Abstract
Способ описан в котором квантовые точки (КТ) наночастицы могут быть использованы для корреляционного иммуноцитохимических исследований ткани патологии человека с использованием Widefield флуоресцентной световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Чтобы продемонстрировать протокол мы immunolabeled ультратонких эпоксидные участки опухоли соматостатинома человека с использованием первичных антител к соматостатин, с последующим биотинилированного вторичного антитела и визуализации стрептавидином, конъюгированного 585 нм кадмий-селен (CdSe) квантовых точек (КТ). Секции монтируются на образце сетки ПЭМ затем помещали на предметное стекло для наблюдения с помощью Widefield флуоресценции световой микроскопии. Световая микроскопия показывает 585 нм QD маркировке ярко-оранжевой флуоресценции, образуя зернистую картину внутри опухолевых клеток цитоплазмы. При низкой до середины диапазона увеличения с помощью световой микроскопии образец маркировки можно легко распознать и уровень неспецифической или фоновой маркировки оценены. Это критическийшаг для последующей интерпретации картины иммунноокрашивания методом просвечивающей электронной микроскопии и оценки морфологического контекста. В этом же разделе затем высушены и просмотрены с помощью ПЭМ. QD зонды видно быть прикреплены к аморфным материалом, содержащимся в отдельных секреторных гранул. Изображения получены из той же области интереса (ROI), видно с помощью световой микроскопии для корреляционного анализа. Соответствующие образы из каждой модальности могут затем быть смешаны для наложения данных флуоресценции на ТЕМ ультраструктуры соответствующего региона.
Introduction
Коррелятивное свето- и электронная микроскопия (CLEM) является мощным подходом для анализа переходных динамических событий 1, редких событий 2, 3 и 4 сложных систем. Есть много различных технических перестановками доступных 5 в зависимости от того , какой вопрос однако общим требованием является то , что та же самая структура , в одном образце 6 проецируется множественными модальностей микроскопии. Наш особый подход к CLEM был разработан для изучения архивных ткани патологии человека и при используемой здесь было хорошо охарактеризованы и опубликованы ранее 7. Цель состояла в том, во-первых, чтобы максимизировать аналитические данные из одного биопсии или хирургического образца и, во-вторых, использовать флуоресценцию световой микроскопии, чтобы помочь прояснить контекст Иммуноцитохимическую рисунка видно маркировки на ультраструктурном уровне.
Квантовая точка нанокристаллов (квантовых точек) предлагают потенциал системы ABL универсальный маркере , чтобы быть просмотрены как флуоресценцию световой микроскопии и электронной микроскопии 8, 9, 10. Их кристаллическая структура ядра позволяет квантовых точек разных размеров , чтобы генерировать широкий спектр пиков флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны вдали от их спектров испускания 11. Их атомный вес достаточно, чтобы получить плотность электронов, обнаруживаемых с помощью просвечивающей электронной микроскопии, сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM) или полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии. Они особенно подходят для иммуноцитохимических исследований, которые могут наблюдаться даже отдельные КТ дает предельную чувствительность одной QD на молекулы - мишени 12. Кроме того, в зависимости от QD используются они могут обладать индивидуальной элементарную подпись, подходящую для отображения.
Образцы патологии человека предлагают значительные преимущества для поступательной биомедицинских исследований. Хирургическая ткани и образцы биопсии обычно представляются на Biobanking и appropетел этики зазоры могут быть доступны для научных исследований. Человеческая ткань не имеют вопросы, имеющие отношение или интерпретации , которые могут произойти в животных или в пробирке моделях болезни. Тем не менее, подготовка образца образцов патологии часто не является оптимальным. Там может быть задержка в ткани помещаются в фиксаторе, неприемлемое закрепляющий использовали такие как формалин, а не для глутаральдегиду ТЭМ и неприемлемом выборки. Методы Клем имеют потенциал для оптимизации диагностики и прогностическую информацию доступной из одного человека образца. Тем не менее, некоторые недавно разработанные корреляционные подходы , такие как те , которые используют мини - генератор синглетного кислорода (miniSOG) не доступны для использования в патологии в связи с необходимостью для тега , чтобы быть генетически закодированы в клетку интереса 13. По этой причине мы исследовали полезность QD маркировки обычно подготовленной ТЕМ ткани для корреляционного иммуноцитохимических исследований. КТ применяется к гравированным эпоксидной или акриловой смолы секций из LiОбразцы ghtly альдегид фиксированные биопсии ткани и обеспечивают возможность получения соотносительную флуоресценции световой микроскопии и данные ПЭМ из одного образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ткань Вскрытие и Фиксацию
- Ткань Вскрытие
- Рассеките кусочки ткани из опухоли хирургическим путем резекцию образца ткани или биопсии.
