Abstract
Däggdjurscellkultur i monolager används i stor utsträckning för att studera olika fysiologiska och molekylära processer. Men denna metod för att studera växande celler genererar ofta oönskade artefakter. Därför, cellodling i en tredimensionell (3D) miljö, ofta med hjälp av extracellulära matriskomponenter, framträdde som ett intressant alternativ på grund av dess nära likhet med den nativa in vivo vävnad eller ett organ. Vi utvecklat en 3D cellodlingssystem med användning av två avdelningar, nämligen (i) en central avdelning innehållande cancerceller inbäddade i en kollagengel som verkar som en pseudo-primär macrospherical tumör och (ii) en perifer cellfri fack tillverkat av ett fibrin gel, dvs en extracellulär matriskomponent som skiljer sig från den som används i centrum, där cancerceller kan migrera (invasion fram) och / eller bilda mikrosfäriska tumörer representerar sekundära eller satellit tumörer. Bildandet av tumörer satellit i det perifera utrymmet äranmärkningsvärt korrelerad med kända aggressivitet eller metastaserad ursprung infödda tumörceller, vilket gör denna 3D odlingssystem unik. kan anses denna cellkultur för att bedöma cancercell invasivitet och motilitet, cell-extracellulär matrix-interaktioner och som en metod för att utvärdera anticancerläkemedel egenskaper.
Introduction
Undersöka de grundläggande och biomedicinska egenskaper cancercellinvasion / migration och efterföljande metastas etablering är föremål för en intensiv forskning 1,2. Metastas är slutskedet av cancer och dess kliniska hanteringen förblir gäckande. En bättre förståelse av metastaser på cellulär och molekylär nivå gör det möjligt att utveckla effektivare terapier 3.
Flera egenskaper hos metastaserande celler kan utforskas in vitro fyra inklusive deras stemness och potential att förvärva ett övergångstillstånd (t.ex. epithelioid-mesenkymala övergång) att migrera och invadera inom och från den primära tumören 5. Emellertid har bedömningen av invasion / metastaser processer in vitro varit en utmaning eftersom det praktiskt taget utesluter bidrag blod / lymfcirkulationen. Organotypic kulturer som bädda tumörfragment i kollagengeler har previously använts för att övervaka cancer aggressivitet. Även om komplexiteten av tumörer bevaras (t.ex. närvaron av icke-cancerceller), tumörfragment utsätts för begränsad medel diffusion, till provtagningsvariation och för att en överväxt av stromaceller 6. En alternativ metod består i att odla cancerceller inom komponenter av den extracellulära matrisen (ECM), som härmar den tredimensionella (3D) cellomgivningen. Spridningen av bröstcancercellinjer i en kollagengel och / eller ett basalmembran-härledda matrisen är bland de bäst karakteriserade exemplen på 3D cellodling. Genom att använda specifika 3D cellodlingsmiljöer kan oorganiserade enheten observerats för bröstcancerceller odlade under normala förhållanden återföras till det spontana bildandet av bröst acini och rörstrukturer 7-10. Vidare, bildandet av multicellulära tumör sfäroider härledda från adenokarcinom cancerceller saml med användning av olika tekniker (t.ex. hängande droppar, flytande sfäroider, agar ingjutning) nu utgör den mest använda 3D cellodlingsanalys 11-13. Emellertid är denna analys begränsas av den begränsade uppsättningen av cancercellinjer som kan bilda sfäroider och genom den korta perioden tillgängliga för att studera celler under dessa förhållanden.
I detta visualiseras teknik, vi häri införa en sofistikerad 3D cellodlingsanalys där cancerceller av intresse är inbäddade i en kollagengel för att tillåta bildandet av en pseudo-primär tumör som kan alternativt beläggas med ett basalmembran-härlett matrisen in vitro. När den väl bildats, är pseudo-primärtumören sedan inklämt i ett acellulärt matris (fibrin gel i detta fall), som gör att cancercellerna att korsa gränsytan mellan de två matrisfacken (se figur 1). Interestingly, sekundära tumörliknande strukturer som härrör från den pseudo primära tumören tillsammans med aggressiva cancerceller visas ifibrin gel. Ett sådant 3D odlingssystem ger den flexibilitet som krävs för att undersöka, till exempel läkemedel mot cancer, genuttryck och cell-cell och / eller cell ECM interaktioner 14-16.
Figur 1:.. Översikt av metoden Schematisk översikt av metoden för att generera 3D cellodlingssystem som en modell för cancerstudier Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Ingen etik övervägande eftersom djur och mänskliga cancerceller köptes eller vänligt gett oss.
