Introduction
In vitro doku, organ veya sistemlerin çalışma çok hücreli organizmaları oluşturan çeşitli hücresel alt tipleri arasındaki mevcut çok karmaşık ilişkileri kolaylaştırmak için bir girişimdir. Nitekim, in vitro çalışmalar mümkün tek hücre popülasyonlarının ayrıntılı bir anlayış elde etmek için yapmak. 1) kolayca hücresel ortamı manipüle 2) yeteneği hücresel etkileşimleri azaltılmış ve: in vitro deneylerde iletken iki temel avantajı vardır. Bu nedenle, bu iki avantajı izin bilim adamları, tüm organizmalarda dış etkilerin sonuçları düzenleyen potensitesi, in vivo spesifik hücre tiplerinin davranışını tahmin etmek. Bu anlamda, in vitro hücre kültürü genellikle temel ve uygulamalı yaşam bilimleri bağlayan bir köprü görevi görür. Bununla birlikte, in vitro çalışma birkaç dezavantajları da vardır, en önemlisi belli bir rezervasyon fizyolojik yaşamak olabilir varlık olduğunugözlenen fenotipleri al alaka. Gerçekten de, tek bir hücre tipi, bir kap içinde büyütüldüğü zaman, kültür bir değişik ölçüde kaybeder, diğer hücre tipleri, doku ve menşe organizmanın ve çapa içinden hümoral ortam katkısı ile hücre-hücre bağlantıları bunu etkin doku hücre fonksiyonu için bazen çok önemli bir belirli üç boyutlu yapıyı korumak için.
Hücre-hücre ilişkileri sorunu karışık kültür teknikleri geliştirilmesi yolu ile ele alınmıştır. Bu yöntemde, iki ya da daha fazla hücre popülasyonları aynı kültür kabı içinde bir araya büyütülür. Ancak, bu karışık kültürler önemli sakıncaları taşımaktadır. Bir yandan, bazı hücre alt tipi fiziksel kaynaklı doku birbiriyle etkileşmeyen ve salgılanan çözünür faktörlerin ve yakın reseptörleri tarafından sürekli parakrin iletişim itimat. Bu yakın sitokin sinyal bağımlı enflamatuvar süreçler için de geçerlidir. Karışık c'deultures, fiziksel etkileşimleri kaçınılmaz ve imkansız değişmiş sonuçlar verebilir hücre-hücre temas yokluğunda parakrin iletişim çalışma yapmak. Öte yandan, karışık bir popülasyon içinden hücreye özel yorumlara elde sonuçları önemli ölçüde etkileyebilecek sert ayırma tekniklerinin kullanımı olmadan olanaksız hale gelir.
Bu önemli sorunları çözmek için, şartlandırılmış medya kullanımı bölümlere kültür ve parakrin sinyalizasyon çalışması için izin veren bir teknik olarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, hücrelerin bir popülasyonu içeren tüpler bir hücre tipi, bu şekilde durumunu adlandırılmış ortamının üstte yüzen transferini gerektirir. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, kısa ömürlü moleküllerin hücre ikinci nüfusun oyuklarına transfer edilmesi şartına ortam içinde yeterince uzun süre hayatta kalmamasıdır. Hatta uzun ömürlü moleküller büyük ölçüde nedeniyle difüzyon zamanla seyreltilmiş edilecektir. Bundan başka, her iki hücrepopülasyonlar sadece tek yönlü parakrin iletişim ziyade aktif çift yönlü iletişim katılmak. Bu da in vivo var gibi doğru çok hücreli ilişkileri yeniden hayati önem taşımaktadır geribildirim sinyalizasyon olmaması yol açar.