Примечание: Ткань используемая в этом исследовании было обычно фиксировали в формалине, но свежей ткани также подходит. Мы выбрали область подтверждена и о котором сообщает патологоанатом содержать опухоль соматостатинома после последующего гистологического окрашивания и анти-соматостатин иммунное (не показан). - Используйте кусочки ткани размером не более приблизительно 1,0 мм 3.
- Рассеките кусочки ткани из опухоли хирургическим путем резекцию образца ткани или биопсии.
- Какодилатном буфере Получение
- Подготовка исходного буферного раствора (1 М) путем добавления 21,4 г какодилате натрия (см список материалов) и 3,0 мл 1% -ного раствора хлорида кальция в 90 мл дистиллированной воды и затем долива раствора до конечного объема 100 мл. Перемешать раствор и оставить его стоять в течение ночи, так что кристаллический реагент полностью растворяется.
- Фиксирующий Подготовка и использование
- Добавьте один 10 мл ампулу 50% -ного раствора глутарового альдегида в 20 мл исходного раствора какодилат натрия (1 М). Долить дистиллированной водой до 190 мл. Проверяют рН и отрегулировать до 7,4 путем добавления 1 - 4 капли 3% соляной кислоты (HCl), если это необходимо.
- Долить дистиллированной водой до конечного объема 200 мл.
- Погружают ткань в фиксаторе , содержащем 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий - какодилатном буфере с рН 7,4 в течение 24 ч при 4 ° С в стеклянной трубке пробы. Отбросить неиспользуемые закрепитель после 1 недели.
2. обработка ткани и встраивание
- осмий ТетроXide Окрашивание
- После фиксации завершена, погружают ткань в какодилатном натрия буфере (0,1 М) в течение 20 мин, а затем повторить в течение еще 20 мин.
- Приготовьте 2% -ного водного раствора осмий осмия (OSO 4) рабочего раствора путем добавления 8,0 мл 5% OSO 4 маточного раствора до 2,0 мл какодилат натрия буферного раствора (1 М) и 10,0 мл дистиллированной воды , чтобы конечный объем 20,0 мл.
- Удалить буфер затем погружают ткань в 2% OsO 4 при рН 7,4 в течение 4 ч при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ! Соблюдайте осторожность при декантации и подготовки OsO 4 решения, носить соответствующие средства индивидуальной защиты и работы в вытяжном шкафу во все времена.
- Уранилацетате Окрашивание
- После того, как ткань osmication завершена, удалить раствор OsO 4 и погружают ткань в 2% ацетата натрия в течение 10 мин. Удалить 2% ацетата натрия затем погружают в 2% ацетата уранила в течение 1 ч прикомнатная температура.
- дегидратация
- Высушить ткани через градуированных спиртов. Используйте 50% этаноле в течение 10 мин, 70% этаноле в течение 10 мин, 95% этаноле в течение 10 мин и две смены 100% этанола в течение 20 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Выполните две смены 100% ацетона в течение 30 минут каждый.
- Смола Пропитка и леча
- Смешайте маловязкую эпоксидной смолы в одноразовом полиэтиленовую чашку. Добавить 10,0 г диоксида винилциклогексен (ERL 4221) эпоксидного мономера, 6 г диглицидиловый эфир полипропиленгликоля (DER 732) и 26,0 г ноненил янтарного ангидрида (NSA). Тщательно перемешайте вручную с помощью деревянных палочек в течение 2 мин.
