  5. Load prøver med ens mængder af totale celleproteiner på en 10% eller 12% acrylamidgel, underkaste gelen til SDS-PAGE, og elektroforetisk overføre de separerede proteinbånd til nitrocellulosefiltre med en 200 mA i 1 time ved 4 ° C til anvendelse i Western blot assays.
  6. Blok nitrocellulose filter membraner med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST) i 1 time, tilsættes primære antistoffer mod phosphorylerede og ikke-phosphorylerede HSP27 (1: 1.000 fortynding), phosphoryleret Akt (1: 1.000 fortynding), ikke-phosphoryleret Akt (1: 1.000-fortynding, anvendes som celleoverlevelse markør), Bcl-2-associeret X protein (1: 1000 fortynding, anvendes som et pro-apoptotisk protein), og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200-fortynding, anvendt som en loading kontrol) i 5% bovint serumalbumin (BSA), oginkubere membranerne natten over ved 4 ° C på en ryster.
  7. Detect immunreaktive bånd vha peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-kanin-antistoffer (1: 10.000 fortynding) i 5% BSA efter vask 3 gange med TBST, 10 minutter hver vask.
  8. Inkuber membranen i de vestlige blotting luminol reagenser (6-7 ml pr 10 cm x 5 cm membran) i 1 min ved stuetemperatur.
  9. Fjern membranen fra reagens løsning, fjerne overskydende væske med et absorberende håndklæde, og sted i en plastfolie beskytter.
  10. Arbejde i et mørkt rum med en sikker lys, placere den overdækkede membran i en film kassette med proteinet opad.
  11. Placer røntgenfilm oven på membranen og eksponere i 1 min.

5. Scratch-induceret Directional Anskydning Assay Evaluering af cellemigrering 12

  1. I et biologisk sikkerhedsskab, gøre et sår ved at trække en steril pipettespids hen over overfladen af ​​en brønd af sammenflydende kulturer afHSP27-specifikke siRNA-transficerede eller krypterede kontrol siRNA-transficerede HCECs.
  2. Umiddelbart efter sårdannelse, vaskes cellerne to gange med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og opretholde dem i BEGM kulturer i en 37 ° C inkubator med en 5% CO2-atmosfære i 24 timer efter sårdannelse.
  3. Fotografi HCEC billeder ved hjælp af en opretstående mikroskop ved 100X forstørrelse 24 timer efter sårede og udføre baggrunden udfladning ved hjælp af Filter kommando i billedanalysesoftware.
  4. Brug af Vælg Målinger kommando, definere interesseområdet (AOI) med samme størrelse polygonal form, som kan dække vinkelret fra ende til ende af indledende sår, og bestemme tre forskellige AOI i sårede område af hver prøve.
  5. tæller automatisk celletallet i hvert felt ved hjælp af Greven / Size Mål menupunkter.

6. flowcytometrianalyse af apoptose

  1. Kultur HSP27-specifikke siRNA-transficerede og kontrol sIRNA-transficerede HCECs indeholdende hver 10 nM siRNA ved en koncentration på 5 x 10 5 celler / brønd i 6-brønds plader, indtil cellerne når 95% konfluens i en 37 ° C inkubator med en 5% CO2-atmosfære i BEGM.
  2. Frigør HCECs anvendelse af 2 ml 0,25% trypsin-EDTA per brønd i 5 minutter, centrifugeres ved 900 xg i 5 min i et 15 ml rør, og aspireres trypsin-EDTA under anvendelse af en 1 ml pipette.
  3. Vask cellerne to gange med kold PBS og derefter resuspender cellerne i 1x bindingspuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, og 25 mM CaCl2) ved en koncentration på 10 6 celler / ml.
  4. Transfer 100 ul cellesuspension (1 x 10 5 celler) i en 5 ml kultur rør.
  5. Tilsæt 5 pi fluoresceinisothiocyanat-konjugeret Annexin V og 5 pi propidiumiodid.
  6. Forsigtigt vortexes cellerne og inkuberes dem i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  7. Tilsæt 200 pi 1x binding buffer til hvert rør og analysere cellerne ved et flow cytometer inden for 1 time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekspressionen af phosphoryleret HSP27 steget betydeligt ved 5, 10 og 30 min efter bunden sårede forhold til læderede HCECs 13. Western blot-analyse viste, at ekspressionen af phosphoryleret HSP27 og phosphoryleret Akt blev begge væsentligt reduceret, hvorimod ekspressionen af Bax blev signifikant forøget i Hsp27-specifikke siRNA-transficerede HCECs (Figur 1A-E). Det phosphorylerede HSP27-ekspression blev reduceret med 30% og 40% i 10 nM og 50 nM HSP27-specifikke siRNA-transficerede celler, sammenlignet med kontrol siRNA-transficerede celler, men det phosphorylerede HSP27-ekspression blev ikke reduceret (figur 1A-B ). Desuden blev ikke-phosphoryleret HSP27-ekspression reduceres med 20% og 30% i 10 nM og 50 nM HSP27-specifikke siRNA transficerede celler, henholdsvis, men ikke-phosphorylerede HSP27-ekspression blev ikke reduceret (figur 1A og C </ Strong>).