Bunun bir sonucu olarak ve daha iyi in vitro hücre ortamında in vivo koşullarında orijinal simüle etmek için ihtiyacı ile, hücre kültürü teknikleri çeşitli gelişmeler yılda elde edilmiştir. En önemli gelişmeler biri 1953 yılında Grobstein tarafından ilk defa kullanılan hücre kültürleri bölümlere yönelik mikro gözenekli membran ile geçirgen desteklerin kullanımı olmuştur 1. Böyle geçirgen destekler çok sayıda hücre tiplerini barındırmak için ve kullanılacak yılda uyarlanmış olan çeşitli uygulamalarda kullanılır. Günümüzde, bu desteklerin bir multiwell doku kültürü plaka veya Circu kuyulara dinlenmek için tasarlanmış gibi içi boş ekler varlar yemekler. Bir ko-kültür sisteminde, uç oyuk ise bir hücre türü içeren ya da tabak da vücut sıvısı ortamı (Şekil 1) iki farklı hücre popülasyonlarının katkı çalışma sağlayan diğer hücre popülasyonu içerir. Bunun bir sonucu olarak, (apikal salgılama ya da sinyal alımı vs bazolateral), hücre kutup ve böylece karışık kültürler ve koşullandırılmış ortam tekniklere kıyasla uç ko-kültür sistemleri önemli bir avantaj kazandıran, korunur. Membran malzemelerin çeşitli türleri mevcuttur en yaygın olanları olan polyester (PET), polikarbonat (PC) veya kollajen kaplı politetrafloroetilen (PTFE), bunlar 0.4 um ila 12.0 um arasında değişen farklı gözenek boyutları vardır ve. malzeme ve delik boyutlarının Bu çeşitler ile sınırlı değildir kullanan aşağıdaki için farklı seviyelerde elverişli olmaları optik özellikleri, membran kalınlığı ve hücre yapışmasına alakalı değişken özellik uygulayan insert tayfı sunar:
-ders çalışıyorHücre farklılaşması, embriyonik gelişim, tümör metastazı ve geçirgen membran vasıtasıyla chemotaxic deneyleri ile yara iyileşmesi;
epitel ya da endotel mono tabakaları yoluyla ulaşım değerlendirerek ilaç penetrasyonunu -evaluating geçirgen desteklerde kültüre ve;
intikallerde hücresi ko-kültürler, hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin neden olduğu hücre davranışı modülasyonlar analiz.
Bu çalışmanın amacı, bir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörler aracılık ettiği hücresel değişiklikleri değerlendirmek için yukarıda belirtilen üçüncü fonksiyon yerine getirmek için, genel yöntem yönergelere tanımlamaktır. Araştırmanın Birkaç farklı alanları hücre popülasyonları üzerinde salgılanan çözünür faktörlerin etkisiyle ilgili soruları cevaplamak için insert ko-kültür sistemlerinin kullanımını sağlamak. çeşitli düzeylerde hücresel davranışı modüle Nitekim, parakrin sinyal bütün dokularda uygun olupve insert ko-kültür sistemleri yapan sistemler, bu alanlarda gelişmeler sağlamak için vazgeçilmezdir. Bunun aksine, bu sinyal transdüksiyonunu onaylayabilir insertlerin kullanımı doğrudan hücre-hücre teması yoluyla olup salgılanan faktörler gereğidir. Insertlerin en önemli kullanım alanlarından biri salgılanan sitokinlerin etkileri bağışıklık çeşitli hücresel oyuncu değerlendirilir inflamasyon çalışmaları 2-14 bulunmaktadır. Özellikle, merkezi sinir sistemi (MSS) inflamasyon çalışma büyük ölçüde daha iyi nöro-inflamasyonu 15-21 sürüş nöronlar ve mikroglia farklı parakrin rollerini tanımlamaya izin insert ko-kültür çalışmaları, kazanç olmuştur. Bu sistemler de azaltmak ya da pro-enflamatuar faktörler 22-26 sekresyonunu inhibe etme kabiliyetleri dayanır moleküllerin, anti-inflamatuar potansiyelinin çalışma devreye sokuldu. Araştırma mekanizmaları, özellikle kanser 27-31 ilişkin anjiyogenez 32-34 ve inflammati altında yatantümörigenezinde 35-42, bu aynı zamanda insert ko-kültür sistemleri yararlanır. Ayrıca, çözünür faktörler farklılaşma ve çeşitli çalışmalar söz konusu alanda 43-50 sorulara cevap ekler kullandık sürücü süreçlerde birinci derecede öneme sahiptir. MSS nöral doku olarak görmeye çok sınırlı bir yenilenme potansiyeli, neurotrophism çalışma vardır ve nöro temel ve yaygın ko-kültür sistemleri 51-56 kök hücrelerin kullanımı ile sağlanmıştır. Buna ek olarak, ekler de nefroloji 57,58, endotel etkileşimleri ve anjiyogenez 59-62, apoptoz obezite ve metabolik sendrom 22,23,66-67 yılında 63-65, inflamasyonu sinyalizasyon, iç kulak saç hücre koruması gibi çok farklı alanlarda kullanılmaktadır 68,69 ve hatta mantar virulans 70,71 ve Parazitoloji 72,73 yılında.