- Добавить пятнадцать капель 2-диметиламиноэтанола (DMAE) эпоксидного ускорителя и снова перемешать в течение 2 мин. Позаботьтесь, чтобы полностью смешивать компоненты ERL, DER и NSA перед добавлением ускорителя DMAE.
- Начало смолы пропитывание ткани путем замены 100% ацетона с 1: 1 до смолыацетон в течение 1 ч, а затем заменить 6: 1 смолы в ацетоне в течение 3 ч, и, наконец, 100% смолы в течение ночи.
- Передача ткани в свежую смолу в 8 мм micromoulds. Лечение при температуре 70 ° С в течение ночи. Смола должна быть жесткой, но не хрупкими после отверждения.
3. Ultramicrotomy
- Нож, резка Параметры и Раздел Толщина
- Поместите полутонких алмазный нож в ультрамикротоме и вырезать секции из ткани при толщине 500 нм.
- Поплавок секции на водяной бане позади лезвия ножа. Возьмите секции на предметное стекло и высушить их в течение от 10 до 20 сек , используя конфорку при температуре приблизительно 110 ° С
- Протравить секции с этоксида натрия в течение 20 секунд, а затем смывают со 100% этанолом, затем дистиллированной водой. Пятно с 2% метиленовым синим в 1% буры в течение 20 секунд на плитке, промыть проточной водопроводной водой в течение 5 секунд и сушат на плитке в течение 5 сек. Тогда СТАИп с 1,5% основного фуксина на плитке в течение 5 сек, то сухой на плитке в течение 20 сек.
- Осмотрите с помощью светлого поля световой микроскопии и подтверждают, что опухолевые клетки и области интереса (ROI) присутствуют в разделе.
- Изменение полутонких алмазный нож к ультратонкого алмазного ножа и установить правильный угол ножа и скорость резания в соответствии с рекомендациями производителя ножа.
- Вырезать ультратонких срезов толщиной 90 нм. Обратите внимание на золотую окраску секций при плавающих на водяной бане.
- Stretch и придавить секции махая паров хлороформа с 1 см 2 куска фильтровальной бумаги в течение нескольких миллиметров секций. Будьте осторожны, чтобы не довести хлороформа пропитанной бумаги в контакте с поверхностью воды.
- Ультратонкие Раздел Сетка ,
- Поднимите ультратонких срезов с поверхности воды с помощью тонких бар никеля ТЕМ сетку 300 меш, который был смоченным в разделе adhesivе решение. Найдите разделы на тусклой стороне сетки. Сетки имеют тусклый или матовую поверхность с одной стороны и полированной или блестящей поверхностью на другой стороне. Нет поддержки фильма не требуется. Примечание: Необходимо обрабатывать эти сетки с антимагнитными щипцов, чтобы избежать сетки прилипание к щипцов.
- Подготовьте раздел клея, помещая 20 см клейкой ленты в 5 мл флакон с 2,0 мл ацетона. Cap и встряхнуть флакон, дайте постоять в течение 10 мин, затем снять ленту, оставляя при этом раствор клея.
4. иммунноокрашивания
- Антиген Разоблачение
- Подготовить 1 мл свежего насыщенного метапериодат натрия травильного раствора в дистиллированной воде и использовать его немедленно. Место капельки травильного раствора на чистой поверхности labfilm.
- Поместите полностью сухой сетки с участками вниз на капли раствора метаперйодата натри при комнатной температуре в течение 30 мин. Передача сетки в дистиллированной воде УЦИплеты в течение 60 сек промывки.
- Антитело Инкубационный и QD Probe Этикетировочное
- Выполните все инкубацию и маркировки на капли раствора, помещенных на чистую Parafilm поверхности.
- Поместите сетку на капелькой 0,05 М глицина в PBS в течение 10 минут, чтобы блокировать остаточного альдегида в секции. Удалить блок альдегид кратко промокательной край сетки.
