Abstract
Zoogdiercelcultuur in monolagen wordt algemeen gebruikt om diverse fysiologische en moleculaire processen te bestuderen. Echter, deze benadering van de groeiende cellen te bestuderen genereert vaak ongewenste artefacten. Daarom celkweek in een driedimensionale (3D) omgeving, vaak met behulp van extracellulaire matrixcomponenten, zich tot een interessant alternatief vanwege de grote gelijkenis met de natuurlijke in vivo weefsel of orgaan. We ontwikkelden een 3D celkweek systeem met twee compartimenten, namelijk (i) een centraal compartiment met kanker cellen ingebed in een collageen gel werkt als een pseudo-primaire macrospherical tumor en (ii) een perifere celvrije compartiment gemaakt van een fibrine gel, dat wil zeggen een extracellulaire matrix component verschilt van die in het centrum, die kankercellen kunnen migreren (invasie vooraan) en / of vormen microsferische tumoren die secundaire of satelliet tumoren. De vorming van satelliet tumoren in het perifere compartimentopvallend gecorreleerd aan de bekende agressiviteit metastatische oorsprong van de natieve tumorcellen die deze 3D kweeksysteem uniek. Deze celkweek benadering kan worden gesteld kankercel invasiviteit en motiliteit, cel-extracellulaire matrix interacties als een methode om antikankergeneesmiddel eigenschappen evaluatie uitgevoerd.
Introduction
De fundamenteel biomedische kenmerken van kankercel invasie / migratie en daaropvolgende metastase inrichting is het onderwerp van intens onderzoek 1,2. Metastase is de ultieme fase van kanker en de klinische behandeling blijft ongrijpbaar. Een beter begrip van metastase op cellulair en moleculair niveau zal de ontwikkeling van efficiëntere therapieën 3 mogelijk.
Verschillende eigenschappen van metastatische cellen kan worden verkend in vitro 4 met inbegrip van hun stemness en potentieel om een overgang staat (bv epithelioid-mesenchymale transitie) te verwerven om te migreren en binnenvallen in en uit de primaire tumor 5. Echter, de in vitro beoordeling van de invasie / metastasering processen een uitdaging sinds het vrijwel exclusief de bijdrage van het bloed / lymfatische circulatie. Organotypische culturen die tumor fragmenten insluiten in collageen gels hebben Previously gebruikt om kanker agressiviteit controleren. Hoewel de complexiteit van tumoren wordt bewaard (bijvoorbeeld de aanwezigheid van niet-kankercellen), tumorfragmenten blootgesteld aan beperkte diffusie medium, steekproeven variatie, en een overmatige groei van bindweefselcellen 6. Een alternatieve werkwijze bestaat erin groeiende kanker cellen in componenten van de extracellulaire matrix (ECM), die de driedimensionale (3D) celomgeving nabootst. De proliferatie van borstkankercellijnen in een collageen gel en / of basismembraan-afgeleide matrix onder de meest bestudeerde voorbeelden van 3D celkweek. Door het gebruik van specifieke 3D celcultuur-omgevingen, kan het ongeorganiseerd assemblage waargenomen voor borstkankercellen gekweekt onder standaard omstandigheden worden omgekeerd om de spontane vorming van de melkklieren acini en buisvormige structuren 7-10. Bovendien is de vorming van multicellulaire bolvormige tumoren afgeleid van adenocarcinoom cellen bijeen met verschillende technieken (bijvoorbeeld, opknoping druppels, drijvende bolletjes, agar inbedding) Nu vormt de meest gebruikte 3D celcultuur assay 11-13. Maar deze assay beperkt door de beperkte set kankercellijnen die sferoïden kunnen vormen en de korte periode om cellen te bestuderen in deze voorwaarden.