Bu makalede, bir experim kurmak için genel metodolojik kurallar sunmaktadırBir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak salgılanan çözünür faktörler tarafından aracılık hücresel değişikliklerin değerlendirilmesi açısından ent. Özellikle, sinir hücresi ko-kültür ve nöro sürecini inceleyerek kendi kullanımları hakkında dikkatimizi durulacak. pilota mümkün kılacak ekler deneyler çok geniş bir spektrum göz önüne alındığında, hücre kültürü tekniğinin her yönüyle kapsayacak şekilde dayanılmaz. Bir örnek olarak, belirli bir protokol uç ko-kültür yöntemi somut bir anlayışı sunan, detaylı olarak açıklanacaktır lipopolisakarit (LPS) tarafından salgılanan sitokinlerin etkileri nöronal PC 12 hücreleri üzerinde N9 mikroglia -etkinleştirilmiş ölçülmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: memeli hücresi kültürü için gerekli olan, aşağıdaki adımların her biri, bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Buna ek olarak, optimum steril hücre ekimi için genel kurallar uygulanır, örneğin., Ipuçları her zaman onlar, çapraz kontaminasyon neden zaman hücrelerinin miktarını azaltarak olabilir atarak düzgün, tüm medya değişiklikleri gerçekleştirme ama nazikçe tüm karıştırarak zaman havaya maruz kalan hücre süspansiyonları Ayrıca, ekler, özel işlem gerektiren plasticware bir tür vb onların homojen pipetleme sağlamak için. ekler manipüle edildiği anda Birincisi, kolayca gözyaşları ve bu nedenle deney tehlikeye atabilecek kırılgan membran, dokunmaktan kaçının. membran delme veya yapışık hücreler ayrışan bir riski olduğu için aynı zamanda, hücre kültür ortamı vakum aspirasyonun yapılması için uygun değildir. Daha sonra, uçlar ve böylece, dikkatli olduğunda mo kullanılması gerekir, çukurlu doku kültürü plakasına gevşek asmak veplasticware Ving veya yapışık hücrelere dissociating önlemek için pipetlerken zaman. büyük gözenek boyutları ile ekler kullanarak Buna ek olarak, hücre kültürü ortamı, bu nedenle, sıklıkla sıvı seviyesinin izlenmesi önemlidir, membrandan girer ve bu olasılığı vardır. Son olarak, aşağıdaki protokol yapışık hücreler için tasarlanmış ve süspansiyon hücreleri için uygun olmak için küçük değişiklikler gerektirir unutmayın.
insert ko-kültür deneyler için 1. Genel kurallar
- ekler de tohumlama hücre tipi 1.
- kendi ambalajından ekler kakışıyor.
- Uygun boyut boş çukurlu doku kültürü plakasına uçlar yerleştirin. cımbız kullanarak ucun üst kenarı, yani kavrama yapmak.
- eki iyileştirmek ve yapışan hücrelerin yayılması tohumlanmasından önce hücre kültür ortamı ile uçlar koşulu. Bunu yapmak için, hücre kültürü Mediu'nun zarın tüm yüzeyini kaplayanMikropipet kullanıyorum.
NOT: Gerekli olduğu kadar çok uçlar için bunu yapın. - Plaka kapağını çıkarın ve aynı koşullar altında en az 1 saat ya da O / N inkübe (genellikle 37 ° C,% 5-10 CO2).
