Abstract
Alvleesklierkanker blijft één van de kankers waarvoor de overleving niet aanzienlijk in de afgelopen decennia is verbeterd. Slechts 7% van de gediagnosticeerde patiënten langer dan vijf jaar te overleven. Om te begrijpen en bootsen de micro pancreas tumoren, hebben we gebruik gemaakt van een murine model van orthotope alvleesklierkanker dat niet-invasieve beeldvorming van tumorprogressie maakt in real time. Pancreaskanker cellen die groen fluorescent proteïne (GFP PANC-1) werden gesuspendeerd in basaalmembraan matrix, hoge concentratie (bijvoorbeeld Matrigel HC) met serumvrij medium en vervolgens geïnjecteerd in de staart van de pancreas laparotomie. De celsuspensie in de hoge concentratie basaalmembraan matrix wordt een gelachtige substantie eenmaal op kamertemperatuur; derhalve geleert wanneer het in contact komt met de alvleesklier, waardoor een afdichting op de injectieplaats en het voorkomen van lekkage cel. tumorgroei en metastase naar andere organen worden bewaakt in levendedieren met behulp van fluorescentie. Het is kritisch voor de juiste filters voor excitatie en emissie van GFP. De stappen voor het orthotope implantatie worden beschreven in dit artikel, zodat onderzoekers gemakkelijk de procedure in naakt muizen kunnen repliceren. De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de voorbereiding van de celsuspensie, chirurgische implantatie, en het gehele lichaam fluorescerende in vivo beeldvorming. Dit orthotope model is ontworpen om de effectiviteit van nieuwe therapieën op de primaire en metastatische tumoren te onderzoeken.
Introduction
Alvleesklier kanker wordt gediagnosticeerd met een verhoogde frequentie in vergelijking met andere vormen van kanker en is het 4e belangrijke oorzaak van sterfte aan kanker in de Verenigde Staten. Vanaf het moment van diagnose, meer dan 90% van de patiënten sterven binnen vijf jaar 1,2. Op dit moment, chirurgische verwijdering van de tumor is de enige remedie voor pancreaskanker, maar minder dan 20% van de patiënten komen in aanmerking voor een operatie ondergaan, vooral omdat op het moment van de diagnose van de ziekte is in een vergevorderd stadium en is uitgezaaid 3,4. Het ontbreken van specifieke symptomen maakt pancreaskanker een stille ziekte; een aantal van de symptomen zijn buikpijn, rugpijn, verlies van eetlust, geelzucht en misselijkheid; die gemakkelijk kan worden geïnterpreteerd als gemeenschappelijke spijsvertering ziekten 4. Daarom is het belangrijk om nieuwe farmacologische hulpmiddelen om te helpen bij de diagnose en behandeling van pancreatische kanker.
Het gebruik van dierlijke modellen laat ons toe om de biologie van Pancré begrijpenATIC kanker en geeft inzicht in het toepassen van deze kennis voor de mens. Orthotope xenograft modellen van pancreaskanker realistisch omdat tumoren groeien in het orgaan van oorsprong 5. In tegenstelling tot heterotopische modellen, waarbij cellijnen of tumorfragmenten subcutaan worden geïmplanteerd, orthotopische modellen maakt de recreatie van de tumor micro-omgeving en bootst de interactie van tumorcellen met zijn omgeving 6. De xenograft model hier beschreven is afgeleid van tumoren uit de menselijke alvleesklierkanker cellijn PANC-1 GFP, die genetisch is gemanipuleerd om het groen fluorescerend eiwit (GFP) uit te drukken. GFP detectie maakt voor een niet-invasieve beeldvorming en bewaking van tumorgroei en metastase 7. Tumorontwikkeling treedt snel, spontaan en lijkt op die van primaire tumoren van menselijke alvleesklierkankerpatiënten 8. Orthotope modellen een meer nauwkeurige voorspelling van geneesmiddelefficiëntie in reactie op therapeutische middelen, terwijlnabootsen van de tumor micro-omgeving.