In dit gevisualiseerd techniek we hierin introduceren geavanceerde 3D celkweektest wanneer kankercellen plaats zijn ingebed in een collageengel om de in vitro vorming van een pseudo-primaire tumor die als alternatief kan worden bekleed met een kelder membraan-afgeleide matrix mogelijk. Eenmaal gevormd wordt de pseudo-primaire tumor dan ingeklemd in een acellulair matrix (fibrine gel in het onderhavige geval), waardoor de kankercellen aan het grensvlak tussen de twee compartimenten matrix kan passeren (zie figuur 1). Interessant secundaire tumor-achtige structuren afkomstig van de pseudo-primaire tumor met agressieve kankercellen verschijnen in hetfibrinegel. 3D dergelijk teeltsysteem biedt de vereiste flexibiliteit te onderzoeken, bijvoorbeeld antikankergeneesmiddelen, genexpressie en cel-cel en / of cel-ECM interacties 14-16.
Figuur 1:.. Overzicht van de methode Schematisch overzicht van de methode om de 3D-celcultuur systeem als een model voor kanker studies genereren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Geen ethiek overweging sinds dierlijke en menselijke kankercellen werden gekocht of welwillend ter beschikking gesteld aan ons.
1. Het maken van Collageen pluggen (Pseudo-primaire tumor)
- Bereid een collageen dispersie. Type I collageen uit rattenstaart pezen (RTT) kan zowel worden gewonnen en gesteriliseerd zoals eerder gemeld 17, of direct te bestellen. Verspreiden gevriesdroogde RTT collageen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N azijnzuur) met behulp van een blender (high speed-instelling; vijf runs 2 min) voor een uniforme menging.
- Harvest (trypsine-EDTA, meestal) en gebruik trypan blauw exclusie voor het tellen van levensvatbare cellen met een hemocytometer. Stel de gewenste celdichtheid (5 x 10 4 cellen per plug).
- Bereid alle oplossingen (NaOH, foetaal runderserum, DMEM 5x, NaHCO3) afzonderlijk (tabel 1) onder steriele omstandigheden en houden op ijs gekoeld. Opmerking: De volgorde van toevoeging van de verschillende oplossingen is belangrijk om osmotische schokken of zuur in cellen voorkomen.
- Uitvoeren cel dispersie (1,25 x 10 6 cellen) in de uiteindelijke collageen oplossing (5 ml) zo snel mogelijk. Meng goed (door en neer te pipetteren) terwijl het vermijden van luchtbellen, en dan snel distribueren 200 ul van de kant-en-klare oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voorzichtig staking van de multi-well plaat op het werkgebied oppervlak van de celkweek kap om luchtbellen te verwijderen en om de oplossing gelijkmatig verdeeld in de putten.
- Na het bijvullen alle putjes (deze stap duurt ongeveer 15-20 minuten per 96-well plaat), opslaan in de incubator.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C van 2 uur 's nachts. Collageen gelering (dwz fibrillogenese) plaatsvindt binnen 30 minuten. Voeg cultuurmedium (100 pl / putje) aan de kweek van een nacht incuberen voeren.
2. Eerste laag van fibrine gel
- Fibrinogeen Solution Voorbereiding.
LET OP: De dezelfde partij van fibrine gel moet idealiter worden gebruikt voor meer reproduceerbare results, fibrine gelvorming kan variëren tussen de verschillende batches van commerciële gevriesdroogde fibrinogeen.- Gebruik altijd een vers bereide fibrinogeen-oplossing. Breng het gevriesdroogde fibrinogeen op kamertemperatuur voor het openen van het flesje te hydrateren kristalvorming te voorkomen.
- Geleidelijk los het fibrinogeen in voorverwarmde (37 ° C) Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met Ca2 + / Mg2 + in een werkende concentratie van 3 mg / ml (eens het bereiden van een 15% overmaat van de minimale vereiste eindvolume : bijvoorbeeld 17,25 mg in 5,75 ml van een 5 ml oplossing).
- Add voorverwarmde HBSS druppelsgewijs bij eerste fibrinogeenfragmenten solubiliseren. Breek grotere fragmenten met een spatel in de beker. Schud de beker af en toe mengen te vergemakkelijken. Gebruik geen opruier plaat tijdens de procedure. Los het resterende poeder door pipetteren de schorsing op en neer.