- ekler klimalı zaman, bir mikropipet kullanarak hücre kültür ortamında bütün çıkarın. kullanılan orta atın.
- çok oyuklu bir plaka ile aynı şekilde taze hücre kültür ortamı içinde tohum hücre tipi 1.. Bunu yapmak için, bir mikropipet ile hücre süspansiyonu uygun bir hacmi çizip ekine sıvısının dağıtılması.
NOT: Gereken gibi birçok ekler hazırlayın. - Bütün ekler tohumlama sonra, yavaşça hücreler eşit dağıtmak için daha sonra ileri geri, sol ve sağ plaka sallayın. Bu hücreler ekler merkezinde birikmesine neden olacağından, dairesel hareketler yapmaktan kaçının.
- plaka kapağı yerleştirin ve hücresel gereksinimleri (genellikle 37 ° C olarak başına,% 5-10 CO tarafından belirtildiği gibi kuluçkaya
- çukurlu doku kültür plakaları içinde Tohum hücre tipi 2.
- Bölüm 1 'e göre olan yeni hücre kültürü ortamı içinde tohum hücre tipi 2..
- insertlerin sayısı için gerekli olduğu kadar çok sayıda çukur hazırlayın. Hücreler eşit kuyularda dağılmasını sağlamak için adım 1.1.7 gibi plakası) sallayın.
- Plaka kapağı yerleştirin ve aynı koşullar altında inkübe (genellikle 37 ° C,% 5-10 CO2).
- ekler ferahlatıcı ortam
- Mikropipet kullanarak, hücre tipi 1. ihtiva eden ekler, kısmen ya da hücre kültür aracı kaldırmak. kullanılan orta atın.
- Taze hücre kültür ortamında uygun bir hacmi çizin. Yavaşça insertin iç duvarı üzerinde ucu kalan yavaşça hücre kültür ortamı dağıtmak.
- plaka kapağı yerleştirin ve adım 1.1.4 başına kuluçkaya yatmaktadır.
- çukurlu doku kültür plakaları içinde serinletici orta
- Bir micropi kullanılmasıPette, kısmen ya da hücre tipi 2. içeren oyuklara hücre kültür ortamının kaldırmak. kullanılan orta atın.
- Taze hücre kültür ortamında uygun bir hacmi çizin. oyuk iç duvarı üzerinde ucu istirahat yavaşça hücre kültür ortamı dağıtmak.
- plaka kapağı yerleştirin ve daha önce kurulmuş hücre kültürü protokollerine göre kuluçkaya yatmaktadır.
- Hücre tipi 2. içeren çukurlu doku kültürü plakalarına hücre tipi 1. içeren insert aktarılması.
NOT: Her iki hücre tipleri uygun büyüme aşamasına ulaştığınızda bu adımı gerçekleştirin.- Daha önce adımlar 1.3) ve 1.4 de tarif edildiği gibi oyuklara eklediği aktarılması önce), gerekli ortam değişiklik yapın.
Not: Bu noktada, ekleme, üretici talimatlarına göre belirlenen, her iki bölme içinde uygun ortam hacimleri dağıtılması için önemlidir. - kavrama, hücre t içeren bir ekin üst kenarını cımbız kullanarak1. ype ve yavaşça 2 uygun iyi içeren hücre tipi # yerleştirin.
- Tüm ekler aktardıktan sonra, insert zarının altında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Hava kabarcıkları ucun zarından herhangi değiştirilmesini engelleyecek ve tüm deney tehlikeye atabilir. - Hava kabarcıkları varsa, çok nazikçe iyi kullanan cımbız gelen parçayı kaldırın ve geri hücre kültürü ortamında atılmak. kabarcıklar kaybolur. onlar hala varsa, bir açıda geri hücre kültür ortamına ekler daldırma yavaşça deneyin.
NOT: vurmak ya da yapışık hücrelere dissociating önlemek için ekler karıştırın etmeyin. - tüm hava kabarcıklarını kaldırılması ve her iki bölümlerinde medya hacimleri, plaka kapağı yerleştirin ve inkübe olduğunu kontrol ettikten sonra.