- Поместите сетку на капелькой 1% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 1% BSAC (10%) в PBS в течение 10 мин. Готовят блокирующий раствор путем добавления 10 мкл NGS и 100 мкл BSAC до 890 мкл PBS, чтобы получить конечный объем 1000 мкл.
- Выдержать секции путем размещения по капельке разбавителя антител в течение 10 мин.
- Выполните иммунноокрашивания инкубация с использованием анти-соматостатин поликлональные антитела, разбавленное 1:10 с разбавителем антителом дает концентрацию 3,47 г / л. Примечание: Антитело инкубация осуществляется путем размещения сеток на каплях в течение 1 ч при комнатной TEMPERATЮр во влажной камере.
- Удалить антитела реагента, полученного на стадии 4.2.5 с помощью промокательной край сетки затем моют секции по реагенту в течение 2 × 5 мин.
- Инкубируйте в вторичными антителами (биотинилированным козьим анти-кроличьего поликлонального), разбавленный 1:10 в течение 1 ч при комнатной температуре. Удалить раствор вторичного антитела. Стирать в разбавителе в течение 2 х 5 мин.
- Выдержите в стрептавидином конъюгированных квантовых точек (585 нм), разбавленный 1:10 в течение 1 ч при комнатной температуре. Покрытие с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить освещенность во время инкубации.
- Промыть решетки в свежей дистиллированной воде в течение 2 мин. Промокните края сетки сухой.
5. Флуоресцентная световой микроскопии
- Источник и фильтры Light Кубики
- Используйте 365 нм светоизлучающий диод (LED) подсветку для широкого поля флуоресценции световой микроскопии. Вставьте фильтр куб со следующими характеристиками: (Ex G 365 нм, BS FT 395 и EM LP 420 нм).
Примечание: Этот фильтр куб шпозволяют больным спектры излучения всех размеров квантовых точек, чтобы быть визуализированы одновременно по той же длине волны возбуждения.
- Используйте 365 нм светоизлучающий диод (LED) подсветку для широкого поля флуоресценции световой микроскопии. Вставьте фильтр куб со следующими характеристиками: (Ex G 365 нм, BS FT 395 и EM LP 420 нм).
- Просмотр и визуализации разделов
- Поместите раздел иммуноокрашиванию сетки вниз на предметном стекле в капле воды и накройте покровным стеклом (толщина номер 1.5). С помощью световой микроскопии, чтобы оценить шаблон маркировки, уровень любого неспецифической маркировки, а также установить, что отрицательный контроль очевидны маркировки.
- Определить рентабельность инвестиций по отношению к сетке баров. Finder сетки могут быть полезными для установления координат целевых структур.
- Получение изображений положительной маркировки на секции, используя полный цветной цифровой фотоаппарат с настройки камеры на "FL авто цвета" и "Баланс белого" установлен на 3,200K. Используйте камеру в режиме "Автоматическая экспозиция" с установкой "Гамма" между 0,45 и 1,00, чтобы оптимизировать внешний вид изображений и "Analog Gain" установлен на 1x.Нажмите на значок камеры в программное обеспечение графического интерфейса Zen 2 Lite на "Live", сфокусировать изображение, а затем нажмите кнопку "Привязать", чтобы захватить изображение в Framestore.
- Сохранение изображений в качестве .tif файлов, чтобы избежать сжатия и пикселизация становится очевидной.
- Подготовить распечатку с указанием позиции ROI по отношению к прутьям сетки или других значимых ориентиров ткани. Эти отпечатки будут полезны для последующей навигации секции и повторно нахождение трансформирования с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
- Снимите сетку с горкой, промойте в дистиллированной воде и аккуратно промокните края сухой.
Примечание: Не используйте слишком интенсивное освещение для получения флуоресцентных изображений. Фотостабильность квантовых точек позволяет время получения изображений до нескольких секунд, но будьте осторожны, чтобы не затягивать воздействия, как тушение сигнала QD может произойти примерно через 1 мин в воде. Расширенная или постоянное Фотостабильность получается только тогда, когда QD маркированы секции обезвожены с толуолом иврезанный под покровные согласно спецификациям производителей. Тем не менее, этот процесс будет исключать возможность корреляционного рассмотрения той же секции методом просвечивающей электронной микроскопии.