- Houd de fibrinogeen oplossing lauwe terwijl SteriLIZING de oplossing te leiden door een 0,22 urn filter. Opmerking: Als de HBSS is niet warm genoeg of fibrinogeen niet volledig is opgelost, kan de oplossing van het filter verstoppen. Eventueel vervangen filter of twee keer, waarbij het fibrinogeen concentratie kan verlagen en daardoor fibrinestolsel stijfheid.
- Suspendeer de cellen van belang (bijvoorbeeld endotheelcellen) in kant-en-klare fibrinogeenoplossing tijdens het instellen van het eindvolume, als alternatieve procedure.
- De voorbereiding van de trombine Solutions.
- Bereid een voorraadoplossing in DDH 2 O (50 NIH eenheden / ml), vervolgens gesteriliseerd met behulp van een 0,22 pm filter.
- Gebruik een fibrinogeen / trombine verhouding ≥1: 0,0075 (v / v) om de fibrine gel genereren.
- Het genereren van de fibrine Gel.
- Houd de steriele fibrinogeen en trombine voorraad oplossingen op ijs tijdens de volgende stappen. De fibrinegelen mogen vormen in 24-well platen.
- Onmiddellijk overlay the oppervlak van elk putje met de fibrinogeen-oplossing (200 ul / putje) met vermijding luchtbelvorming. Werkwijze 6 putjes tegelijk.
- Zodra de fibrinogeenoplossing het oppervlak van de putjes volledig bedekt, tilt de plaat bij 45 ° en voeg 1,5 pl trombine oplossing van de eerste put door laten vallen van de trombine in het midden van de put, en dan voorzichtig zwenken de plaat horizontaal voor 1-2 sec.
- Laat de plaat in een stabiele positie onder de laminaire stroming kap (5-10 min) tot de gelering / stollingsproces heeft gedaan (NB: het polymerisatieproces mogen niet worden gestoord, bijvoorbeeld door het transporteren van de plaat naar de incubator).
- Zodra de eerste zes putten polymeriseren, herhaal dezelfde volgorde (dat wil zeggen de 3 voorgaande stappen) voor de komende zes putten, totdat alle putten zijn verwerkt.
3. De tweede laag van fibrine Gel en ingeklemd Collageen Plug
- KeuzeA: (Met behulp van de Collagen Plug Direct).
- Zorg ervoor dat de eerste laag van fibrine gel in alle putjes gepolymeriseerd door subtiel het kantelen van de plaat. Plaats de 96-well plaat met de collageengel pluggen aan de zijde van de 24-well plaat (die de fibrine gels) overdracht van de collageen pluggen verlichten.
- Één druppel HBSS in elk putje van de plaat dat het collageenmateriaal pluggen.
- Verwijder elke collageen stekker uit de put met een dunne naald bevestigd aan een injectiespuit (gebruikt als een handvat) of met behulp van een micro-lepel (zie video). Transfer elk collageen plug op de eerste fibrine gel laag met behulp van een of twee micro-lepels, terwijl ervoor te zorgen dat het collageen plug goed is gecentreerd in de put en dat steriliteit is goed onderhouden.
- Overlay de eerder gevormde fibrine gel met de tweede laag fibrinogeenoplossing (300 gl / putje) en het trombine te voeren als beschreven in 2.3, waarbij minimaal 1:. 0,0075 ratio en een reeks van zes putjes tegelijk </ Li>
- Optie B (Coating de Collageen Plug met een dun laagje van Growth Factor-gereduceerde Basement Membrane (GFRBM)).
- Koel alle bereide oplossingen en instrumenten vooraf en bewaar ze bij 4 ° C of op ijs (bijvoorbeeld pipetten, tips, reageerbuisjes) tijdens hanteren aangezien ingevroren aliquots van GFRBM zijn zeer gevoelig voor oververhitting frequentie tijdens ontdooien (de instructies van de fabrikant) .
- Na verwijdering uit de putjes, genieten van elk collageen plug gedurende 2 minuten in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs met 100 ul van een pure GRFBM oplossing.
- Transfer elk gecoat plug op de eerste fibrine laag en tegelijkertijd is het goed gecentreerd, zoals eerder beschreven. Incubeer de plug-bevattende platen bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de GRFBM vorming van een gel. Voeg de tweede fibrine laag als in stap 3.1.4.