Zoals hierboven vermeld, dit diermodel maakt fluorescentiedetectie van tumorgroei en metastase in real time. Fluorescentiedetectie maakt een directe / levende imaging vergeleken met luminescentie. Met fluorescentie het uitgezonden licht is een gevolg van een excitatie van een andere licht van een kortere golflengte; dat in luminescentie, het uitgezonden licht is het resultaat van een chemische reactie en kan geen sterke emissie 9. Bovendien hele lichaam in vivo fluorescentie beeldvorming is niet schadelijk voor het dier kunnen onderzoekers tumorgroei tijd te volgen in reactie op therapeutische behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven protocol wordt uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van de Animal Care en gebruik Comite Western University's. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, regelgeving en regelgevende instanties.
1. Cultuur van de Cel
- Bereiding van compleet medium
- Via een Klasse II biologische veiligheidskast, compleet medium bereid door aseptisch foetaal runderserum (FBS) en penicilline streptomycine (P / S) om een fles 500 ml RPMI medium. Meng voorzichtig door zwenken. De eindconcentratie van elk supplement 10% FBS en 1% P / S (v / v). Bijvoorbeeld, aanvullen 500 ml medium met 56 ml FBS en 6 ml P / S.
- Plaats compleet medium in een waterbad bij 37 ° C.
- Ontdooien en uitdragen van Cellen
- Ophalen PANC-1 GFP cellen van vloeibare stikstof. Ontdooi de flacon door voorzichtig schudden in een waterbad bij 37 ° C.
Notitie:(- 3 min ongeveer 2) ontdooien moet snel zijn. - Label T-75 kolven voor gebruik met (a) cellijn naam, (b) passage nummer, (c) datum en initialen (d) onderzoeker.
- Veeg de flacon met 70% ethanol en overdracht flesje naar een bioveiligheid kast.
- Om de cellen te propageren, voeg 9,0 ml compleet medium aan een 15 ml conische buis. Met een 1,0 ml pipet voorzichtig breng de celsuspensie en suspendeer in 9 ml van compleet medium.
- Centrifugeer bij 125 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Breng de conische flacon een bioveiligheid kast en zuig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
- Suspendeer de pellet in 10 ml vers compleet medium door voorzichtig pipetteren de suspensie op en neer.
- Tel de cellen met een hemocytometer en plaat ze in T-75 kolven bij een dichtheid van 2,1 x 10 6 cellen / kolf. Plaats kolf in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Controleer de cellen dagelijks op het oog en onder de microscoop. Als griepid vernieuwing nodig is, aseptisch zuigen de complete groeimedium uit de fles en gooi. Voeg gelijk volume van vers compleet medium.
- Ophalen PANC-1 GFP cellen van vloeibare stikstof. Ontdooi de flacon door voorzichtig schudden in een waterbad bij 37 ° C.
- Het uitdragen van Cellen
- Aseptisch medium te verwijderen uit de kolf. Voeg 5 ml Dulbecco's fosfaat buffer zoutoplossing (DPBS) om cellen te spoelen en gooi.
- Maak de cellen van de fles door toevoeging van 3 ml 0,25% trypsine. Incubeer kolf met trypsine bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 tot 10 minuten.
- Observeer cellen onder de microscoop (10x vergroting) en ervoor zorgen dat ze zijn rond en verdreven.
- Neutraliseren trypsine door toevoeging van een gelijk volume compleet medium en breken klonten door zachtjes en neer te pipetteren.
- Tel de cellen met een hemocytometer en het geschikte volume celsuspensie nieuwe kolven bij de in 1.2.7 genoemde celdichtheid dragen; voeg genoeg verse media, zodat het uiteindelijke volume is 10 ml per fles.
- Cell Suspension Voorbereiding voor injectie
Let op: Omdat het basaal membraan matrix, hoge concentratie, stolt bij KT, blijven alle materialen op het ijs. Plaats alle steriele pipet tips en flacons in de vriezer 's nachts, en blijf op het ijs tijdens het werken op de schorsing.- Houd een fles RPMI media zonder toevoegingen op het ijs. Ontdooi de basaalmembraan matrix, hoge concentratie, volgens de instructies van de fabrikant. Bij voorkeur aliquot in kleinere flesjes voor meervoudige vries-dooicycli 10 voorkomen.
- Zuig media van alle kolven, en spoel af met 5 ml DPBS. Herhaal alle stappen van de vorige paragraaf naar stap 1.3.4.