- Daha önce adımlar 1.3) ve 1.4 de tarif edildiği gibi oyuklara eklediği aktarılması önce), gerekli ortam değişiklik yapın.
- bir ko-kültür sisteminde serinletici ortam
NOT: Membran kolayca ekleme arasında medya alışverişi izin verse ve iyi, orta serinletici yapılırTek başına difüzyon ile üst ve alt bölümlerinde dengeye ulaşmak için gerekli zamandan beri hem bölmeler oldukça uzun olabilir.- Hücre tipi 1. ihtiva eden ekler de serinletici ortamı adım 1.3) de aynı şekilde yapılır.
- Hücre tipi 2. içeren kuyularda orta yenilemek için hafifçe pipet karşılamak için yeterince geniş bir alan oluşturmak için yan ekleme kaydırın. ) Adım 1.4 olarak orta yenileyin.
- ) Hava kabarcıklarının varlığı için kontrol edin ve 1.5.5 arasındaki adımları 1.5.3 başına hacim) doğrulayın.
2. Örnek: nöronal PC12 hücreleri üzerindeki LPS aktive N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinlerin etkilerini ölçen
Not: Aşağıdaki adımlar de belirli bir şişeye, ve çanak boyutları için tasarlanmıştır. Ancak, protokol herhangi plasticware boyutları için özelleştirilebilir. medya ve kompozisyon malzemeler Tablosuna bakınız.
- Tohumlama ve çoklu PC12 hücreleri ayırtoyuklu doku kültürü plakaları
- Sıcak rutin PC12 hücre kültür ortamı, 37 ° C su banyosu içinde PC12 farklılaşma orta ve tripsin-EDTA.
- 75 cm 2 şişeden% 60-80 izdiham PC12 hücreleri kullanın.
- 15 mm'lik bir Pasteur pipeti ile bir şişe içinde, tüm hücre kültür ortamında vakum aspirasyonun yapılması.
- Yavaşça steril fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml ile hücre mono tabakasının yıkayın ve Pasteur pipeti ile sıvıyı ayırın. Bu aşamada hücreleri ayırmak için dikkatli olun.
- Tripsin-EDTA, 3 ml ile hücre mono tabakasının kapatın ve 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübe edin.
- tüm hücreleri mikroskop altında müstakil emin olun. Çok az sayıda hücre yüzen ise, 5 dakikalık bir süre için daha uzun bir süre için inkübe edilir.
- Tripsin-EDTA inaktive etmek üzere rutin PC12 hücre kültür ortamında 10 ml.
- En hücreler o alttan ayrışmış emin yaparken bir 10 ml pipet ile hafifçe çiğnemekşişeye f. hücre süspansiyonu hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- Aynı 10 mi pipet ile 50 ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu aktarın.
- 3.200 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj
- pelet rahatsız etmemek için özen gösterilirken Pasteur pipeti ile süpernatant atın.
- 10 ml'lik bir pipet ile rutin PC12 hücre kültür ortamında 10 ml.
NOT: pelet normalden daha küçük ya da büyük olması durumunda bu hacim ayarlanabilir. - Pelet homojenize aynı 10 mi pipet ile toz haline getirin. PC12 hücreleri genellikle yukarı pipetle en az 20 yüzden bir araya gelme ve gerekli downare.
NOT: dinç öğütülerek gerekli olmakla birlikte, hücre süspansiyonu hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. - 1.5 ml tüp içinde, tripan mavisi hücre süspansiyonu uygun bir seyreltme hazırlar. Daha önce kurulmuş protokollere 74 göre bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Ayrı bir 50 ml tüp içinde, bir hücre süspansiyonu bölünmüşPC12 farklılaşma ortamı ile 24 oyuklu plaka (30,000 ¢ / cm2, de üreticinin protokolüne uygun olarak her 0.6 mi) kuyu tohumlama için seyreltilmiş hücre süspansiyonu uygun olan elde edildi.
Not: Daha önceki çalışmalarda protokolleri 75 tarafından belirtildiği gibi, 24 oyuklu bir plaka, daha önce kollajen ile kaplanmalıdır. - iyi bir mikropipet kullanarak başına hücre süspansiyonu 0.6 ml dağıtın.