4. celkweekmedium Voorwaarden
- Vul elk putje kweekmedium (400 ui). De kweekmedia en supplementen worden geselecteerd op basis van de cellijn en de testomstandigheden.
- aprotinine, een antifibrinolytisch agent kweekmedium voegen tot een eindconcentratie van 100 kallikreïneremmer eenheden (KIE) / ml.
OPMERKING: Bewaar de platen in een celkweek incubator onder de voor de cellijn geteste omstandigheden. - Vullen kweken met vers medium om de dag of volgens het testschema en voeg aprotinine. Voor het toevoegen vers medium, enigszins kantelt de plaat (een 30-35 ° hoek) en hellen de pipet tegen de zijkant van de put terwijl voorzichtig afzuigen het geconditioneerde medium voortdurend onder toezicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals eerder vermeld, een interessant kenmerk van deze 3D celkweek test is dat kankercellen niet alleen kunnen migreren van het collageen stekker aan de aangrenzende fibrinegel, maar het ook tot secundaire tumoren (bijvoorbeeld satelliet tumor-achtige structuur). Dit kan direct worden waargenomen met een omgekeerde fase contrast microscoop bij lage en hoge vergroting door de gel dikte, vooral met een lange werkafstand condensor (figuur 2). Met deze 3D celkweek werkwijze kan het gedrag van bekende metastatische cellen direct te vergelijken met die in niet-metastatische cellen, zoals herhaaldelijk aangetoond met verschillende experimentele opstellingen 15. Zo worden talrijke satelliet tumoren gevonden willekeurig verspreid in de fibrine gel met metastatische cellijn B16F10 terwijl slechts weinig kleine satelliet tumoren kan dus worden gedetecteerd met de niet-metastatische tegenhanger, B16F0 cellijn (Figuur 2).
Figuur 2:. Gedrag van muismelanoom B16F10 (A) en B16F0 (B) cellen in de 3D celkweeksysteem De B16F10 en B16F0 cellijnen zijn bekend metastatische en zwak metastatische bepaald op resp. Een bovenaanzicht van de samengestelde-gel na 15 dagen in kweek in 24-well plaat. Het collageen plug (*) grenst aan een fibrine gellaag waarbij cellen gemigreerd (pijlen) en vormden satelliet tumoren gezien bij hogere vergroting. Heel handig, deze cellijnen drukken een hoog niveau van melanine dat zorgt voor directe visualisatie (dwz zonder vlekken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De vorm van de migratie voorste en satelliet tumoren kan variëren als functie van cellijn kenmerken. Bijvoorbeeld, het muizen mammacarcinoom 4T07 cellen, die slecht metastatisch zijn slechts zeer lokaal invasief zijn, een migratie voorste radiaal uitstrekt in de fibrine gel (Figuur 3A). Na 14 dagen kweken werden de cellen van het trekkende voorzijde getrokken stellar-vormige structuren gelijkenis vertonen borstklier structuren (figuur 3B-D) te vormen.
Figuur 3: Muis borstklier carcinoom 4T07 Cells. Deze cellen vertonen een sterk vermogen om te migreren in de fibrine gel (A). De stippellijn bakent het collageen stekker en de pijlen geven de richting van de migratie front. De cellen gelijkmatig binnenvallen de fibrine matrix (A), en goed georganiseerde, stellaire vorm buisvormige structuren kunnen in 3D worden waargenomen (B eend C). Bekeken onder fase contrast microscopie. (A - C) en histologische secties gekleurd met hematoxyline en eosine (D) getoond Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De cel structuren waargenomen met deze 3D kweeksysteem, met name de satelliet tumoren, kan worden gekwantificeerd door vlakke projectie na kleuring van de gels met een methyleenblauwoplossing 16 zoals eerder aangegeven. Kleuring gelmonsters met Hoechst 33258 in verschillende stadia van de celkweek maakt de celkernen onder epifluorescentie microscopie omgekeerd (Figuur 4) te visualiseren.
Figuur 4: Hormoon-Responsive Breast Cancer Cells. Human BreastKanker MCF-7 cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties van Tamoxifen. Satellite tumoren fibrine gels (bovenste rij) waargenomen door fasecontrast microscopie. DNA van het collageen gels (met vermelding van de aanwezigheid van cellen in pseudo-primaire tumoren) (onderste rij), werd gekleurd met Hoechst 33258 en gevisualiseerd met behulp van epifluorescentie microscopie. Zoals verwacht, tamoxifen geïnduceerde DNA fragmentatie als gevolg van apoptose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| reagentia | Volume |
| DMEM 5x (geen bicarbonaat) Bereid uit poeder | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 gl |
| ddH2O | 100 gl |
| Bewaar deze oplossing op ijs | |
| celsuspensie | 880 pl |
| Meng goed op ijs en tenslotte snel toe te voegen: | |
| RTT Collageen (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Totale volume | 5 ml |
Tabel 1:. Collageen Stoppen benodigde reagentia en bereiding van een collageenoplossing 18-19 pluggen. Meng goed onmiddellijk na toevoeging van het collageen (door op en neer geheel om te keren), terwijl het vermijden van luchtbellen, en vervolgens onmiddellijk distribueren 200 ui aan elk putje.
| Stappen | | mogelijke redenen | Oplossingen | |
| Stap 1. collageen plug | Luchtbellen | Ongepast pipetteren * | Meng goed terwijl het vermijden van overmatig bubbels. |
| Teken elk 200 ui met pipet zuiger helemaal naar beneden en laat slechts 200 pi (reverse pipetteren). * | |||
| Collageen plug contractie | Collageen plug krimpt met bepaalde cellijnen, met name wanneer gedurende de nacht. | Controleer of induceren collageencontractie voordat experiment. Het wordt aanbevolen om krimp te controleren gedurende een paar dagen. Anders kan pluggen contract in het ingeklemd gel. | |
| Gelering niet optreedt | Bekijk reagentia voor versheid, molariteit, pH, enz.); zorg ervoor dat er geen reagens is weggelaten. | Begin opnieuw vanaf het begininning. | |
| Stap 2. Eerste laag fibrinegel | Luchtbellen | Zelfde opmerkingen *; moet de praktijk. | Dezelfde oplossing. * Luchtbellen in de fibrinegel blijven maar verdwijnen meestal tijd bij 37 ° C. |
| Gelering niet optreedt | Verkeerde hoeveelheid van fibrinogeen gebruikt; check trombine concentratie of degradatie. | Begin opnieuw vanaf het begin. | |
| Stel dat de trombine-oplossing is onvoldoende; lichte verhoging van de concentratie en / of het volume van trombine (bijvoorbeeld tweemaal). | |||
| Resterende vloeistoffase na gelering | Fibrinogeenoplossing en trombine niet goed gemengd. | Begin opnieuw vanaf het begin. | |
| Fibrine is niet homogeen (dwz fibrillaire structuren, agglomeraten) | Trombine onvoldoende verspreid in de gel; exovermatige of onvoldoende agitatie | oefening nodig hebben; opnieuw beginnen vanaf het begin. | |
| Stap 3. Sandwich / 2 e fibrine laag | Zelfde opmerkingen als in stap 2. | ||
| Collageen plug wordt snel (enkele uren), omringd door lege gebieden in fibrine | Fibrine heeft onvoldoende gepolymeriseerd in contact met collageengel | Begin opnieuw vanaf begin | |
| Collageen stekkers kan progressief zijn (dagen-weken), omringd door lege gebieden in fibrine | Lokale lysis; | Als het wordt beperkt tot een paar plaatsen rond de stekker, kan het experiment gaan. Zou overwegen om te beginnen vanaf het begin. Kan het gevolg zijn cellen die overmatige hoeveelheid plasminogeenactivator. | |
| Vergeet niet de antifibrinolytic agent! | |||
| Stap 4 en 5. Cell cultuur en follow-up | fibrinolyse | Probleem met de antifibrinolytic middel (degradatie, suboptimale dosis, enz.). | Als uitgebreide satelliet tumoren of invasie, verhoging van de dosis van antifibrinolytic middel. |
| verzuring | Overmatige celgroei. | Verander celkweekmedium vaker. | |
Tabel 2: Problemen Mogelijke problemen en voorgestelde oplossingen..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als belangrijke technische voetnoot, is het essentieel dat geen ruimte bij het grensvlak tussen de centrale en perifere gelen. Anders kan het het vermogen van de cellen om te migreren / binnenvallen fibrinegel verminderen. Een ruimte tussen het collageen en fibrine gels kunnen gedurende de eerste 24 uur van de cultuur vormen indien trombine niet correct werd verdund. Het is ook mogelijk dat de cellijn getest kan de collageengel tot krimpen tijdens kweken, waarbij een relatief grote ruimte waardoor vormen tussen beide gels. Dit is vooral verwacht wanneer stromale cellen worden gemengd in de collageengel met kankercellen door myofibroblast-achtige activiteit 18. Om dit artefact te vermijden, moet het collageen plug worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende langere tijd (≥48 hr ) gel contractie vóór het monteren van de fibrine sandwich induceren.