- Breng de inhoud met een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 125 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Transfer conische flacon bioveiligheid kast en resuspendeer pellet met 10 ml van DPBS.
- Voorzichtig pipet de schorsing op en neer te breken van de pellet. Aantal cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer opnieuw zoals uiteengezet in sTep 1.4.3. Aspireren supernatant en afhankelijk van het aantal cellen, voeg juiste verdunningsmiddel 3 x 10 6 cellen geven in een volume van 50 pl. 1 (v / v) verhouding: het verdunningsmiddel een mengsel van serumvrij medium en hoge concentratie kelder membraan matrix in een 1 zijn.
- Vortex de schorsing voorzichtig en blijf op ijs te allen tijde. De schorsing is nu klaar voor injectie.
- chirurgische Implantatie
Let op: Zorg ervoor dat alle chirurgische materialen en instrumenten zijn steriel. Oefen aseptische technieken te allen tijde.- Plaats een verwarming pad op de tafel en dek af met een steriel laken. Stel het anesthesieapparaat en zorgen voor alle benodigdheden zijn binnen handbereik.
- Plaats snuit van het dier in de anesthesie masker en het opzetten van de anesthesie tot 1 l / min zuurstof en 2,5% isofluraan.
- Voorzichtig schrobben de flank van het dier met jodium en spoelen met 70% ethanol. Herhaal dit drie keer.
- Bevestig dedier is volledig verdoofd door het afklemmen van de achterpoot. Het dier is volledig verdoofd en klaar voor de operatie als er geen reactie wordt waargenomen. Indien het dier flinches, zorgen voor voldoende anesthesie in de verdamper en dat het dier meer tijd om volledig te gaan onder narcose.
- Belasting ongeveer 200 ul van de celsuspensie in een 1,0 ml TB spuit met een 18 G naald (voorheen afgekoeld). Vervang de naald met een 27 G naald en terug te keren naar het ijs pas klaar voor gebruik.
- Zoek het algemene gebied van de milt (linker bovenste kwadrant van de buik) en met behulp van een tang neem de huid op de top van die regio. Met behulp van chirurgische schaar maken een incisie van ongeveer 1,0 cm tot een zak te maken. Evenzo neem de gladde spieren bovenop de milt en doorgesneden om toegang tot de buikholte.
- Voorzichtig pak de caudale einde van de milt en trek hem uit het lichaam. De alvleesklier is de milt worden bevestigd. Spreid de alvleesklier met een natte sterile Q-tip en zoek de staart van de alvleesklier.
- Lever de 50 pl injectie in de staart van de alvleesklier, laat de naald binnen voor 10 sec en langzaam draai de naald uit de alvleesklier. Een succesvolle implantatie zal zien als een oppervlakkige luchtbel zonder enige lekkage.
- Zet de alvleesklier en milt de buikholte. omsluiten eerst de spier en vervolgens omsluiten de huid los. Gebruik een 6-0 hechting of nieten aan de incisie te sluiten. Pijn te vermijden bij het dier toedienen ketoprofen subcutaan (SC) (5 mg / kg) gedurende 24 uur. Als alternatief, beheren buprenorfine sc (0,05-0,1 mg / kg) om de 12 uur over een 36 hr periode.
- Recover het dier verdoving en terug te sturen naar zijn kooi. Ook controleren op pijn. Dieren moeten worden voorzien pijn op het tijdstip van (of zelfs vóór - preventieve) operatie. Extra verlichting van de pijn moeten dieren die pijn volgens IACCUC-protocol of zoals voorgeschreven door de ten worden verstrektneigt dierenarts of aangewezen.
- In vivo beeldvorming
Opmerking: Afbeelding vastleggen werd uitgevoerd met een commercieel afbeeldingsysteem voorzien van een donkere kamer en de geschikte filters voor GFP beeldvorming. Afbeelding acquisitie werd uitgevoerd met behulp van een CCD-camera en een optisch systeem dat bestaat uit verwisselbare excitatie / emissie lenzen (excitatie: 455-495 nm; emissie: 513-557 nm). Helderveld beelden werden gevangen zonder filter 1 x 1 binning voor elk tijdstip. Excitatie van GFP gebruik gemaakt van een xenon multispectrale lichtbron. De dieren werden onder narcose gedurende het beeldvormende proces in stand gehouden door het verbinden van het anesthesieapparaat een gas anesthesie spruitstuk geïntegreerd in de donkere kamer van de imaging-systeem.- Verdoven het dier zoals beschreven in 1.5.2. Een anesthesie masker is binnenin de donkere kamer commerciële grafische systeem om het dier onder verdoving te houden tijdens het belichtingsproceswerkwijze.
