Abstract
El cáncer de páncreas es uno de los cánceres para los que la supervivencia no ha mejorado sustancialmente en las últimas décadas. Sólo el 7% de los pacientes diagnosticados sobrevivirá más de cinco años. Con el fin de entender y imitar el microentorno de los tumores pancreáticos, se utilizó un modelo ortotópico murino de cáncer de páncreas que permite formación de imágenes no invasiva de la progresión del tumor en tiempo real. Cáncer de páncreas células que expresan la proteína verde fluorescente (PANC-1 GFP) se suspendieron en matriz de la membrana basal, de alta concentración (por ejemplo, Matrigel HC) con medio libre de suero y luego se inyectan en la cola del páncreas a través de laparotomía. La suspensión de células en la matriz de alta concentración de la membrana basal se convierte en una sustancia similar al gel una vez que alcanza la temperatura ambiente; Por lo tanto, gelifica cuando entra en contacto con el páncreas, creando una obturación en el lugar de la inyección y la prevención de cualquier fuga de células. El crecimiento del tumor y la metástasis a otros órganos son monitoreados en vivoanimales mediante el uso de fluorescencia. Es fundamental utilizar los filtros adecuados para la excitación y emisión de GFP. Los pasos para la implantación ortotópico se detallan en este artículo que los investigadores puedan reproducir fácilmente el procedimiento en ratones desnudos. Los pasos principales de este protocolo son la preparación de la suspensión celular, la implantación quirúrgica, y todo fluorescente cuerpo de imágenes in vivo. Este modelo ortotópico está diseñado para investigar la eficacia de nuevos productos terapéuticos en tumores primarios y metastásicos.
Introduction
El cáncer de páncreas se diagnostica con mayor frecuencia en comparación con otros tipos de cáncer y es la principal causa 4º de muertes relacionadas con cáncer en los Estados Unidos. Desde el momento del diagnóstico, más del 90% de los pacientes mueren dentro de los cinco años 1,2. Actualmente, extirpación quirúrgica del tumor es la única cura para el cáncer de páncreas, pero menos del 20% de los pacientes son elegibles para someterse a una cirugía, principalmente porque en el momento del diagnóstico la enfermedad está en una etapa avanzada y se ha hecho metástasis 3,4. La falta de síntomas específicos hace que el cáncer de páncreas una enfermedad silenciosa; algunos de los síntomas incluyen dolor abdominal, dolor de espalda, pérdida de apetito, ictericia y náuseas; que puede interpretarse fácilmente como enfermedades digestivas comunes 4. Por esta razón, es importante desarrollar nuevas herramientas farmacológicas para ayudar en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de páncreas.
El uso de modelos animales nos permite comprender la biología de Pancrécáncer y ATIC da una idea de aplicar este conocimiento a los seres humanos. Ortotópico modelos de xenoinjertos de cáncer de páncreas son realistas, ya que los tumores crecen en el órgano de origen 5. En contraste con los modelos heterotópico, donde las líneas de células o fragmentos de tumor se implantaron subcutáneamente, modelado ortotópico permite la recreación del microambiente del tumor e imita la interacción de las células tumorales con su entorno 6. El modelo de xenoinjerto descrito aquí deriva tumores de la línea celular de cáncer pancreático humano PANC-1 GFP, que se manipula genéticamente para expresar la proteína fluorescente verde (GFP). Detección de GFP permite para una formación de imágenes y el seguimiento del crecimiento del tumor y la metástasis 7 no invasiva. El desarrollo de tumores se produce rápidamente, de forma espontánea, y se asemeja mucho a la de los tumores primarios de pacientes con cáncer de páncreas humano 8. modelos ortotópico proporcionan una predicción más precisa de la eficacia del fármaco en respuesta a los agentes terapéuticos, mientrasimitando el microambiente tumoral.
Como se mencionó anteriormente, este modelo animal permite la detección fluorescente de crecimiento tumoral y metástasis en tiempo real. detección fluorescente permite una imagen más directa / en vivo en comparación con la luminiscencia. Con la fluorescencia la luz emitida es el resultado de una excitación por otra luz de una longitud de onda más corta; mientras que en la luminiscencia, la luz emitida es el resultado de una reacción química y no puede tener una fuerte emisión 9. Además, todo el cuerpo de imagen fluorescente in vivo no es perjudicial para el animal y permite a los investigadores para controlar el crecimiento del tumor con el tiempo en respuesta a los tratamientos terapéuticos.