1. Göra Collagen Plugs (Pseudo-primär tumör)
- Förbered en kollagen dispersion. Typ I-kollagen från råttsvanssenor (RTT) kan antingen extraheras och steriliserade som tidigare rapporterats 17, eller köpt. Disperse frystorkade RTT kollagen (3,25-3,50 mg / ml i 0,02 N ättiksyra) med en mixer (höghastighetsinställning, fem 2 min körs) för en enhetlig blandning.
- Harvest (trypsin-EDTA, vanligtvis) och använda trypanblåexklusion för att räkna viabla celler med användning av en hemocytometer. Justera till önskad celldensitet (5 x 10 4 celler per kontakt).
- Förbered alla lösningar (NaOH, fetalt bovint serum, DMEM 5x, NaHCOs 3) separat (tabell 1) under sterila förhållanden och hålla kyld på is. Notera: Tillsatsordningen för de olika lösningarna är viktigt att förhindra osmotiska eller sura chocker i celler.
- Utföra cell dispersion (1,25 x 10 6 celler) i den slutliga kollagenlösning (5 ml) så snabbt som möjligt. Blanda väl (genom att pipettera upp och ned) samtidigt som man undviker luftbubblor, och sedan snabbt distribuera 200 pl av den färdiga att använda lösningen i varje brunn i en 96-brunnsplatta. slå försiktigt platta med flera brunnar i arbetsområdet ytan av cellodlings huven för att avlägsna luftbubblor och för att sprida lösningen jämnt inuti brunnarna.
- Efter att ha fyllt upp alla brunnar (detta steg tar ca 15-20 min per 96-brunnars platta), lagra den i inkubatorn.
- Inkubera plattan vid 37 ° C från 2 h till över natten. Kollagen gelning (dvs fibrillogenes) sker inom 30 minuter. Lägg odlingsmedium (100 | il / brunn) till odlingen för att utföra en inkubation över natten.
2. Första skiktet av fibringel
- Fibrinogenlösning Preparation.
OBS: Samma sats av fibrin gel bör helst användas för mer reproducerbar results, kan lika fibrin gelbildning variera mellan olika satser av kommersiell frystorkad fibrinogen.- Använd alltid en nygjord fibrinogen lösning. Ta den frystorkade fibrinogen till rumstemperatur innan du öppnar flaskan för att undvika hydrat kristallbildning.
- Gradvis upplösa fibrinogen i förvärmda (37 ° C) Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med Ca2 + / Mg2 + vid en arbetskoncentration av 3 mg / ml (överväga att utarbeta en 15% överskott av den minsta slutvolym krävs : t.ex. 17,25 mg i 5,75 ml för en 5 ml lösning).
- Lägg förvärmda HBSS droppvis först att lösa fibrinogen fragment. Bryta ned större fragment med en spatel i bägaren. Agitera bägaren från tid till annan för att underlätta blandning. Använd inte en omrörare platta under förfarandet. Lös upp det återstående pulvret genom att pipettera suspensionen upp och ned.
- Håll fibrinogenlösning ljummet medan Sterilizing lösningen genom att passera den genom ett 0,22 pm filter. Obs: Om HBSS är inte tillräckligt varmt eller fibrinogen inte helt löst, kan lösningen täppa till filtret. I förekommande fall, byt filter en gång eller två gånger, vilket kan minska fibrinogen koncentration och därmed fibrin koagel styvhet.
- Suspendera cellerna av intresse (t.ex. endotelceller) till färdiga att använda fibrinogenlösning under justering sin slutliga volym, som ett alternativt förfarande.
- Förbereda trombinlösningar.
- Bered en förrådslösning i DDH 2 O (50 NIH enheter / ml), därefter sterilisera den med användning av ett 0,22 pm filter.
- Använda en fibrinogen / trombin-förhållande ≥1: 0,0075 (volym / volym) för att generera den fibrin gel.
- Generering av fibringelen.
- Håll sterila fibrinogen och trombin stamlösningar på is under alla nästa steg. De fibringeler tillåts att bildas i 24-brunnsplattor.
- Omgående overlay the yta av varje brunn med fibrinogen lösning (200 ul / brunn) samtidigt som man undviker luftbubbelbildning. Process 6 brunnar åt gången.
- När fibrinogenlösning helt täcker ytan av brunnarna, luta plattan i 45 ° vinkel och tillsätt 1,5 l trombin lösning till den första brunnen genom att släppa trombin i mitten av brunnen, och sedan snurra försiktigt plattan horisontellt för 2/1 sek.