6. просвечивающей электронной микроскопии
- ТЕМ Настройка и просмотр
- Передача сетки в ПЭМ для исследования с использованием ускоряющем напряжении 100 кВ. Использование низкой кратности приблизительно 1,400X перемещаться по сетке и найти трансформирования, которые коррелируют с видами световой микроскопии. Просмотр кластеров квантовых точек в увеличениях вокруг. 50000
- Соблюдайте индивидуальные КТ при 70,000X увеличении или выше. Обратите внимание на КТ в виде неправильных кристаллических структур с умеренной плотностью электронов.
- обработки изображений
- Используйте цифровую камеру для работы с изображениями ПЭМ. Монохромная 1392 х 1,040 пикселей датчика является адекватным.
- Получение изображений, нажав на значок "Camera" в положение "On" в MICRoscope графический интерфейс программного обеспечения визуализации, затем в положение "Off", чтобы сохранить изображение в Framestore. Примечание: эти операции будут различаться в зависимости от системы микроскопа используется. Используйте камеру в автоматическом режиме экспозиции с установкой "Гамма" 1,00.
- Сохранение изображений в качестве .tif файлов.
7. CLEM обработки изображений
- Обнаружение флуоресцентным ROI методом просвечивающей электронной микроскопии
- Используйте отпечаток от светового микроскопа изображение, чтобы найти соответствующий трансформирования с помощью ПЭМ. Тканевые архитектурные особенности, такие как кровеносные сосуды и просветными структуры могут быть использованы для навигации по секции с помощью ПЭМ.
- Захват изображения соответствующего ROI методом просвечивающей электронной микроскопии.
- CLEM Overlay Изображение
- Убедитесь, что изображение TEM правильно сориентирована световой микроскопии изображения и корректировать расширение каждого так, что та же самая структура рассматривается в каждой модальности имеет тот же размер.
- востокели световой микроскопии и ПЭМ-изображения и отображать их бок о бок или в виде наложений, чтобы выделить ультраструктурные особенности immunolabeled трансформирования.
- Создание накладываемого изображения с помощью Photoshop CS2. Во-первых, увеличить флуоресцентного изображения с тем же увеличением, как малой мощности TEM изображения. Сориентировать оба изображения, а затем вставить их бок о бок на одном холсте.
- Сведите изображение.
- Создание флуоресценции наложение этого составного изображения. Нажмите на кнопку "Rectangular Marquee Tool", выберите флуоресцентного изображения и создать дубликат слоя из него.
- Отрегулируйте "Layer Style / Blending варианты" до 30 - 40% прозрачности.
- Нажмите на кнопку "Move Tool" и перетащите флуоресценция наложения слоя поверх соответствующего ПЭМ изображения. Совместите изображения.
- После достижения выравнивания, "Свести" слои для получения окончательного наложения изображения.
- Используйте "Rectangular Marquee Tool", чтобы выбрать новое наложение изображения Ай скопировать его на новый холст. Сохранить как файл .tiff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Опухолевые соматостатинома образцы, используемые для этого исследования состоит опухолевые клетки, образующие структуры протоков, смешанные с коллагеновой stomal ткани. По флуоресцентной световой микроскопии, отдельные опухолевые клетки, которые содержали обильные секреторных гранул показали положительную маркировку для соматостатина гормона. Ядра появились темные дыры с минимальным неспецифического мечения обнаружению (рисунок 1). При низких увеличениях, переменно интенсивный гранулированный оранжевый флуоресценции наблюдалась в цитоплазме этих хорошо охарактеризованных опухолевых клеток. Оранжевый цвет флуоресценции определяли размер QD используется. Для этого исследования мы использовали 585 нм КТ, которые излучают оранжевый сигнал при возбуждении с 365 нм света.