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Protocol
El protocolo se describe a continuación se ejecuta bajo la guía y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Western. Todos los experimentos se llevan a cabo de conformidad con todas las directrices pertinentes, la regulación y las agencias reguladoras.
1. Cultura de la célula
- Preparación de medio completo
- El uso de una cabina de seguridad biológica de Clase II, preparar medio completo mediante la adición aséptica de suero bovino fetal (FBS) y penicilina estreptomicina (P / S) a una botella de 500 ml de medio RPMI. Mezclar suavemente por agitación. La concentración final de cada suplemento es / S (v / v). 10% de FBS y 1% P Por ejemplo, como complemento a 500 ml de medio con 56 ml de FBS y 6 ml P / S.
- Coloque medio completo en un baño de agua a 37 ° C.
- Descongelación y células de multiplicación
- Recuperar las células PANC-1 GFP de nitrógeno líquido. Descongelar el vial por agitación suave en un baño de agua a 37 ° C.
Nota:La descongelación debe ser rápida (aproximadamente 2 - 3 min). - Etiqueta matraces T-75 para ser utilizado con (a) el nombre de la línea celular, la fecha (b) el número de pases, (c), y las iniciales (d) del investigador.
- Limpiar el vial con 70% de etanol y el vial de transferencia a una cabina de bioseguridad.
- Para propagar las células, añadir 9,0 ml de medio completo a un tubo cónico de 15 ml. Usando una pipeta 1,0 ml, transferir cuidadosamente la suspensión de células y suspender en 9 ml de medio completo.
- Centrifugar a 125 xg durante 8 minutos a TA. Transferir el vial cónica a una cabina de bioseguridad y aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
- Se suspende el precipitado en 10 ml de medio completo nuevo pipeteando suavemente la suspensión de arriba a abajo.
- Contar las células con un hemocitómetro y la placa en matraces T-75 a una densidad de 2,1 x 10 6 células / matraz. Colocar el frasco en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
- Supervisar las células diariamente por ojo y bajo el microscopio. Si la gripeIdentificación del que se necesita renovación, asépticamente aspirar el medio de crecimiento completo del matraz y se descarta. Añadir un volumen igual de medio completo fresco.
- Recuperar las células PANC-1 GFP de nitrógeno líquido. Descongelar el vial por agitación suave en un baño de agua a 37 ° C.
- La propagación de las células
- Asépticamente eliminar medio del matraz. Añadir 5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para enjuagar las células y desechar.
- Separar las células del matraz mediante la adición de 3 ml de 0,25% de tripsina. Incubar matraz que contenía tripsina a 37 ° C y CO 2 al 5% durante 5 a 10 min.
- Observar las células bajo el microscopio (aumento de 10X) y asegurarse de que son redondos y desalojado.
- Neutralizar la tripsina mediante la adición de un volumen igual de medio completo y romper los grumos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Contar las células usando un hemocitómetro y transferir el volumen de suspensión celular apropiada a nuevos matraces en la densidad celular se menciona en 1.2.7; añadir una cantidad suficiente de medio nuevo por lo que el volumen final es de 10 ml por frasco.
- Suspens celularesPreparación de iones para Inyección
Nota: Dado que la matriz de la membrana basal, alta concentración, se solidifica a temperatura ambiente, mantener todos los materiales en el hielo. Coloque todos los puntas de pipeta estériles y viales en el congelador durante la noche, y mantener en hielo mientras se trabaja en la suspensión.- Mantenga una botella de medio RPMI sin ningún tipo de aditivos en el hielo. Descongelar la matriz de la membrana basal, alta concentración, siguiendo las instrucciones del fabricante. Preferiblemente, alícuota en viales más pequeños para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación 10.
- Aspirar los medios de comunicación de todos los frascos, y enjuague con 5 ml de DPBS. Repita todos los pasos en la sección anterior hasta el paso 1.3.4.
- Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 125 xg durante 8 minutos a TA. Transferir vial cónico de cabina de bioseguridad y volver a suspender el uso de pellets 10 ml de DPBS.
- pipeta suavemente la suspensión arriba y hacia abajo para romper la pastilla. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
- Centrifugar de nuevo como se indica en sTEP 1.4.3. Aspirar el sobrenadante y en función del número de células, añadir diluyente apropiado para producir 3 x 10 6 células en un volumen de 50 l. El diluyente será una mezcla de medio libre de suero y la alta concentración de membrana de matriz en un sótano 1: (v / v) relación 1.
- Vórtex con la suspensión suavemente y mantener en hielo en todo momento. La suspensión está ahora lista para la inyección.
- implantación quirúrgica
Nota: Asegúrese de que todos los materiales e instrumentos quirúrgicos son estériles. Practicar técnicas asépticas en todo momento.- Coloque una almohadilla térmica sobre la mesa y cubrir con un paño estéril. Configurar la máquina de anestesia y garantizar todos los suministros están al alcance de la mano.
- Coloque el hocico del animal en la máscara de anestesia y configurar la anestesia a 1 l / min de oxígeno y 2,5% de isoflurano.
- Frote suavemente el costado del animal con yodo, y enjuagar con etanol al 70%. Repetir tres veces.
- Confirmar laanimal esté totalmente anestesiado pellizcando la pata trasera. El animal es anestesiado completamente y listo para la cirugía si no se observa respuesta. Sin embargo, si el animal se estremece, asegurarse de que hay suficiente anestesia en el vaporizador y permitir que el animal más tiempo para ir completamente bajo anestesia.
- Cargar aproximadamente 200 l de la suspensión celular en una jeringa de 1,0 ml de TB con una aguja de 18 G (previamente enfriada). Vuelva a colocar la aguja con una aguja de 27 G y volver al hielo hasta que esté listo para su uso.
- Localizar el área general del bazo (cuadrante superior izquierdo del abdomen) y el uso de fórceps pellizcar la piel en la parte superior de esa región. Usando tijeras quirúrgicas hacer una incisión de aproximadamente 1,0 cm para crear un bolsillo. Del mismo modo, apretar el músculo liso en la parte superior del bazo y cortar a través con el fin de acceder a la cavidad peritoneal.
- agarrar suavemente el extremo caudal del bazo y tire de ella fuera del cuerpo. El páncreas se adjuntará al bazo. Difundir el páncreas usando una st húmedaerile Q-tip y localizar la cola del páncreas.
- Entregar la inyección de 50 l en la cola del páncreas, deje la aguja en el interior durante 10 segundos y gire lentamente la aguja del páncreas. Un éxito de la implantación se verá como una burbuja superficial sin cualquier fuga.
- Devolver el páncreas y el bazo a la cavidad peritoneal. En primer lugar encerrar el músculo y luego encerrar la piel por separado. Utilice una sutura o grapas 6-0 para cerrar la incisión. Para evitar el dolor en el animal, administrar ketoprofeno por vía subcutánea (SC) (5 mg / kg) durante 24 hr. Alternativamente, administrar sc buprenorfina (0,05 hasta 0,1 mg / kg) cada 12 horas durante un período de 36 horas.
- Recuperar el animal de la anestesia y devolverlo a su jaula. También tiene que controlar el dolor. Los animales deben estar provistos de alivio del dolor en el momento de (o incluso antes - preventivo) de la cirugía. el alivio del dolor adicional debe ser proporcionada a los animales que experimentan dolor según IACCUC protocolo o según lo prescrito por el altendiendo veterinario o persona designada.