Een probleem ook ondervonden met de test de aanwezigheidvan waarneembare fibrine fibrillen of agglomeraten. Dit geeft een helder in plaats van doorzichtig aspect aan de fibrine-gel, die data-interpretatie bemoeilijkt door verstoring van de kankercel trekroutes. Dergelijke problemen kunnen ontstaan door onvoldoende of overmatig schudden van de fibrinogeen-oplossing tijdens de polymerisatie in de cultuur platen. Het kan ook worden veroorzaakt door de onjuiste toevoeging van trombine in de fibrinogeenoplossing (stap 2,3). Een onjuist gevormd of bewolkt fibrine gel kan niet eens worden bevestigd gestold. Collageen of fibrine gels kunnen luchtbellen die in de meeste gevallen zullen spontaan vrijgelaten na enkele dagen in de incubator bevatten; niettemin goede pipetteren minimaliseert hun optreden. Aanbevolen wordt een anti-fibrinolytisch middel voeren bij het begin van de celkweek periode. Fibrinolyse kan optreden na een lange periode van celkweek door cellulaire activiteit en activatie van proteolytische enzymen (bijv plasminogeenactivator) binnen de collagen plug en de satelliet tumoren, afhankelijk van het type kankercel en de agressiviteit 19 .De afgifte van het collageen stekker uit het gedegradeerde fibrine gel en celhechting aan de bodem van de platen twee gevolgen van overmatige fibrinolyse (zie tabel oplossen 2). Een beperking van deze techniek is de dikte van de fibrine gel, die het moeilijk maken om cellen nemen door het gehele gel. Het gebruik van een microscoop met een lange werkafstand condensor helpt om deze beperking te omzeilen en cellen langs de gehele z-as te controleren. Of confocale microscopie intravitale kan ook een alternatief voor de cellen zichtbaar in de fibrine gel.
Een van de belangrijkste doelen voor de ontwikkeling van deze 3D celkweekmodel zou een extracellulaire matrix compartiment waardoor kankercellen vrij kunnen migreren en ontwikkelen. Fibrine werd gekozen vanwege zijn aanwezigheid in tumoren,die verschuldigd toenemende vasculaire permeabiliteit veroorzaakt door ontsteking, necrose en gewijzigde angiogenese, en aangezien fibrine ook bekend is tumorcelinvasie 20,21 vergemakkelijken. De interface tussen de twee compartimenten weer veel belang het bootst de productie van nieuwe ondersteunende matrix, zoals fibrine, in tumoren. Bovendien, zuurstof en voedingsstoffen diffusie, en op langere termijn, pH stabiliteit, werken mogelijk verstoord bij het collageen compartiment ten opzichte van de perifere fibrine compartiment waarin diffusie wordt vergemakkelijkt. Vanwege het grote aantal kankercellen aanvankelijk geaggregeerd centrale collageen plug, zijn tekenen van necrose / apoptose binnen de primaire tumor tijdens kweek simuleert het fenomeen waargenomen tijdens de groei van primaire tumoren bij patiënten 22. Bovendien wordt de vorming van tumoren satelliet opmerkelijk verband met de agressiviteit van kankercellen en hun metastatische gedrag. Afhankelijk van de cellijn en het type of experiment, de incubatietijd die nodig is voor het waarnemen relevante metastatische processen kunnen zo lang zijn als 30 dagen. Dit is meestal langer dan bij andere 3D assays, maar de toegevoegde vertraging brengt het voordeel van het bestuderen van een model representatiever in situ tumoren.