- Låt plattan i ett stabilt läge under laminärt flöde huva (5-10 min) tills gelningen / koagulering har slutförts (OBS: polymerisationsförfarandet får inte störas, exempelvis genom att transportera plattan till inkubatorn).
- När de första sex brunnar har polymeriserats, upprepa samma sekvens (dvs. 3 föregående steg) för de kommande sex brunnar tills alla brunnar har bearbetats.
3. andra skikt av fibrin gel och inklämt Collagen Plug
- AlternativA: (Använda Collagen Plug Omedelbart).
- Se till att det första lagret av fibringel har polymeriseras i alla brunnar genom att försiktigt luta plattan. Placera 96-brunnars platta innehållande kollagengelen pluggar sida vid sida med den 24-brunnar (innehållande de fibringeler) för att underlätta överföring av kollagen pluggar.
- Lägga en droppe av HBSS i varje brunn i plattan innehållande kollagen pluggar.
- Ta bort varje kollagenpluggen från brunnen med en tunn nål monterad på en spruta (används som ett handtag) eller med hjälp av en mikro-sked (se video). Överför varje kollagenpluggen på det första fibrin gelskiktet användning av en eller två mikro skedar, samtidigt se till att kollagenpluggen är väl centrerad i brunnen och att sterilitet är väl underhållna.
- Överlagra den tidigare bildade fibrin gel med det andra lagret av fibrinogenlösning (300 | j, l / brunn) och införa det trombin som beskrivits i 2,3, att hålla ett minimalt 1:. 0,0075 förhållande och en sekvens av sex brunnar åt gången </ Li>
- Alternativ B (Beläggning kollagen Plug med ett tunt lager av tillväxtfaktor-reducerad Basement Membrane (GFRBM)).
- Cool alla beredda lösningar och instrument förväg och hålla dem vid 4 ° C eller på is (t.ex. pipetter, tips, provrör) under hantering eftersom frysta portioner av GFRBM är mycket känsliga för överhettning hastighet under upptining (följ tillverkarens anvisningar) .
- Efter avlägsnande från plattbrunnarna, blöt varje kollagenpluggen under 2 min i ett 1,5-ml centrifugrör på is innehållande 100 pl av en ren GRFBM lösning.
- Överför varje belagd plugg på den första fibrin skiktet samtidigt som det är väl centrerad, som beskrivits tidigare. Inkubera plug-innehållande plattor vid 37 ° C under 5 min för att tillåta GRFBM att bilda en gel. Tillsätt andra fibrin skiktet som i steg 3.1.4.
4. Cellodlingsmedium Villkor
- Fyll varje brunn med odlingsmedium (400 | j, l). De odlingsmedia och tillägg kommer att väljas baserat på den cellinje och experimentella förhållanden.
- Lägg aprotinin, ett antifibrinolytiskt medel, till odlingsmediet vid en slutlig koncentration av 100 kallikrein inhibitor enheter (KIU) / ml.
OBS: Förvara plattorna i en cellkultur inkubator under de betingelser som användes för den cellinje som testas. - Fylla kulturer med färskt medium varannan dag eller enligt den experimentella schema, och tillsätt aprotinin. Innan du lägger till färskt medium, något luta plattan (vid en 30-35 ° vinkel) och luta pipetten mot sidan av brunnen medan försiktigt suga det konditionerade mediet under ständig observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidigare nämnts, är ett intressant inslag i denna 3D cellodlingsanalys att cancerceller inte bara kan migrera från kollagenpluggen till intilliggande fibrin gel, men också etablera sekundära tumörer (t.ex. satellit tumörliknande strukturer). Detta kan observeras direkt med ett inverterat faskontrastmikroskop vid låga och höga förstoringar genom gelén tjocklek, särskilt med en lång arbetsavstånd kondensor (Figur 2). Med användning av denna 3D cellodlingsmetod kan beteendet hos kända metastatiska celler lätt jämfört med den som finns i icke-metastatiska celler, vilket visas upprepade gånger med olika experimentella uppställningar 15. Till exempel är ett flertal satellit tumörer hittades slumpvis dispergerat i fibrin gel med den metastatiska cellinjen B16F10 medan endast mycket få små satellit tumörer så kan detekteras med dess icke-metastatisk motsvarighet, B16F0-cellinjen (figur 2).