CLEM анализ той же самой клетке было возможно (рисунок 2). Используя ту же сетку, если смотреть с помощью световой микроскопии для ПЭМ обследование позволило трансформирования быть признаны и имвыдерживается в обеих формах. Та же архитектура ткани по отношению к сетке баров, как показано с помощью световой микроскопии наблюдалось методом просвечивающей электронной микроскопии и используется для навигации. ROI был найден со ссылкой на 20Х световой микроскопии изображения и отмечая особенности ткани по отношению к сетке баров.
ПЭМ показал цитоплазму соматостатина положительных клеток содержат огромное количество круглых гранул различной электронной плотности. Гранулы различного диаметра присутствовали в отдельных клетках и QD плотность иммуномечение над гранулами была также переменной. Верхи данных флуоресценции на ПЭМ изображениях предложил сильная положительная маркировка соответствует гранул , содержащих умеренно электронов плотного материала в пределах ограничивающих везикул мембраны (рисунок 3).
При большем увеличении умеренно электронов плотные гранулы можно увидеть, чтобы интенсивно immunolabeled с QD нанокристаллов ( 
Рисунок 1:. Световой микроскопии Вид ультратонким секции с соматостатинома клетками маркировано для соматостатина Гормон Раздел ультратонкий был установлен на ТЕМ сетке, immunolabeled, затем помещают на предметное стекло в воде под покровным. Соматостатинома клетки (стрелки) показывают круглые ядра и обильные соматостатин гормон положительные гранулы в цитоплазме. Значительное изменение плотности маркировки наблюдается в популяции соматостатинома клеток (200X). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 2: CLEM Composite View из раздела ультратонкой Через соматостатина OMA ткани Маркированный для соматостатина A) соматостатинома клеток путем Widefield флуоресцентной микроскопии (120x);. B) Те же клетки , окружающие просвет (L) видно методом просвечивающей электронной микроскопии при небольшом увеличении (570X); C) Повышенная мощность вид ТЕМ показывает ярко флуоресцентный клетку от ( а) с ядром (N) (2,000X);. D) Деталь цитоплазматических гранул , показывая интенсивное мечение с квантовыми точками над аморфного материала , содержащегося в гранулах (звездочка) (20,000X) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры , 
Рисунок 3:. CLEM Перекрытие изображение прозрачного изображения из флуоресцентной микроскопии , смешанного с помощью ТЭМ изображение соответствующей зоны (2,000X)./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 4: просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) Вид соматостатина Положительный гранул от соматостатинома цитоплазме клеток Соматостатин гормона положительных гранул в цитоплазме локализации QD (стрелки) показывают более аморфными содержание в основном в пределах ограничивающей мембраны.. Ближайшие цитоплазматический фон чистый с несколькими QD зондов очевидна. Некоторые неспецифическое ядерная маркировка рассматривается. Везикулы мембрана , окружающая гранулы (стрелки) до сих пор видны (50000). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование продемонстрировало потенциальную полезность в качестве универсальных квантовых точек зондов для исследования Клем. 585 нм наночастицы, используемые QD показали яркую и стабильную флуоресценцию при просмотре Widefield световой микроскопии и были легко наблюдать с помощью ПЭМ. Предыдущее исследование одним из авторов показал также КТ быть пригодны для сверхвысокого разрешения световой микроскопии 7. Их светостойкость было особенно полезно в течение длительных периодов просмотра и длительных экспозиций изображений. КТ также может быть использован для мультиплексного иммуногистохимии с разными размерами зондов одновременно излучающих различные цветные спектры при той же длине волны возбуждения.