Scratch-inducerede retningsbestemt sårdannelse assay indikerede, at ved 24 timer efter sårdannelse HSP27-specifikke siRNA-transficerede celler ved 10 og 50 nM udviste reduceret migration (figur 2). Desuden HSP27-specifikke siRNA-transficerede HCECs undergik mere apoptotisk og nekrotisk celledød sammenlignet med scrambled kontrol siRNA-transficerede celler ved flowcytometri (figur 3).

figur 1
Figur 1. Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod phosphorylerede HSP27 (p-HSP27), ikke-phosphoryleret HSP27 (ikke-p-HSP27), phosphoryleret Akt (p-Akt) som en celle-overlevelse markering, ikke-phosphoryleret Akt (ikke- p-Akt), Bcl-2eassociated X protein (Bax) som et pro-apoptotisk protein, og GAPDH (a). Ekspressionen af ​​phosphoryleret og ikke-phosphoryleret HSP27 og phosphoryleret Akt faldt betydeligt (B - D), men udtryk for Bax steget betydeligt i de Hsp27-specifikke siRNA-transficerede HCECs (E), sammenlignet med observeret i kontrol siRNA-transficerede celler (alle p <0,05). Det phosphorylerede HSP27-ekspression blev reduceret med 30% og 40% i 10 nM og 50 nM HSP27-specifikke siRNA-transficerede celler sammenlignet med mock kontrol henholdsvis men det phosphorylerede HSP27-ekspression blev ikke reduceret i 10 nM og 50 nM kontrol siRNA transficerede celler (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: en statistisk signifikant forskel mellem grupper (p <0,05). De fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af dette tal.

"> Figur 2
Figur 2. Scratch-induceret retningsbestemt sårdannelse assay til at evaluere cellemigrering efter sårdannelse i siRNA-transficerede HCECs. En ridse sår blev skabt i kontrol og HSP27-specifikke siRNA-transficerede celler (A). Celler blev fjernet fra de "trukket" områder. Ved 24 timer efter sårdannelse, 10 og 50 nM af Hsp27-specifikke siRNA-transficerede celler udviste lavere antal migrerende celler sammenlignet med de 10 og 50 nM kontrol siRNA-transficerede celler (B). ** Og * angiver en statistisk signifikant forskel mellem grupper (p <0,05). Data er vist som middel ± standardafvigelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 <br /> Figur 3. Flowcytometri af 50 nM af krypterede kontrol siRNA og HSP27-specifikke siRNA-transficerede humane hornhindeepitelceller (HCECs) mærket med annexin V og PI (A og B). Procentdelen af ​​de samlede celler i kvadranter svarede til tidlige apoptotiske celler (annexin V-positive og PI-negative celler, Q4, nederst til højre), sent apoptotiske celler (annexin V-positive og PI-positive celler, Q2, øverst til højre), og nekrotiske celler (annexin V-negative og PI-positive celler, Q1, øverst til venstre). Hsp27-specifikke siRNA-transfektion HCECs havde mere apoptotisk og nekrotisk celledød end kontrol siRNA-transficerede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke har økonomiske eller proprietære interesser i materialer eller metoder, der er nævnt i denne undersøgelse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Student Research Grant (13-14) af University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea og et tilskud (2014-464) fra Asan Institut for Life Sciences, Seoul, Korea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

Genetik varmechokprotein 27 hornhindeepitelet hornhinde-epitel sårheling epitelcelle apoptose epithelmigrering RNA-interferens siRNA molekylærbiologi
RNA-interferens-baserede Undersøgelse af funktion Heat Shock Protein 27 under hornhindeepitelkulturer Sårheling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter