Abstract
monolayers में स्तनधारी सेल संस्कृति को व्यापक रूप से विभिन्न शारीरिक और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, बढ़ कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण अक्सर अवांछित कलाकृतियों उत्पन्न करता है। इसलिए, एक तीन आयामी (3 डी) वातावरण में सेल संस्कृति, अक्सर बाह्य मैट्रिक्स घटकों का उपयोग कर, विवो ऊतक या अंग में देशी के करीब समानता के कारण एक दिलचस्प विकल्प के रूप में उभरा। हम एक 3 डी सेल संस्कृति के दो डिब्बों, अर्थात् (i) का उपयोग कर प्रणाली विकसित की एक केंद्रीय डिब्बे एक छद्म प्राथमिक macrospherical ट्यूमर और (ii) एक परिधीय सेल मुक्त डिब्बे एक आतंच जेल से बनी के रूप में एक कोलेजन जेल अभिनय में एम्बेडेड कैंसर कोशिकाओं से युक्त, यानी एक बाह्य मैट्रिक्स घटक केंद्र में इस्तेमाल उस से अलग है, जिसमें कैंसर की कोशिकाओं को विस्थापित कर सकते हैं (आक्रमण के सामने) और / या माध्यमिक या उपग्रह ट्यूमर का प्रतिनिधित्व microspherical ट्यूमर के रूप में। परिधीय डिब्बे में उपग्रह ट्यूमर के गठन की हैउल्लेखनीय जाना जाता आक्रामकता या देशी ट्यूमर कोशिकाओं के मेटास्टेटिक मूल है, जो इस 3 डी संस्कृति प्रणाली अनूठा बनाता है के लिए सहसंबद्ध। यह सेल संस्कृति दृष्टिकोण कैंसर कोशिका invasiveness और गतिशीलता, सेल बाह्य मैट्रिक्स बातचीत और कैंसर रोधी दवा गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि के रूप में आकलन करने के लिए विचार किया जा सकता है।
Introduction
जांच कर कैंसर सेल आक्रमण / प्रवास और बाद में मेटास्टेसिस स्थापना के मौलिक और जैव चिकित्सा विशेषताओं एक गहन अनुसंधान 1,2 का विषय है। मेटास्टेसिस कैंसर के अंतिम चरण में है और इसके नैदानिक प्रबंधन मायावी बनी हुई है। सेलुलर और आणविक स्तर पर मेटास्टेसिस की एक बेहतर समझ और अधिक कुशल उपचारों 3 के विकास के लिए सक्षम हो जाएगा।
मेटास्टेटिक कोशिकाओं के कई गुण विट्रो 4 उनकी stemness और विस्थापित और भीतर और प्राथमिक ट्यूमर 5 से आक्रमण करने के लिए एक संक्रमण राज्य (जैसे, epithelioid-mesenchymal संक्रमण) प्राप्त करने के लिए संभावित सहित में पता लगाया जा सकता है। हालांकि, आक्रमण / मेटास्टेसिस प्रक्रियाओं की इन विट्रो आकलन एक चुनौती रहा है, क्योंकि यह लगभग रक्त / लसीका परिसंचरण के योगदान को शामिल नहीं है। Organotypic संस्कृतियों है कि कोलेजन जैल में ट्यूमर के टुकड़े एम्बेड Previou हैधूर्त कैंसर आक्रामकता पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया। हालांकि ट्यूमर की जटिलता संरक्षित है (जैसे, गैर कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति), ट्यूमर के टुकड़े सीमित मध्यम प्रसार करने के लिए, उजागर कर रहे हैं नमूना बदलाव के लिए, और stromal कोशिकाओं 6 के एक ऊंचा करने के लिए। एक वैकल्पिक तरीका बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है, जो तीन आयामी (3 डी) सेल पर्यावरण mimics के घटकों के भीतर कैंसर कोशिकाओं के बढ़ने में होते हैं। एक कोलेजन जेल और / या एक तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न मैट्रिक्स में स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के प्रसार के 3 डी सेल संस्कृति का सबसे अच्छा उदाहरण से विशेषता के बीच है। विशिष्ट 3 डी सेल संस्कृति के वातावरण का उपयोग करके, बेतरतीब विधानसभा मानक परिस्थितियों में विकसित स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए मनाया स्तन acini और ट्यूबलर संरचना 7-10 की सहज गठन के लिए उलट हो सकता है। इसके अलावा, ग्रंथिकर्कटता कैंसर कोशिकाओं से व्युत्पन्न बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids के गठन के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए (एकत्रजैसे, बूँदें फांसी, अस्थायी spheroids, embedment अगर) अब सबसे अधिक इस्तेमाल किया 3 डी सेल संस्कृति परख 11-13 का गठन किया। हालांकि, इस परख कैंसर कोशिका लाइनों है कि spheroids फार्म कर सकते हैं के प्रतिबंधित सेट के द्वारा और इन परिस्थितियों में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध छोटी अवधि के द्वारा सीमित है।
इस कल्पना की तकनीक में, हम साथ साथ है, जहां ब्याज की कैंसर की कोशिकाओं को एक कोलेजन जेल में एम्बेडेड रहे हैं एक छद्म प्राथमिक ट्यूमर है कि वैकल्पिक रूप से एक तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न मैट्रिक्स के साथ लेपित किया जा सकता है की इन विट्रो गठन की अनुमति के लिए एक परिष्कृत 3 डी सेल संस्कृति परख परिचय। एक बार का गठन, छद्म प्राथमिक ट्यूमर तो एक अकोशिकीय मैट्रिक्स (वर्तमान मामले में आतंच जेल), कैंसर की कोशिकाओं को दो मैट्रिक्स डिब्बों के बीच इंटरफेस को पार करने की अनुमति देता है, जिसमें sandwiched है (चित्रा 1 देखें)। दिलचस्प है, माध्यमिक ट्यूमर की तरह आक्रामक कैंसर की कोशिकाओं के साथ साथ छद्म प्राथमिक ट्यूमर से होने वाले ढांचे में दिखाई देते हैंआतंच जेल। इस तरह के एक 3 डी संस्कृति प्रणाली लचीलापन जांच करने के लिए आवश्यक है, उदाहरण के लिए, विरोधी दवाओं, जीन अभिव्यक्ति और सेल सेल और / या सेल ईसीएम बातचीत 14-16 के लिए प्रदान करता है।
चित्रा 1:।। विधि का अवलोकन विधि कैंसर के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली उत्पन्न करने के योजनाबद्ध सारांश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
नोट: कोई नैतिकता विचार के बाद से पशु और मानव कैंसर कोशिकाओं या खरीदे गए थे कृपया हमें करने के लिए प्रदान की है।
1. कोलेजन प्लग (छद्म प्राथमिक ट्यूमर)
- एक कोलेजन फैलाव तैयार करें। प्रकार मैं चूहे की पूंछ tendons (RTT) या तो निकाला जा सकता है और निष्फल से कोलेजन के रूप में पहले 17 या खरीदी की सूचना दी। फैलाने फ्रीज सूखे RTT कोलेजन (0.02 एन एसिटिक एसिड में 3.25-3.50 मिलीग्राम / एमएल) एक ब्लेंडर का उपयोग कर, एक वर्दी मिश्रण के लिए (उच्च गति सेटिंग पांच 2 मिनट रन)।
- हार्वेस्ट (trypsin-EDTA, आमतौर पर) और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती के लिए trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करें। वांछित सेल घनत्व (प्रति प्लग 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं) को समायोजित करें।
- बाँझ शर्तों के तहत सभी समाधान (NaOH, भ्रूण गोजातीय सीरम, DMEM 5x, NaHCO 3) अलग (तालिका 1) तैयार है और बर्फ पर ठंडा रखने के लिए। नोट: विभिन्न समाधान के अलावा के आदेश कोशिकाओं में आसमाटिक या अम्लीय झटके को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
- अंतिम कोलेजन समाधान (5 एमएल) के रूप में जल्दी संभव के रूप में सेल फैलाव (1.25 x 10 6 कोशिकाओं) का प्रदर्शन। जबकि हवा के बुलबुले से परहेज है, और फिर जल्दी से एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में तैयार करने के लिए उपयोग समाधान के 200 μl वितरित (ऊपर और नीचे pipetting द्वारा) अच्छी तरह से मिलाएं। धीरे हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सेल कल्चर हुड के कार्य क्षेत्र की सतह पर बहु अच्छी तरह से थाली हड़ताल और कुओं के अंदर समान रूप से समाधान प्रसार करने के लिए।
- सभी कुओं को भरने के बाद, (इस कदम प्रति 96 अच्छी तरह से थाली के बारे में 15-20 मिनट लगते हैं) इनक्यूबेटर में यह दुकान।
- रात भर 2 घंटा से करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। कोलेजन जमाना (यानी, fibrillogenesis) 30 मिनट के भीतर होता है। संस्कृति के माध्यम से (100 μl / अच्छी तरह से) संस्कृति में जोड़े एक रात ऊष्मायन प्रदर्शन करने के लिए।
2. आतंच जेल की पहली परत
- फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करना।