Квантовых точек обладают достаточным атомным весом, чтобы быть визуализированы с помощью ТЕМ, но это было установлено, что вызов в зависимости от размера наночастиц, используемых. Для световой микроскопии, мы обнаружили, что 525 нм квантовые точки (зеленый) производят меньше фонового маркировки по сравнению с большей 585 нм (оранжевый) и 655 нм (красный) форм, Тем не менее, мы решили использовать большее 585 нм QD в настоящем исследовании, чтобы обеспечить более удобную визуализацию маркировки методом просвечивающей электронной микроскопии. Чем меньше 525 нм КТ имеют размеры около 3 - 5 нм, тогда как более крупные формы 585 нм примерно 6 - 8 нм и 655 нм приблизительно 8 КТ - 10 нм. 585 нм обладал КТ нерегулярный кристаллическую форму с умеренной плотностью электронов при наблюдении с помощью ПЭМ. Они не были, как круглые или как электрон плотной, как более традиционных коллоидного золота иммуноцитохимических зондов. Тем не менее, квантовые точки , как было показано , чтобы получить до 10 раз более эффективной , чем маркировки коллоидного золота 9 и мы подтвердили здесь , что высокая плотность маркировки была легко достижима, в частности , с помощью зонда системой связывания биотин-стрептавидин. CdSe квантовых точек обладают также характерную элементарную подпись, которая может позволить обнаружение и отображение с помощью энергодисперсионным спектроскопии (EDS), спектроскопии потерь энергии электронов (угрями) или энергии фильтруется просвечивающей электронной микроскопии (EFTEM) 8. Системы передачи с помощью сканирующей электронной микроскопии (STEM) также могут быть использованы из - за их эксплуатации Z-контраста или атомным номером изображения , которое будет способствовать повышению контраста между наночастицами и биологического материала с более низким атомным номером 14. Большая площадь отображения и визуализации 3D информации распределения 15 с полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии также должно быть возможно.
Важным шагом в нашем методе является процедура антиген разоблачение или секции травления. Мы используем однократное лечение с метапериодат натрия в течение 30 мин при комнатной температуре. Дольше этого и агрегацией структур или потери определения мембраны может произойти. Другие используют двухступенчатый метод с участием deplasticizing с метоксида натрия , а затем де-osmication с периодатом натрия и это может обеспечить больший контроль над процессом , при необходимости 16.
CLEM было возможно с помощью световой микроскопии для CAREFULLу входа структурные особенности трансформирования по отношению к сетке баров. То же сетка затем помещается в ТЭМ и ориентированы таким образом, что сетка бары и достопримечательности соответствуют световой микроскопии зрения. Низкий коэффициент увеличения приблизительно 1,400X является наиболее подходящим для этого. Тканевые структуры, такие как протоковых образований и моделей ядер оказались наиболее полезными для повторного обнаружения трансформирования в ткани. Тем не менее, точная корреляция с таким же разрешением клеток может быть сложной задачей. Уход должны были быть приняты с ориентацией сетки, чтобы отразить ту же ориентацию видно с помощью световой микроскопии. Мы достигли достаточно точную внутриклеточную пространственную корреляцию между условиями с наложения изображений, полученных с помощью Photoshop. Флуоресценции накладываемое изображение смешивалось с ТЕМ фоновое изображение, однако некоторые перекосы обнаруживался. Это может быть из-за различных систем формирования изображений, используемых каждым модальности или к радиационному повреждению наших неподдерживаемых ультратонкие срезы в ПЭМ. Автоматизированные системы для улORing координаты трансформирования видны с помощью световой микроскопии и передачи их в электронный микроскоп теперь продаваемого и значительно упростит эту процедуру.
Полезность подхода CLEM мы представили для иммуноцитохимических исследований является необходимостью ограниченного способа получения образца , используемого, например, металл окрашивание тяжелых и эпоксидной смолы вложение неизбежно маскирования доступные эпитопы. Тем не менее, этот метод действительно позволяет значительное преимущество получения флуоресцентного и просвечивающего электронного данных из образцов патологии. Получение структурной и функциональной информации из различных модальностей микроскопии с использованием одного образца является то, что в целом не доступны для изучения клеток патологии человека и ткани, которые были обработаны в первую очередь для диагностических целей.
Можно было бы ожидать, что более чувствительным иммуноцитохимическое локализации может быть получена из сублимационной фиксации подхода, а не протокола ЪAsed по химической фиксации. Утверждение принципов cryofixation 17 для Biobanking человеческой ткани с последующим cryoultramicrotomy и при комнатной температуре на основе квантовых точек иммунноокрашивания как в классической технике Tokuyasu 18, 19 будет способствовать чувствительных и специфичных корреляционного Иммуноцитохимическая исследования патогенеза заболевания человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