- En imágenes in vivo
Nota: la captura de imágenes se realizó usando un sistema de formación de imágenes comercial equipado con una cámara oscura y los filtros adecuados para formación de imágenes GFP. La adquisición de imágenes se realizó utilizando una cámara CCD y un sistema óptico que consiste en lentes intercambiables de excitación / emisión de excitación (455 - 495 nm de emisión; 513 - 557 nm). imágenes de campo claro fueron capturados sin un filtro a 1 x 1 binning para cada punto de tiempo. La excitación de GFP utiliza una fuente de luz de xenón multiespectral. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante todo el proceso de formación de imágenes mediante la conexión de la máquina de anestesia a un colector de anestesia de gas integrado en la cámara oscura del sistema de imagen.- Anestesiar al animal como se indica en 1.5.2. Una máscara de anestesia se encuentra en el interior de la cámara oscura del sistema de imagen comercial con el fin de mantener al animal bajo anestesia durante la formación de imágenesproceso.
- Configurar los filtros de excitación y emisión correctas.
- Comience por la obtención de una imagen inicial utilizando sólo la luz blanca. Mantener la misma posición del animal durante toda la sesión de imágenes y cambiar a los filtros de GFP para tomar una segunda imagen.
- Para obtener los mejores resultados se superponen las dos imágenes. Analizar la imagen para el área de fluorescencia e intensidad.
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Representative Results
Este método describe un implante ortotópico quirúrgica de las células cancerosas pancreáticas humanas fluorescentes, centrándose en la preparación de la suspensión de células para la inyección, la anestesia adecuada para los roedores, la entrega de la suspensión celular a través de laparotomía, y el uso de formación de imágenes fluorescente animal in vivo pequeño. La detección de una señal verde de fluorescencia (señal GFP) entre dos y tres semanas después de la implantación, proporciona a los investigadores una señal visual para confirmar la presencia de un tumor de cáncer de páncreas en desarrollo (Figura 1). La figura 1 consta de tres imágenes de un ratón con PANC-1 GFP tumor fluorescente. El primero está hecho con luz blanca (Figura 1A); la segunda imagen es tomada bajo luz fluorescente azul (excitación 455 - 495 nm; emisión de 513 - 557 nm) a la imagen de fluorescencia verde emitida desde la PANC-1 tumor pancreático (Figura 1B); el tercero es un compuesto delos dos primeros y muestra la localización del tumor dentro del cuerpo del ratón (Figura 1C). Los animales que no desarrollan tumores no muestran señal de GFP (Figura 2). Además, las imágenes representativas de la progresión del tumor en el tiempo puede ser monitoreada de forma no invasiva, mediante la grabación de la señal de GFP en diferentes puntos de tiempo (Figura 3). La Figura 3 muestra varios materiales compuestos de señales de GFP con el tiempo. A medida que pasa el tiempo y que aumenta el tamaño del tumor, la señal aumenta GFP. Veinte días después de la implantación, el tumor aparece como un pequeño punto verde, y 50 días después de la implantación, aumenta el tamaño de tumor significativamente. La Figura 4A muestra las metástasis en el bazo, el hígado y el tracto gastrointestinal, que puede ser confirmada después de que el animal ha sido sacrificados y los órganos se eliminan para formación de imágenes ex vivo fluorescente (Figura 4B).
Figura 2: Implantación de solución de problemas, la falta de fluorescencia Representación de un ratón en un momento en que el tumor no se había desarrollado:. (A) La imagen fue obtenida conluz blanca y sin filtro. (B) La imagen se obtuvo utilizando la luz azul y filtros específicos para GFP. (C) Una imagen compuesta de A y B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: En vivo en tiempo real de imágenes fluorescente para seguir el crecimiento del tumor primario. En imágenes in vivo de la PANC-1 GFP progresión del cáncer de páncreas en diversos puntos temporales después de la implantación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se describe un modelo murino ortotópico de cáncer de páncreas, que expresa GFP, lo que permite la monitorización no invasiva del crecimiento tumoral usando el cuerpo entero en imágenes fluorescentes vivo (Figura 1). Esta técnica nos permite monitorear el desarrollo de tumores en tiempo real (Figura 3); puede ser una herramienta importante para los investigadores estudiar la eficacia terapéutica de nuevos fármacos contra el cáncer de páncreas. Otro aspecto importante de este modelo es que la fluorescencia de GFP proporciona una señal visual que indica la implantación y el crecimiento de cáncer de páncreas éxito; lo que de otro modo sería difícil de medir en animales vivos. En consonancia con el contexto clínico, este modelo proporciona una visión sobre la metástasis. Muestra la metástasis a los órganos circundantes: el bazo, los ganglios linfáticos mesentéricos, hígado y tracto gastrointestinal (Figura 4). Hemos observado metástasis tan pronto como 7 semanas después del trasplante. PANC-1 metástasis han sido reported en el intervalo de 10 - 18 semanas 11. El momento en que se observa metástasis puede depender del número de células implantadas, la implantación y técnicas de visualización. En el presente estudio, se optó por una línea verde fluorescente de células, PANC-1 GFP, que está disponible comercialmente. El modelo descrito aquí es reproducible y las metástasis se pueden visualizar fácilmente porque tienen fluorescencia brillante. Una limitación de xenoinjerto nude modelos de ratón producidos a partir de líneas celulares de cáncer establecidas es la posibilidad de la heterogeneidad tumoral reducido en comparación con un tumor humano original 12; sin embargo, el modelo es reproducible, fácil de desarrollar y seguir su progreso en animales vivos. Por otra parte, los modelos de xenoinjerto en ratones siguen siendo utilizados ampliamente en la investigación del cáncer.