नोट: आतंच जेल के एक ही बैच आदर्श अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रेसुल के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएटीएस, के रूप में आतंच जेल गठन वाणिज्यिक फ्रीज सूखे फाइब्रिनोजेन के विभिन्न बैचों के बीच भिन्न हो सकते हैं।- हमेशा एक नया तैयार फाइब्रिनोजेन समाधान का उपयोग करें। शीशी खोलने हाइड्रेट क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए पहले कमरे के तापमान को फ्रीज सूखे फाइब्रिनोजेन लाओ।
- उत्तरोत्तर में पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) सीए 2 के साथ / 3 मिलीग्राम / एमएल के एक काम एकाग्रता में 2 मिलीग्राम + (न्यूनतम अंतिम मात्रा का एक 15% अतिरिक्त तैयारी पर विचार की आवश्यकता फाइब्रिनोजेन भंग : उदाहरण के लिए, एक 5 मिलीलीटर समाधान के लिए 5.75 मिलीलीटर में 17.25 मिलीग्राम)।
- पहली बार में पूर्व गर्म HBSS dropwise जोड़े फाइब्रिनोजेन टुकड़े solubilize के लिए। बीकर में एक रंग के साथ बड़े टुकड़े टूट। समय-समय पर मिश्रण की सुविधा के लिए के लिए बीकर आंदोलन। प्रक्रिया के दौरान एक दोषी प्लेट का प्रयोग न करें। निलंबन ऊपर और नीचे pipetting द्वारा शेष पाउडर भंग।
- फाइब्रिनोजेन समाधान गुनगुने जबकि steri रखेंएक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान LIZING। नोट: HBSS काफी गर्म नहीं है या फाइब्रिनोजेन पूरी तरह से भंग नहीं हैं, तो समाधान फिल्टर रोकना कर सकते। यदि लागू हो, फिल्टर एक या दो बार, जो फाइब्रिनोजेन एकाग्रता कम हो सकती है, और इस तरह आतंच थक्का कठोरता की जगह।
- जबकि एक वैकल्पिक प्रक्रिया के रूप में, अपने अंतिम मात्रा का समायोजन के लिए तैयार करने के लिए उपयोग फाइब्रिनोजेन समाधान में ब्याज की कोशिकाओं (जैसे, endothelial कोशिकाओं) को निलंबित करें।
- थ्रोम्बिन समाधान तैयार कर रहा है।
- DDH 2 हे (50 एनआईएच इकाइयों / एमएल) में एक शेयर समाधान तैयार है, तो यह एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बाँझ।
- एक फाइब्रिनोजेन / थ्रोम्बिन अनुपात ≥1 का उपयोग करें: 0.0075 (वी / वी) आदेश आतंच जेल उत्पन्न करने के लिए।
- आतंच जेल पैदा होता है।
- बाँझ फाइब्रिनोजेन रखें और सब अगले चरणों के दौरान बर्फ पर स्टॉक समाधान थ्रोम्बिन। आतंच जैल 24 अच्छी तरह प्लेटें में फार्म की अनुमति दी जाती है।
- तुरंत ओवरले वेंप्रत्येक के ई सतह अच्छी तरह से फाइब्रिनोजेन समाधान (200 μl / अच्छी तरह से), जबकि हवा बुलबुला गठन से परहेज। एक समय में 6 कुओं की प्रक्रिया।
- एक बार जब फाइब्रिनोजेन समाधान पूरी तरह से कुओं की सतह शामिल हैं, एक 45 डिग्री के कोण पर थाली झुकाव और अच्छी तरह से केंद्र में थ्रोम्बिन छोड़ने से पहले अच्छी तरह से करने के लिए थ्रोम्बिन समाधान के 1.5 μl जोड़ने के लिए, और फिर धीरे लिए क्षैतिज थाली ज़ुल्फ़ 1-2 सेकंड।
- लामिना का प्रवाह हुड (5-10 मिनट) तक जमाना / थक्के प्रक्रिया पूरा कर लिया है के तहत एक स्थिर स्थिति में थाली छोड़ दो (नायब: polymerization की प्रक्रिया परेशान नहीं होना चाहिए, जैसे, इनक्यूबेटर प्लेट परिवहन के द्वारा)।
- एक बार पहले छह कुओं polymerized है, अगले छह कुओं के लिए इसी अनुक्रम (यानी 3 पिछले चरणों) दोहराएँ जब तक सभी कुओं संसाधित किया गया है।
3. आतंच जेल और बैठा कोलेजन प्लग की दूसरी परत
- देखियेएक: (कोलेजन प्लग तुरंत का उपयोग)।
- सुनिश्चित करें कि आतंच जेल की पहली परत नाजुक प्लेट झुकने से सभी कुओं में polymerized है सुनिश्चित करें। 96 अच्छी तरह से कोलेजन प्लग के हस्तांतरण को कम करने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली (आतंच जैल युक्त) के साथ कंधे से कोलेजन जेल प्लग पक्ष युक्त थाली रखें।
- HBSS की एक बूंद कोलेजन प्लग युक्त थाली के प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
- एक पतली सुई एक सिरिंज (संभाल के रूप में प्रयोग किया जाता है) पर चढ़कर या एक माइक्रो चम्मच का उपयोग (वीडियो देखें) के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कोलेजन प्लग निकालें। पहले आतंच जेल परत एक या दो सूक्ष्म चम्मच का उपयोग करने पर प्रत्येक कोलेजन प्लग स्थानांतरण, जबकि यकीन है कि कोलेजन प्लग में अच्छी तरह से अच्छी तरह से केंद्रित है और कहा कि बाँझपन अच्छी तरह से बनाए रखा है बना रही है।
- फाइब्रिनोजेन समाधान की दूसरी परत के साथ पहले से गठित आतंच जेल ओवरले (300 μl / अच्छी तरह से) और 2.3 में वर्णित के रूप में थ्रोम्बिन लागू करने, एक न्यूनतम 1 रखते हुए:। एक समय में 0.0075 अनुपात और छह कुओं के एक दृश्य </ Li>
- विकल्प बी (विकास फैक्टर कम तहखाने झिल्ली (GFRBM) की एक पतली परत के साथ कोलेजन प्लग कोटिंग)।
- कूल सभी तैयार समाधान और उपकरणों पहले से और GFRBM के जमे हुए aliquots के बाद से निपटने के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर (जैसे, pipettes, टिप्स, टेस्ट ट्यूब) के लिए उन्हें रखने के विगलन के दौरान अत्यधिक हीटिंग दर करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) ।
- प्लेट कुओं से हटाने के बाद, एक शुद्ध GRFBM समाधान के 100 μl युक्त बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 2 मिनट के लिए प्रत्येक कोलेजन प्लग लेना।
- पहले आतंच परत पर प्रत्येक लेपित प्लग स्थानांतरण, जबकि यह सुनिश्चित करना अच्छी तरह से केंद्रित है, जैसा कि पहले बताया है। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लग-युक्त प्लेटें सेते 5 मिनट GRFBM एक जेल के रूप में करने की अनुमति देने के लिए। दूसरी आतंच परत कदम 3.1.4 के रूप मे।
4. सेल संस्कृति माध्यम शर्तें
- संस्कृति के माध्यम से अच्छी तरह से प्रत्येक भरें (400 μl)। संस्कृति मीडिया और पूरक सेल लाइन और प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर चयन किया जाएगा।
- 100 kallikrein अवरोध इकाइयों (KIU) / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में aprotinin, एक antifibrinolytic एजेंट, संस्कृति के माध्यम से जोड़ें।
ध्यान दें: परीक्षण किया सेल लाइन के लिए इस्तेमाल की शर्तों के तहत एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटें स्टोर। - ताजा माध्यम के साथ संस्कृतियों की भरपाई होगी हर दूसरे दिन या प्रयोगात्मक कार्यक्रम के अनुसार, और aprotinin जोड़ें। ताजा मध्यम जोड़ने से पहले, थोड़ा (एक 30-35 डिग्री कोण पर) प्लेट झुकाव और अच्छी तरह से पक्ष के खिलाफ pipet झुकाना, जबकि ध्यान से निरंतर निगरानी में वातानुकूलित माध्यम suctioning।
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Representative Results
जैसा कि पहले उल्लेख, इस 3 डी सेल संस्कृति परख का एक दिलचस्प विशेषता यह है कि कैंसर की कोशिकाओं को केवल आसन्न आतंच जेल के लिए कोलेजन प्लग से विस्थापित नहीं कर सकते हैं, लेकिन यह भी माध्यमिक ट्यूमर (जैसे, उपग्रह ट्यूमर संरचनाओं की तरह) की स्थापना है। यह सीधे, जेल मोटाई के माध्यम से निम्न और उच्च आवर्धन पर एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ मनाया जा सकता है विशेष रूप से एक लंबे समय तक काम दूरी कंडेनसर (चित्रा 2) के साथ। इस 3 डी सेल संस्कृति विधि का प्रयोग, जाना जाता मेटास्टेटिक कोशिकाओं के व्यवहार को आसानी से गैर मेटास्टेटिक कोशिकाओं में पाया है कि, के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक setups 15 के साथ बार बार दिखा तुलना में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कई उपग्रह ट्यूमर बेतरतीब ढंग से मेटास्टेटिक सेल लाइन B16F10 साथ आतंच जेल में बिखरे पाए जाते हैं केवल बहुत कुछ छोटे उपग्रह ट्यूमर तो इसकी गैर-मेटास्टेटिक समकक्ष, B16F0 सेल लाइन (चित्रा 2 के साथ पाया जा सकता है)।