Figur 2:. Beteende av musmelanom B16F10 (A) och B16F0 (B) Celler i 3D-Cell Culture System B16F10 och B16F0 cellinjer är kända för att vara metastatisk och svagt metastatisk, respektive. En övre vy av den sammansatta gelen visas efter 15 dagar i kultur i 24-brunnar. Kollagenpluggen (*) ligger intill en fibringel skikt, i vilket celler har migrerat (pilar) och bildade tumörer satellit såsom ses vid högre förstoring. Helt enkelt, dessa cellinjer uttrycker en hög nivå av melanin som möjliggör direkt visualisering (dvs utan färgning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Formen migrationen främre och satellit tumörer kan variera som en funktion av cellledningsegenskaper. Till exempel de murina bröstkörteln karcinomceller 4T07 celler, som är dåligt metastaser men är mycket invasiva lokalt, bildar en migrering front som sträcker sig radiellt in i fibrin gel (figur 3A). Efter 14 dagars odling, har dessa celler dras bort från migrations front för att bilda stellar formade strukturer i hög grad liknar bröstkörtelstrukturer (Figur 3B-D).
Figur 3: Mouse Mammary Gland Carcinoma 4T07 celler. Dessa celler demonstrerar en stark förmåga att migrera i fibringelen (A). Den streckade linjen avgränsar kollagenpluggen och pilarna visar riktningen av migrations front. Cellerna jämnt invadera fibrinmatrisen (A), och välorganiserad, stjärn-formade rörformiga strukturer kan observeras i 3D (B end C). Visningar inom faskontrastmikroskopi. (A - C) och histologiska sektioner färgade med hematoxylin och eosin (D) visas Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De cellstrukturer som observerades med denna 3D kultursystem, särskilt de satellit tumörer, kan kvantifieras genom planprojektion efter färgning av gelerna med en lösning av metylenblått såsom visas tidigare 16. Färgning gel prov med Hoechst 33258 i olika skeden av cellkulturen gör det möjligt att visualisera cellkärnorna enligt epifluorescence inverterad mikroskopi (Figur 4).
Figur 4: Hormon Responsive bröstcancerceller. human bröstCancer MCF-7-celler exponerades för olika koncentrationer av Tamoxifen. Satellit tumörer i fibrin geler (övre raden) observerades genom faskontrastmikroskopi. DNA från kollagengeler (indikerar närvaron av celler i pseudo-primära tumörer) (nedre raden), färgades med Hoechst 33258 och visualiseras med hjälp av epifluorescensmikroskopi. Som väntat, tamoxifen inducerade DNA-fragmentering till följd av apoptos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| reagens | Volym |
| DMEM 5x (ingen bikarbonat) Förbered från pulver | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCOs 3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 ^ |
| ddH2O | 100 ^ |
| Förvara lösningen på is | |
| cellsuspension | 880 | il |
| Väl blanda på is och till sist snabbt tillägga: | |
| RTT Kollagen (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Total volym | 5 ml |
Tabell 1:. Collagen Plugs Reagens krävs och beredning av en kollagenlösning för 18-19 pluggar. Blanda väl omedelbart efter tillsats av kollagen (genom att vända behållaren upp och ner), samtidigt som man undviker luftbubblor, och sedan snabbt fördela 200 jil i varje brunn.