Las células marcadas fluorescentemente se deben peletizaron y se resuspendieron en medio libre de suero frío hielo mezclado con un volumen igual de helado de membrana basal 8. La suspensión de células debe ser maintained en hielo en todo momento para evitar la gelificación o solidificación. Es importante para cargar las jeringas con una aguja de calibre 18 con el fin de evitar la lisis de las células. Si se lisan las células, la suspensión de células se vuelve inútil, y no el crecimiento del tumor se logrará (Figura 2). Inmediatamente después de la inyección, permita aproximadamente 10 seg para la suspensión de células se solidifique antes de retirar la aguja del lugar de inyección. Las propiedades de solidificación de la suspensión permitieron inyectar las células sin pérdidas en el lugar de la inyección. La fuga de las células puede dar lugar a metástasis como un artefacto y no de difusión celular. Hemos optimizado esta implantación ortotópico de PANC-1 línea de células GFP usando 3 x 10 6 células por 50 l de inyección; otras implantaciones de líneas celulares deben determinarse empíricamente. Los mayores volúmenes de inyección de hasta 100 l que contenía 500.000 células han sido reportados en la literatura 12. Los principales parámetros de optimización taken en cuenta tuvieron éxito el crecimiento del tumor ortotópico y visualización de tumores positivos a través de la fluorescencia de GFP en las tres semanas después de la implantación.
El crecimiento y el desarrollo de tumores no sólo se ve afectada por el número de células inyectadas, sino también por la edad de los ratones utilizados. Hemos utilizado ratones desnudos atímicos y se determinó que el uso de ratones jóvenes entre las edades de 6 a 8 semanas rinde resultados más reproducibles en comparación con los ratones de más edad. Como estos ratones edad, comienzan a recuperar algo de inmunidad que puede resultar en el rechazo de las células pancreáticas humanas. Las técnicas de imagen descritos aquí no se limitan a uso ortotópico; También se pueden utilizar para la implantación heterotópico de tumores. Se debe tener cuidado para evitar la auto-fluorescencia que puede oscurecer la señal de GFP tumor. Ciertos plásticos utilizados para la tubería de la anestesia pueden producir artefactos de auto-fluorescente.
Formación de imágenes de todo el cuerpo fluorescente permite el análisis rápido de crecimiento del tumor y la progresión de la 13. Una ventaja importante de la utilización de la fluorescencia es la capacidad de realizar un seguimiento de cáncer sin los procedimientos engorrosos tradicionales de examen histopatológico o inmunohistoquímica 14. Este modelo cuenta con fluorescencia brillante y permite la adquisición de imágenes sin necesidad de colgajos de piel u otras manipulaciones. La fluorescencia se diferencia de la bioluminiscencia en el que no crea la luz basado en una reacción química; simplemente absorbe la luz y vuelve a emitir a una frecuencia más baja. modelos de xenoinjertos ortotópico proporcionan el conocimiento y la comprensión de la biología del tumor de páncreas que puede traducirse en nuevas terapias para el uso humano de gran valor.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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