चित्रा 2:। 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली में माउस मेलेनोमा B16F10 (ए) और B16F0 (बी) कोशिकाओं के व्यवहार B16F10 और B16F0 सेल लाइनों मेटास्टेटिक और कमजोर मेटास्टेटिक, क्रमशः हो जाना जाता है। समग्र जेल की एक ऊपरी दृश्य 24 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति में 15 दिनों के बाद दिखाया गया है। कोलेजन प्लग (*) एक आतंच जेल परत है जो कोशिकाओं में चले गए हैं (तीर) और गठन उपग्रह ट्यूमर के रूप में उच्च बढ़ाई देखा के निकट है। काफी आसानी से, इन सेल लाइनों (धुंधला बिना यानी) एक उच्च मेलेनिन कि प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है के स्तर को व्यक्त करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पलायन सामने और उपग्रह ट्यूमर के आकार एक समारोह के रूप में भिन्न हो सकते हैंसेल लाइन विशेषताओं के tion। उदाहरण के लिए, murine स्तन ग्रंथि कार्सिनोमा 4T07 कोशिकाओं है, जो खराब मेटास्टेटिक हैं, लेकिन स्थानीय स्तर पर बहुत आक्रामक हैं, एक प्रवास सामने है कि आतंच जेल (चित्रा 3 ए) में त्रिज्यात फैली रूप में। संस्कृति के 14 दिनों के बाद, उन कोशिकाओं को बारीकी से स्तन ग्रंथि संरचनाओं (चित्रा 3 बी-डी) जैसी तारकीय आकार संरचनाओं फार्म प्रवासी सामने से दूर खींच लिया है।
चित्रा 3: माउस स्तन ग्रंथि कार्सिनोमा 4T07 प्रकोष्ठों। इन कोशिकाओं को आतंच जेल (ए) में विस्थापित करने के लिए एक मजबूत क्षमता प्रदर्शित करता है। धराशायी लाइन कोलेजन प्लग रूपरेखा बनाती है और तीर प्रवास सामने की दिशा दिखा। कोशिकाओं को समान रूप से आतंच मैट्रिक्स (ए) पर आक्रमण, और अच्छी तरह से संगठित, तारकीय आकार ट्यूबलर संरचना 3 डी में देखा जा सकता है (बी एकडी सी)। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत दृश्य। (ए - सी) और histological वर्गों hematoxylin और eosin (डी) द्वारा दाग दिखाए जाते हैं, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस 3 डी संस्कृति प्रणाली, विशेष रूप से उपग्रह ट्यूमर, साथ मनाया सेल संरचनाओं के रूप में पहले 16 में दिखाया गया एक methylene नीले समाधान के साथ जैल धुंधला करने के बाद तलीय प्रक्षेपण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। Hoechst 33258 के साथ जेल के नमूने धुंधला सेल संस्कृति के विभिन्न चरणों में epifluorescence उल्टे माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के तहत सेल नाभिक कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है।
चित्रा 4: हार्मोन उत्तरदायी स्तन कैंसर की कोशिकाओं। मानव स्तनकर्क एमसीएफ-7 कोशिकाओं Tamoxifen के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया गया। आतंच जैल (ऊपरी पंक्ति) में सैटेलाइट ट्यूमर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया। कोलेजन जैल (कम पंक्ति) (छद्म प्राथमिक ट्यूमर में कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है) से डीएनए, Hoechst 33258 के साथ दाग और epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की गई थी। जैसी कि उम्मीद थी, tamoxifen apoptosis के एक परिणाम के रूप में प्रेरित डीएनए विखंडन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अभिकर्मकों | आयतन |
| DMEM 5x (कोई बिकारबोनिट) पाउडर से तैयार करें | 1 मिलीलीटर |
| FBS | 0.5 मिलीलीटर |
| 0.26 एम 3 NaHCO | 0.5 मिलीलीटर |
| 1 एन NaOH | 20 μl |
| ddH2O | 100 μl |
| बर्फ पर इस समाधान रखें | |
| सेल निलंबन | 880 μl |
| खैर बर्फ पर और जल्दी से पिछले पर जोड़ने के मिश्रण: | |
| RTT कोलेजन (3.5 मिलीग्राम / एमएल) | 2 मिलीलीटर |
| कुल मात्रा | 5 मिलीलीटर |
तालिका 1:। कोलेजन प्लग अभिकर्मकों की आवश्यकता है और 18-19 प्लग के लिए एक कोलेजन समाधान की तैयारी। कोलेजन के बाद इसके अलावा, जबकि हवा के बुलबुले से परहेज है, और फिर तुरंत अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 200 μl वितरित (कंटेनर के ऊपर और नीचे inverting द्वारा) अच्छी तरह से तुरंत मिक्स।
| कदम | | संभावित कारण | समाधान की | |
| चरण 1। कोलेजन प्लग | हवा के बुलबुले | अनुचित pipetting * | अच्छी तरह से, जबकि अत्यधिक बुलबुले से बचने मिक्स। |