| Steg | | möjliga orsaker | lösningar | |
| Steg 1. kollagenpluggen | luft~~POS=TRUNC bubblor~~POS=HEADCOMP | Olämpligt pipettering * | Blanda väl samtidigt som man undviker alltför bubblor. |
| Rita varje 200 pl med pipett kolven hela vägen ner och släpper endast 200 l (omvänd pipettering). * | |||
| Kollagenpluggen kontraktion | Kollagen plugg krymper med vissa cellinjer, i synnerhet när de inkuberas över natten. | Kontrollera om celler inducerar kollagen kontraktion innan experimentet. Det rekommenderas att övervaka kontraktion under några dagar. Annars kan pluggar ihop sig i sandwich gelén. | |
| Gelning inträffar inte | Kontrollera reagens för friskhet, molaritet, pH, etc); se till att ingen reagens har utelämnats. | Börja om från börjanomgången. | |
| Steg 2. Första lagret av fibringel | luft~~POS=TRUNC bubblor~~POS=HEADCOMP | Samma kommentarer *; behöver praktiken. | Samma lösning. * Luftbubblor kan finnas kvar i fibrin gel men de brukar försvinna med tiden vid 37 ° C. |
| Gelning inträffar inte | Fel kvantitet av fibrinogen användes; kontrollera trombin koncentration eller nedbrytning. | Börja om från början. | |
| Antag att trombinlösning är otillräcklig; något öka koncentrationen och / eller volym av trombin (t.ex. två gånger). | |||
| Återstående vätskefasen efter gelning | Fibrinogenlösning och trombin inte väl blandade. | Börja om från början. | |
| Fibrin är inte homogen (dvs fibrillära strukturer, agglomerat) | Trombin har otillräckligt sprids i gelén; excessive eller otillräcklig omrörning | Behöver praktiken; börja om från början. | |
| Steg 3. Smörgås / 2: a fibrin skiktet | Samma kommentarer som i steg 2. | ||
| Kollagen kontakten är snabbt (några timmar) omgiven av tomma områden i fibrin | Fibrin har inte polymeriseras tillräckligt i kontakt med kollagengel | Börja om från början | |
| Kollagen pluggar kan vara progressivt (dagar-veckor) omgiven av tomma områden i fibrin | Lokal lys; | Om det är begränsat till ett fåtal platser runt pluggen, kan försöket fortsätta. Annars anser att börja från början. Kan bero på att celler som utsöndrar överskott av plasminogenaktivator. | |
| Glöm inte antifibrinolytiska agent! | |||
| Steg 4 och 5. cell kultur och uppföljning | fibrinolys | Problem med antifibrinolytiska medel (nedbrytning, suboptimal dos, osv.). | Om omfattande satellit tumörer eller invasion, öka dosen av antifibrinolytiska medel. |
| Försurning | Överdriven celltillväxt. | Ändra cellodlingsmedium oftare. | |
Tabell 2: Felsökning Möjliga problem och förslag till lösningar..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en viktig teknisk fotnot är det viktigt att ingen lucka föreligger vid gränsytan mellan den centrala och de perifera geler. Annars kan det minska kapaciteten hos celler att migrera / invadera fibrin gel. Ett utrymme mellan kollagen och fibrin geler kan bildas under de första 24 h av kultur om trombin inte har lämpligt utspädd. Det är också möjligt att cellinjen testades kan leda kollagengelen att dra ihop sig under odling och därigenom orsakar ett relativt stort utrymme för att bilda mellan båda geler. Detta är speciellt förväntas när stromaceller blandas i kollagengelen tillsammans med cancerceller på grund av myofibroblastic-liknande aktivitet 18. För att undvika denna artefakt bör kollagenpluggen inkuberas vid 37 ° C under en längre period (≥48 h ) för att inducera gel sammandragning före montering av fibrin smörgås.
Ett problem också stött med analysen är närvaronav urskiljbar fibrin fibriller eller agglomerat. Detta ger en grumlig istället för genomskinlig aspekt till fibrin gel, vilket försvårar tolkning av data på grund av störning av cancercellen flyttvägar. Sådana frågor kan uppstå från otillräcklig eller överdriven skakning av fibrinogenlösning under polymerisationsprocessen i odlingsplattorna. Det kan också bero på felaktig tillsats av trombin till fibrinogenlösningen (steg 2,3). En felaktigt formade eller dimmigt fibrin gel kan inte fastställas en gång stelnat. Kollagen eller fibringeler kan innehålla luftbubblor som, i de flesta fall, kommer att spontant frigjorda ut efter några dagar i inkubatorn; ändå minimerar ordentlig pipettering deras förekomst. Det rekommenderas att införa en anti-fibrinolytiskt medel vid början av cellodlingsperioden. Fibrinolys kan uppstå efter en lång period av cellkultur på grund av cellulär aktivitet och aktivering av proteolytiska enzymer (dvs plasminogen aktivator) inom collagen plugg och satellit tumörer, beroende på typer av cancerceller och deras aggressivitet 19 .Det frisättning av kollagen kontakten från den nedbrutna fibrin gel och cellbindning till botten av plattorna är två konsekvenser av överdriven fibrinolys (se avsnittet Felsökning i tabell 2). En begränsning hos föreliggande teknik är tjockleken hos den fibrin gel, vilket kan göra det svårt att observera celler genom hela gelén. Användningen mikroskop med en lång arbetsavstånd kondensor bidrar till att kringgå denna begränsning och övervaka celler längs hela Z-axeln. Konfokal eller intravital mikroskopi kan också utgöra ett alternativ för att visualisera celler i fibringelen.