Het is algemeen bekend dat cellen gekweekt in 3D cultuurmodellen tonen verschillen in cell signaling en genexpressie vergeleken met monolaagcelkweken 5,23. Het kweken van kankercellen in 3D ook van invloed op hun gevoeligheid voor chemotherapeutische middelen 24-26. Een belangrijk en aantrekkelijk kenmerk van deze 3D celcultuurmodel ligt in de mogelijkheid om de ECM concentratie en derhalve de stijfheid van de gel, die van belang kunnen zijn die aan het biomechanische eigenschappen van de cel-cel en cel-ECM wijzigen interacties, alsmede het effect van matrix onroerend goed invasie / migratieprocessen 27. De 3D-celkweek test hier gepresenteerde kan worden aangepasted verschillende instellingen en / of experimentele omstandigheden aan te passen. Bijvoorbeeld, kan de test worden opgeschaald naar studies die een groot aantal cellen is ingericht; verdubbeling van de hoeveelheid materiaal en het aantal cellen, collageen pluggen worden bereid in een 48-well plaat en in lagen aangebracht op een fibrine gel in een 6-wells plaat. Anderzijds kan het moeilijk zijn om het kweeksysteem voor high-throughput studies en metingen door inconsistente homogeniteit van de fibrinegel miniaturiseren.
De introductie van niet-kankerachtige cellen in een van de twee compartimenten gel kunnen het gedrag van de kankercellen te wijzigen. Zo wordt de vorming van tumoren satelliet verergerd wanneer de prostaatkankercellijn PC3 gemengd met fibroblasten en endotheelcellen 14. Als alternatief kan fluorescentie-gemerkt cellijnen in de gel compartimenten worden ingevoerd om cel-cel-interacties te onderzoeken en / of om de cellen te volgen tijdens de kweekperiode. Bovendien, histological secties kunnen worden opgesteld nadat gel fixatie; echter, de kwaliteit van de immunohistochemie resultaten variëren tussen antilichamen aangezien kruisreacties met fibrine kunnen optreden. Routine kleuring van histologische secties zoals met hematoxyline en eosine (H & E) kan celorganisatie in de gel matrices (figuur 3D) te geven.
Het is relatief eenvoudig om de collageen stekker uit het fibrine gel te verwijderen (bijvoorbeeld door het uittrekken van de stekker met een glazen pipet). Aldus kunnen cellen en satelliet tumoren in de fibrinegel afzonderlijk gekweekt van die in het collageen plug. Cellen van de satelliet kolonies kunnen worden geoogst door extractie van de kolonies met chirurgische schaar of een scalpel en groeien ze in kweekmedium zonder aprotinine om vrije cellen van de fibrine gel. Verzamelen van cellen uit de verschillende compartimenten van de samengestelde gel kan diverse verdere studies, met inbegrip van gen- en eiwitexpressie analyse mogelijk. Het kanook worden gebruikt om celpopulaties met agressieve fenotypes isoleren verdere in vitro of in vivo studies. Zo werd deze 3D cultuur model dat wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij melanoom metastase 16 identificeren. Alle genoemde representatieve toepassingen duidelijk de flexibiliteit die een bi-compartimenten 3D celcultuur systeem welke cel co-kweek kan worden uitgevoerd.
Concluderend, het ontwerp van onze 3D teeltsysteem is flexibel en kan nieuwe mogelijkheden bieden voor biologische en moleculaire gebeurtenissen tijdens kankercel apoptose, migratie en metastase en voor anti-drug evaluatie onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M.
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