| सभी रास्ते नीचे पिपेट पिस्टन के साथ प्रत्येक 200 μl ड्रा और केवल 200 μl (रिवर्स pipetting) जारी। * | |||
| कोलेजन प्लग संकुचन | जब रातोंरात incubated कोलेजन प्लग, कुछ सेल लाइनों के साथ विशेष रूप से सिकुड़ती। | यदि कोशिकाओं प्रयोग शुरू करने से पहले कोलेजन संकुचन प्रेरित जाँच करें। यह कुछ ही दिनों में संकुचन की निगरानी के लिए सिफारिश की है। अन्यथा, प्लग बैठा जेल में अनुबंध कर सकते हैं। | |
| जमाना नहीं होती है | ताजगी, molarity, पीएच, आदि) के लिए अभिकर्मकों की जाँच करें; सुनिश्चित करें कि कोई अभिकर्मक हटा दिया गया है बनाते हैं। | बेग से फिर से शुरूपारी। | |
| चरण 2। आतंच जेल की पहली परत | हवा के बुलबुले | एक ही टिप्पणी *; अभ्यास की जरूरत है। | एक ही समाधान। * एयर बुलबुले आतंच जेल में रह सकती है, लेकिन वे आम तौर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर समय के साथ गायब हो जाते हैं। |
| जमाना नहीं होती है | इस्तेमाल किया फाइब्रिनोजेन की गलत मात्रा; थ्रोम्बिन एकाग्रता या गिरावट की जाँच करें। | शुरुआत से फिर से शुरू करें। | |
| थ्रोम्बिन मान लें समाधान अपर्याप्त है; थोड़ा एकाग्रता और / या थ्रोम्बिन की मात्रा (जैसे, दो बार) वृद्धि हुई है। | |||
| जमाना बाद अवशिष्ट तरल चरण | फाइब्रिनोजेन समाधान और थ्रोम्बिन अच्छी तरह से नहीं मिलाया। | शुरुआत से फिर से शुरू करें। | |
| आतंच समरूप नहीं है (यानी तंतुमय संरचनाओं, agglomerates) | थ्रोम्बिन अपर्याप्त जेल में दूर तक फैला हुआ है; भूतपूर्वcessive या अपर्याप्त आंदोलन | अभ्यास की जरूरत है; शुरुआत से फिर से शुरू करते हैं। | |
| चरण 3। सैंडविच / 2 एन डी आतंच परत | चरण 2 में के रूप में एक ही टिप्पणी। | ||
| कोलेजन प्लग तेजी से है (कुछ घंटे) आतंच में खाली क्षेत्रों से घिरा हुआ | आतंच कोलेजन जेल के साथ संपर्क में पर्याप्त रूप से polymerized नहीं किया गया है | शुरुआत से फिर से शुरू | |
| कोलेजन प्लग उत्तरोत्तर हो सकता है (दिन-सप्ताह) आतंच में खाली क्षेत्रों से घिरा हुआ | स्थानीय सेल; | यह प्लग के आसपास कुछ स्थानों के लिए प्रतिबंधित है, तो प्रयोग पर जा सकते हैं। अन्यथा शुरू से शुरू करने पर विचार करें। plasminogen उत्प्रेरक की अत्यधिक मात्रा में स्रावित कोशिकाओं के कारण हो सकता है। | |
| antifibrinolytic एजेंट मत भूलना! | |||
| चरण 4 और 5। celएल संस्कृति और अनुवर्ती | फाइब्रिनोलयन | Antifibrinolytic एजेंट के साथ समस्या (गिरावट, सबऑप्टिमल खुराक, आदि।)। | उपग्रह ट्यूमर या आक्रमण के व्यापक मात्रा है, तो antifibrinolytic एजेंट की खुराक में वृद्धि। |
| अम्लीकरण | अत्यधिक सेल के विकास। | सेल संस्कृति के माध्यम से अधिक बार बदलें। | |
तालिका 2: समस्या निवारण संभव मुद्दों और प्रस्तावित समाधान।।
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Discussion
एक महत्वपूर्ण तकनीकी फुटनोट के रूप में, यह जरूरी है कि कोई अंतर मध्य और परिधीय जैल के बीच इंटरफेस में मौजूद है। अन्यथा, यह कोशिकाओं को विस्थापित / आतंच जेल पर आक्रमण करने की क्षमता को कम कर सकता है। कोलेजन और आतंच जैल बीच में एक जगह संस्कृति के पहले 24 घंटे के दौरान फार्म यदि थ्रोम्बिन उचित पतला नहीं किया गया है सकते हैं। यह भी संभव है कि सेल लाइन कोलेजन जेल नेतृत्व कर सकते हैं परीक्षण किया संस्कृति के दौरान अनुबंध करने के लिए, जिससे दोनों के बीच जैल के लिए फार्म एक अपेक्षाकृत बड़ी जगह पैदा कर रहा है। लंबी अवधि के लिए यह विशेष रूप से जब stromal कोशिकाओं myofibroblastic-तरह गतिविधि 18 के कारण कैंसर कोशिकाओं के साथ साथ कोलेजन जेल में मिश्रित कर रहे हैं उम्मीद है। आदेश में इस विरूपण साक्ष्य से बचने के लिए, कोलेजन प्लग 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated किया जाना चाहिए (मानव संसाधन ≥48 ) जेल संकुचन आतंच सैंडविच कोडांतरण से पहले प्रेरित करने के लिए।