Ett av de viktigaste målen för att utveckla denna 3D cellodlingsmodell var att ge en extracellulärmatrix utrymme genom vilken cancerceller kan fritt migrera och utvecklas. Fibrin valdes på grund av dess förekomst i tumörer,som är skyldig till att öka vaskulär permeabilitet som induceras av inflammation, nekros och förändrad angiogenes, och eftersom fibrin är också känd för att underlätta tumörcellinvasion 20,21. Gränssnittet mellan de två avdelningarna visar stort intresse eftersom det härmar produktionen av nya stödjande matris, såsom fibrin, i tumörer. Dessutom, syre och näringsämnen diffusion, och på längre sikt, pH-stabilitet, är möjligen oreglerad i kollagenutrymmet jämfört med den perifera fibrin utrymmet där diffusion underlättas. På grund av det stora antalet cancerceller som ursprungligen aggregerade i en central kollagenplugg, är tecken på nekros / apoptos observerats inom den primära tumören under odling, simulera fenomenet observeras under expansionen av primära tumörer i patienter 22. Dessutom är bildandet av tumörer satellit remarkably relaterad till aggressiviteten hos cancerceller såväl som deras metastatiska beteende. Beroende på cellinjen och typ of experiment, inkubationstiden krävs för observation relevanta metastaser processer kan vara så länge som 30 dagar. Detta är oftast längre än för andra 3D-analyser, men den extra fördröjningen ger fördelen att studera en modell mer representativa för i tumörer situ.
Det är väl känt att celler odlade i 3D odlingsmodeller visa skillnader i cellsignalering och genexpression jämfört med monolagercellkulturer 5,23. Växande cancerceller i 3D också påverkar deras känslighet för kemoterapeutiska medel 24-26. En viktig och attraktiv egenskap hos denna 3D cellodlingsmodell ligger i möjligheten att ändra ECM koncentrationen, och därmed styvhet gelén, som kan vara av intresse för dem som arbetar på de biomekaniska egenskaperna hos cell-cell och cell-ECM interaktioner, liksom effekten av matris egenskaper på cellinvasion / migrationsprocesser 27. 3D-analysen cellkultur som presenteras här kan anpassaed för att passa olika inställningar och / eller experimentella förhållanden. Till exempel, kan analysen skalas upp för att rymma studier som kräver ett stort antal celler; genom att dubblera den mängd material och antalet celler, kan kollagen pluggar framställas på ett 48-brunnars platta och skiktades på en fibringel i en 6-brunnsplatta. Å andra sidan, kan det vara svårt att miniatyrisera odlingssystemet för hög genomströmning studier och mätningar på grund av inkonsekvent homogenitet fibringelen.
Införandet av icke-cancerceller i en av de två gel avdelningar kan ändra beteendet hos cancercellerna. Till exempel, är bildningen av tumörer satellit förvärras när prostatacancercellinje PC3 blandas med fibroblaster och endotelceller 14. Alternativt kan fluorescensmärkta cellinjer införas i gelén fack för att undersöka cell-cell-interaktioner och / eller för att spåra de celler under odlingsperioden. Dessutom histological sektioner kan framställas efter gel fixering; emellertid, kan kvaliteten på immunohistokemi Resultaten varierar mellan antikroppar eftersom korsreaktioner med fibrin kan förekomma. Rutin färgning av histologiska sektioner såsom med hematoxylin och eosin (H & E) kan avslöja cellorganisation inuti gelmatriser (Figur 3D).
Det är relativt lätt att avlägsna kollagen kontakten ur fibrin gel (t.ex. genom att dra ur kontakten med en glaspipett). Således kan celler och satellit tumörer som finns i fibringelen odlas separat från de som finns i kollagenpluggen. Celler från de satellit kolonier kan skördas genom att extrahera kolonierna med kirurgiska sax eller en skalpell och odla dem i odlingsmedium utan aprotinin till fria celler från fibringelen. Samla celler från de olika avdelningarna i den sammansatta gel kan tillåta olika ytterligare studier, inklusive gen- och proteinuttryck analys. Det kanockså användas för att isolera cellpopulationer med aggressiva fenotyper för ytterligare in vitro eller in vivo-studier. Till exempel, var detta 3D kultur modell som används för att identifiera gener som är involverade i melanom metastas 16. Alla dessa representativa applikationer visar tydligt den flexibilitet som en bi-kompartment 3D cellodlingssystem i vilken cell co-kultur kan utföras.
Sammanfattningsvis är utformningen av vår 3D-kultur systemet flexibelt och kan erbjuda nya vägar för att undersöka biologiska och molekylära händelser under cancerceller apoptos, migration och metastasering samt för läkemedel mot cancer utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M.
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