- Stel de juiste excitatie en emissie filters.
- Begin met het verkrijgen van een eerste afbeelding met alleen wit licht. Houd dezelfde positie van het dier gedurende de opnamesessie en overschakelen naar GFP filters om een tweede opname te maken.
- Voor het beste resultaat overlappen beide beelden. Analyseer de afbeelding voor tl-gebied en intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode beschrijft een chirurgische orthotope implantatie van fluorescerende menselijke alvleesklierkanker cellen, gericht op de voorbereiding van de cel suspensie voor injectie, de juiste verdoving voor knaagdieren, levering van celsuspensie via laparotomie, en het gebruik van fluorescerende in vivo beeldvorming van kleine proefdieren. De detectie van een groene fluorescentiesignaal (GFP signaal) tussen twee en drie weken na implantatie, biedt onderzoekers een visuele aanwijzing voor de aanwezigheid van een zich ontwikkelende alvleesklier tumor (figuur 1) te bevestigen. Figuur 1 bestaat uit drie beelden van een muis met PANC-1 GFP fluorescerende tumor. De eerste is onder wit licht (Figuur 1A) genomen; de tweede opname wordt gemaakt onder de blauwe tl-licht (excitatie: 455-495 nm; emissie: 513-557 nm) om het beeld van de groene fluorescentie uitgezonden door de PANC-1 pancreas tumor (Figuur 1B); de derde is een samenstelling vande eerste twee en toont de locatie van de tumor in het lichaam van de muis (Figuur 1C). Dieren die geen tumoren GFP signaal tonen kan ontwikkelen (figuur 2). Bovendien kunnen representatieve beelden van tumorprogressie tijd niet-invasief bewaakt, door registratie van het GFP-signaal op verschillende tijdstippen (figuur 3) zijn. Figuur 3 toont verscheidene samenstellingen van GFP-signalen in de tijd. Naarmate de tijd vordert en de tumorgrootte toeneemt, het GFP-signaal toeneemt. Twintig dagen na de implantatie, wordt de tumor een kleine groene stip, en 50 dagen na implantatie, aanzienlijk tumorgrootte toeneemt. Figuur 4A toont metastasen naar de milt, lever en spijsverteringskanaal, die kan worden bevestigd nadat het dier is gedood en de organen worden verwijderd ex vivo fluorescentie beeldvorming (figuur 4B).
Figuur 2: Implantatie problemen oplossen, het ontbreken van fluorescentie Vertegenwoordiging van een muis in een tijd waar de tumor nog niet hadden ontwikkeld. (A) Beeld werd verkregen metwit licht en geen filter. (B) Beeld werd verkregen met behulp van blauw licht en specifieke filters voor GFP. (C) Een samengesteld beeld van A en B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo Real Time Fluorescent Imaging aan primaire tumor Growth Track. In vivo beeldvorming van PANC-1 GFP pancreaskanker progressie op verschillende tijdstippen na de implantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een orthotope muismodel van pancreaskanker die GFP tot expressie brengt, waardoor niet-invasieve bewaking van tumorgroei gebruik hele lichaam in vivo fluorescentie beeldvorming (figuur 1). Deze techniek kunnen we controleren de tumorontwikkeling direct (figuur 3); het kan een belangrijk instrument voor onderzoekers om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe middelen tegen alvleesklierkanker te bestuderen. Een ander belangrijk aspect van dit model is dat GFP fluorescentie geeft een visuele cue aangeeft succesvolle implantatie en de groei van pancreaskanker; die anders moeilijk te meten in levende dieren zou zijn. In overeenstemming met de klinische setting, dit model geeft een inzicht in metastase. Toont metastase naar de omliggende organen: milt, mesenterische lymfeknopen, lever en spijsverteringskanaal (figuur 4). We observeerden metastasen al 7 weken na transplantatie. PANC-1 uitzaaiingen hebben rep geweestorted in het bereik van 10 - 18 weken 11. Het tijdstip waarop metastase waargenomen kan afhangen van het aantal geïmplanteerde cellen, implantatie en visualisatietechnieken. In de huidige studie, hebben we gekozen voor een groen fluorescerend cellijn Panc-1 GFP, die in de handel verkrijgbaar is. De hier beschreven model is reproduceerbaar en de uitzaaiingen kan gemakkelijk worden gevisualiseerd, omdat ze hebben een lichte fluorescentie. Een beperking van naakt xenograft muismodellen geproduceerd gevestigde kankercellijnen is de mogelijkheid tot lagere tumor heterogeniteit vergeleken met een oorspronkelijke menselijke tumor 12; niettemin het model is reproduceerbaar, gemakkelijk te ontwikkelen en volg de voortgang in levende dieren. Bovendien xenograft muismodellen blijven op grote schaal worden gebruikt in het onderzoek naar kanker.