एक समस्या यह भी परख के साथ सामना करना पड़ा उपस्थिति हैके प्रत्यक्ष आतंच तंतुओं या agglomerates। यह आतंच जेल है, जो कैंसर कोशिका प्रवासी रास्ते की गड़बड़ी के कारण डेटा की व्याख्या करने के लिए पेचीदा एक बादल के बजाय पारदर्शी पहलू प्रदान करता है। इस तरह के मुद्दों संस्कृति प्लेटों में polymerization की प्रक्रिया के दौरान फाइब्रिनोजेन समाधान की अपर्याप्त या अत्यधिक झटकों से उत्पन्न हो सकती है। यह भी फाइब्रिनोजेन समाधान (2.3 कदम) में थ्रोम्बिन के अनुचित अलावा की वजह से हो सकता है। एक अनुचित तरीके से गठन या बादल आतंच जेल एक बार तय नहीं किया जा सकता बढ़ाया। कोलेजन या आतंच जैल हवा के बुलबुले कि, ज्यादातर मामलों में, अनायास बाहर इनक्यूबेटर में कुछ दिनों के बाद मुक्त हो जाएगा हो सकती है; बहरहाल, उचित pipetting उनकी घटना को कम करता है। यह सेल संस्कृति अवधि की शुरुआत में एक विरोधी fibrinolytic एजेंट शुरू करने की सिफारिश की है। फाइब्रिनोलयन सेलुलर गतिविधि और एंजाइमों (यानी, plasminogen उत्प्रेरक) सी के भीतर के सक्रियण के कारण सेल संस्कृति की एक लंबी अवधि के बाद हो सकता हैollagen प्लग और उपग्रह ट्यूमर, कैंसर कोशिका प्रकार और अपमानित आतंच जेल और प्लेटों के नीचे करने के लिए सेल लगाव से कोलेजन प्लग की उनकी आक्रामकता 19 व्याप्ति रिहाई के आधार पर अत्यधिक फाइब्रिनोलयन के दो परिणाम (तालिका में समस्या निवारण अनुभाग देखें हैं 2)। वर्तमान तकनीक की एक सीमा है आतंच जेल है, जो यह मुश्किल पूरे जेल के माध्यम से कोशिकाओं का पालन करने के लिए कर सकते हैं की मोटाई है। हालांकि, एक लंबे समय तक काम दूरी कंडेनसर के साथ प्रयोग के लिए एक खुर्दबीन इस सीमा को नाकाम करने के लिए और पूरे जेड अक्ष के साथ कोशिकाओं पर नजर रखने में मदद करता है। Confocal या intravital माइक्रोस्कोपी भी आतंच जेल में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक विकल्प प्रदान कर सकता है।
इस 3 डी सेल संस्कृति मॉडल के विकास के लिए प्रमुख उद्देश्यों में से एक एक बाह्य मैट्रिक्स डिब्बे के माध्यम से जो कैंसर की कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से विस्थापित और विकसित करने में सक्षम हैं प्रदान करने के लिए किया गया था। आतंच ट्यूमर में अपनी उपस्थिति की वजह से चुना गया था,जो संवहनी पारगम्यता सूजन, गल जाना और बदल angiogenesis से प्रेरित बढ़ाने के लिए बकाया है, और जब से आतंच भी ट्यूमर सेल आक्रमण 20,21 की सुविधा के लिए जाना जाता है। दो डिब्बों के बीच इंटरफेस के रूप में यह इस तरह के आतंच के रूप में नए सहायक मैट्रिक्स के उत्पादन mimics, ट्यूमर में, ज्यादा ब्याज प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रसार, और लंबे समय तक चलाने के लिए, पीएच स्थिरता में है, संभवतः कोलेजन डिब्बे में परिधीय आतंच डिब्बे जिसमें प्रसार में मदद की है की तुलना में dysregulated रहे हैं। कैंसर की कोशिकाओं को शुरू में एक केंद्रीय कोलेजन प्लग में एकत्रित की बड़ी संख्या के कारण, गल जाना / apoptosis के संकेत संस्कृति के दौरान प्राथमिक ट्यूमर के भीतर मनाया जाता है, घटना के रोगियों के 22 में प्राथमिक ट्यूमर के विस्तार के दौरान मनाया अनुकरण। इसके अलावा, उपग्रह ट्यूमर के गठन उल्लेखनीय कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामकता के साथ ही उनके मेटास्टेटिक व्यवहार से संबंधित है। सेल लाइन और प्रकार ओ पर निर्भर करता हैएफ प्रयोग, ऊष्मायन अवधि प्रासंगिक मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं के अवलोकन के रूप में लंबे समय के रूप में 30 दिनों में हो सकता है के लिए जरूरी है। यह आमतौर पर अन्य 3 डी assays के लिए अधिक लंबी है, लेकिन कहा कि देरी सीटू ट्यूमर में से एक मॉडल के अधिक प्रतिनिधि का अध्ययन कर के लाभ लाता है।