- tüm kuyuları numaralı seribaşı olduğunda,) adım 1.1.7 deki gibi plaka sallayın.
- PC12 hücrelerinin diferansiyasyon, ko-kültür deneyleri yapmadan önce PC12 farklılaşma ortamda 15,16 bir% 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C'de 7-9 gün süre ile 24 oyuklu plakalar inkübe izin verilmesi.
- Sıvının yarısının çıkarılması ve taze PY12 farklılaştırma ortamının eşit hacimde değiştirerek, her gün ortam değişiklikleri gerçekleştirme.
- ekler de N9 mikroglia tohumlama ve LPS ile tedavi
- Bir gün ko-kültür deneyleri yapmadan önce, 1.1.4 adımda 1.1.1) sonra, hücre yapışmasını optimize etmek için rutin N9 hücre kültür ortamı ile PTFE 0.4 um gözenekli ekler ön tedavi)
- 37 ° C bir su banyosunda ılık rutin N9 hücre kültür ortamı ve tripsin-EDTA.
- Bu sırada, daha sonra kullanılmak üzere, 1.5 ml bir tüp içinde LPS'nin yaklaşık 10 mg ağırlığında.
NOT: LPS güçlü bir pro-inflamatuar endotoksin ve özellikle güvenlik önlemleri, gözlük, eldiven gerektirir ve bir partikül maske şiddetle tavsiye edilir beri. - 75 cm 2 şişeden% 80-90 izdiham N9 hücreleri kullanın.
- ) 2.1.14 adımları 2.1.3) izleyin. Her zaman rutin N9 hücre kültür ortamı yerine rutin PC12 hücre kültür ortamı kullanın. Ayrıca) N9 mikroglia kadar PC12 hücreleri gibi birlikte çok daha az pipetleme yukarı kümelenir yoktur ve aşağı adım 2.1.13 gerekli olabileceğini unutmayın.
- Ayrı bir 50 ml tüp içinde, N9 hücre kültürü ortamı ile bir hücre süspansiyonu O split24 oyuklu plakalar içinde tutmak için tasarlanmış ekler (60,000 ¢ / cm2, üreticinin protokolüne uygun olarak uç başına 0.05 mi, zar yüzeyi alanı için üretici bilgileri) tohumlama için uygun bir seyreltilmiş hücre süspansiyonu btain.
Not: Bu Eklemelerimin üretici tarafından kollajen ile kaplanır ve hücre yapışması için optimize edilmiştir. - bir mikropipet kullanarak uç başına hücre süspansiyonu 0.05 ml dağıtın.
- Tüm ekler numaralı seribaşı olduğunda,) adım 1.1.7 deki gibi plaka sallayın.
- 4 ug 2 ug / ml / ml, 1 ug / ml çalışma solüsyonlar elde etmek için N9 işleme ortamı kullanılarak LPS'nin seri dilüsyonları gerçekleştirin.
- Pipet 0.05 ila 2 mg / ml bir nihai seyreltme elde etmek üzere bir insertlerin grubu 4 ug / ml çalışma çözeltisi ilave edildi.
- farklı set ekler diğer iki çalışma çözümleri için yineleyin 2.2.10), / ml ve 0.5 ug / ml 1 ug son dilüsyonları elde edilmiştir.
- İçindeko-kültür deneyleri yapmadan önce LPS ile N9 Mikroglia aktivitesi sağlamak için% 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C'de 24 saat boyunca ek içeren plakalar cubate.
- Co-yetiştirilmesi N9 mikroglia ile nöronal PC12 hücreleri
- PC12 hücrelerinin farklılaşma 7-9 gün sonra, 37 ° C bir su banyosunda ılık N9 muamele ortamı ve PC12 muamele ortamı ile LPS ile kuluçkalamadan 24 saat sonra N9 mikroglia aktive eder.
- N9 muamele ortamı içinde 0.1 ml, tüm kullanılan ortam yerine adım 1.3) 'deki gibi N9 mikroglia için toplam Orta değişiklik yapın. Her insert.This için bunu yapın ekler sadece aktif N9 mikroglia bırakarak, LPS tüm izlerini kaldırmak için gereklidir.