De fluorescent gelabelde cellen worden gepelletiseerd en opnieuw gesuspendeerd in ijskoud serumvrij medium gemengd met een gelijk volume ijskoude basaalmembraan 8. De celsuspensie moet m bedragenaintained op ijs te allen tijde te geleren of stolling te voorkomen. Het is belangrijk om de injectiespuiten met een 18 gauge naald om te voorkomen dat de cellen te lyseren laden. Als de cellen worden gelyseerd, wordt de celsuspensie nutteloos en geen tumorgroei wordt bereikt (figuur 2). Onmiddellijk na injectie, rekening met ongeveer 10 seconden voor de celsuspensie te stollen voordat de naald uit de injectieplaats. Het stollen eigenschappen van de suspensie liet ons toe om de cellen te injecteren zonder lekkage vanuit de injectieplaats. Lekkage van cellen kan leiden tot metastase als een artefact in plaats van cel verspreiding. We hebben deze orthotope implantatie van PANC-1 GFP cellijn met behulp van 3 x 10 6 cellen per 50 ul inspuiting geoptimaliseerd; andere cellijn implantaties moet empirisch worden bepaald. Grotere volumes injectie tot 100 gl met 500.000 cellen zijn in de literatuur 12. De belangrijkste parameters optimalisatie taken in aanmerking waren succesvol orthotope tumorgroei en positieve beeldvorming van de tumor via GFP fluorescentie binnen drie weken na de implantatie.
De groei en ontwikkeling tumor wordt niet alleen beïnvloed door het aantal cellen geïnjecteerd, maar ook door de leeftijd van de muizen gebruikt. Wij hebben athymische naakt muizen en vastgesteld dat het gebruik van jonge muizen in de leeftijd van 6-8 weken meer reproduceerbare resultaten oplevert ten opzichte van oudere muizen. Aangezien deze muizen leeftijd, beginnen ze enkele immuniteit die kan leiden tot afkeuring van de humane pancreatische cellen te herwinnen. De beeldvormende technieken die hier beschreven zijn niet beperkt tot orthotope gebruik; ze kunnen ook gebruikt worden voor heterotopische implantatie van tumoren. Zorg moet worden genomen om auto-fluorescentie die de tumor GFP signaal kan maskeren. Bepaalde kunststoffen gebruikt voor anesthesie buis kan automatisch fluorescerende artefacten produceren.
Fluorescerende gehele lichaam beeldvorming maakt een snelle analyse van tumorgroei en progressie 13. Een belangrijk voordeel van fluorescentie is de mogelijkheid om kanker volgen zonder de traditionele omslachtige procedures van histopathologisch onderzoek of immunohistochemie 14. Dit model heeft een heldere fluorescentie en maakt beeldacquisitie, zonder de noodzaak van de huid flappen of andere manipulaties. Fluorescentie verschilt van bioluminescentie doordat het geen licht maken op basis van een chemische reactie; absorbeert gewoon licht en reemits op een lagere frequentie. Orthotope xenograft modellen bieden onschatbare kennis en begrip van de pancreas tumor biologie, die kan worden omgezet in nieuwe therapieën voor menselijk gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189 (2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