यह अच्छी तरह से है कि 3 डी मॉडल संस्कृति में विकसित कोशिकाओं monolayer सेल संस्कृतियों 5,23 की तुलना में सेल संकेतन और जीन अभिव्यक्ति में मतभेद प्रदर्शित मान्यता प्राप्त है। 3 डी में कैंसर कोशिकाओं से बढ़ भी एजेंटों 24-26 के लिए अपनी संवेदनशीलता को प्रभावित करता है। इस 3 डी सेल संस्कृति मॉडल का एक महत्वपूर्ण और आकर्षक फीचर संभावना ईसीएम एकाग्रता, और इस तरह जेल की कठोरता, जो ब्याज की सेल सेल और सेल ईसीएम के biomechanical गुणों पर काम कर रहे लोगों के लिए हो सकता है संशोधित करने के लिए रहता है बातचीत, साथ ही सेल आक्रमण पर मैट्रिक्स गुणों के प्रभाव / प्रवास 27 प्रक्रियाओं। 3 डी सेल संस्कृति यहाँ प्रस्तुत परख के लिए अनुकूलित किया जा सकताएड विभिन्न सेटिंग्स और / या प्रयोगात्मक शर्तों के अनुरूप है। उदाहरण के लिए, परख कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के अध्ययन को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है; सामग्री की मात्रा और कोशिकाओं की संख्या को दोगुना करके, कोलेजन प्लग एक 48 अच्छी तरह से थाली में तैयार किया और एक 6 अच्छी तरह से थाली में एक आतंच जेल पर स्तरित जा सकता है। दूसरी ओर, यह उच्च throughput अध्ययन और आतंच जेल के असंगत एकरूपता की वजह से माप के लिए संस्कृति प्रणाली miniaturize करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
दो जेल डिब्बों में से एक में गैर कैंसर कोशिकाओं की शुरूआत कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार को संशोधित कर सकता है। उदाहरण के लिए, उपग्रह ट्यूमर के गठन जब प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन PC3 fibroblasts और endothelial कोशिकाओं 14 के साथ मिलाया जाता विकट हो जाती है। वैकल्पिक रूप से, fluorescently लेबल सेल लाइनों सेल सेल बातचीत की जांच और / या संस्कृति की अवधि के दौरान कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए जेल के डिब्बों में पेश किया जा सकता है। इसके अलावा, हायstological वर्गों जेल निर्धारण के बाद तैयार किया जा सकता है; हालांकि, immunohistochemistry परिणामों की गुणवत्ता एंटीबॉडी के बीच भिन्न बाद आतंच के साथ पार प्रतिक्रियाओं हो सकता है। ऐसे hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ के रूप में histological वर्गों के नियमित धुंधला जेल matrices (चित्रा 3 डी) के अंदर सेल संगठन प्रकट कर सकते हैं।
यह (, जैसे एक गिलास विंदुक के साथ प्लग बाहर खींच कर) आतंच जेल से कोलेजन प्लग दूर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। इस प्रकार, कोशिकाओं और उपग्रह आतंच जेल में मौजूद ट्यूमर कोलेजन प्लग में पाए जाने वाले से अलग हो सकता है। उपग्रह कालोनियों से प्रकोष्ठों शल्य कैंची या एक छुरी के साथ कालोनियों निकालने और आतंच जेल से मुक्त कोशिकाओं को aprotinin बिना संस्कृति के माध्यम में उन्हें बढ़ती द्वारा काटा जा सकता है। समग्र जेल के विभिन्न डिब्बों से एकत्रित की कोशिकाओं में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित विभिन्न आगे के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते। यहके लिए भी आगे इन विट्रो में या विवो अध्ययन में आक्रामक phenotypes के साथ सेल आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। उदाहरण के लिए, इस 3 डी मॉडल संस्कृति मेलेनोमा मेटास्टेसिस 16 में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उन सभी प्रतिनिधि आवेदन पत्र में स्पष्ट रूप से लचीलापन एक द्वि-पूरक 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली है जिसमें सेल सह संस्कृति बाहर किया जा सकता द्वारा अनुमति प्रदर्शित करता है।
अंत में, हमारे 3 डी संस्कृति प्रणाली के डिजाइन लचीला है और कैंसर कोशिका apoptosis, प्रवास और मेटास्टेसिस के दौरान के रूप में अच्छी तरह से विरोधी दवा मूल्यांकन के लिए जैविक और आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए नए रास्ते की पेशकश कर सकते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
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