- ) Adım 1.4 olarak nöronal PC12 hücreleri için toplam orta değişikliği gerçekleştirin. % 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C'de 24 saat veya 48 saat boyunca, N9-PY12 ko-kültürler) adım 1.5 olarak 24 oyuklu plakalara ekler transfer .Incubate.
- 24 sonrasısaat veya 48 saat, süpernatan ve / veya sitotoksisite, enzime bağlı immünosorbent tahlil için hücreler (ELISA), Western blot ya da diğer tayinleri hasat edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
insert ko-kültür sistemlerinin kullanılması MSS farklı hücresel oyuncular arasında parakrin ilişkileri vitrin nöro süreçlerin çalışmada özellikle uygun olduğunu. MSS Bağışıklık onların istirahat dallanmış devlet (Şekil 2A) çevreleri izlemek ve algılama bozuklukları yeteneğine sahip mikroglia denilen yerleşik hücreler tarafından çoğunlukla başarılı olduğunu olabilir sorun düzgün nöronal fonksiyon 76-78 için gerekli çok değerli homeostasis. Bir amoeboid şekli (Şekil 2B) ve hücre popülasyonunun çoğalması kabulü ile karakterize mikroglial aktivasyon, sitokinler gibi pro-inflamatuar mediatörlerin, serbest bırakılması ve ardından microgliosis (Şekil 3), olarak adlandırılan nöro 79 baş yönünü oluşturmaktadır . Sitokin salınımı zararlı saldırılara karşı nöronları korumak asil amaca hizmet ve closEly izlenir. Nöroenflamasyon bu sıkı bir kontrol kaçar Ancak, bu yıkıcı doğa benimser ve ciddi MSS yaralayabilir. sinir dokular çok sınırlı yenileme potansiyeline sahip mademki, CNS oto-yıkıcı inflamatuar yanıta daha hassastır. karışma incelenmesi, bu nöronların ve mikroglia nöro yatan mekanizmaları durulaştırmada zorunludur arasında var. karışık kültürlerle aksine, insert ko-kültür sistemleri toksik etkileri oluşturuyor ve hangisinin etkilenen hangi hücre popülasyonu tespit araştırmacı sağlar.
Burada, sinir büyüme faktörü ile 7-9 gün boyunca farklılaşmış PC12 hücreleri nöronlarda enflamasyon kaynaklı çözünür faktörlerin quantifyingthe zararlı etkilerin amacı ile LPS ile aktive N9 mikroglia ile birlikte kültürlenmiştir. N9 mikroglia uçlar tohumlandı ise Bunu yapmak için, nöronal PC 12 hücreleri, 24 oyuklu plakalar içinde kültürlendi. N9 microgliBir LPS, gram-negatif bakterilerin dış membran içinde bulunan çok güçlü bir pro-enflamatuar endotoksin 24 saat boyunca muamele edilmiştir. LPS, böylece ölümsüzleştirilmiş murin hücre hattı N9 mikroglia 80,81 dahil immün efektör hücrelerin geniş bir çeşitliliği içinde güçlü bir iltihabi tepki ortaya Toll-benzeri reseptör 4 aktive ettiği bilinmektedir. Aşağıdaki Örnek sonuçlar, LPS ile aktive N9 mikroglia Nüfuslarını (Şekil 3) artırmak ve interlökin-6 (IL-6), interferon gamma (IFN-γ), ve benzeri gibi çözünür pro-enflamatuar sitokinleri salgılayan bir eğilim olduğunu göstermektedir hali hazırda, ko-kültür insertlerin membranını geçemediği ve alt bölmesinde artan nöronal PC 12 hücrelerinin sitotoksik zarar görmesine neden tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α).
nöronal PC 12 hücreleri ihtiva eden gözlere LPS ile aktive N9 mikroglia aktarmadan önce önemli endişe THA teyit oluşurPC12 t düzgün ayrılır. Yedi günlük olarak farklılaşmış PC12 hücreleri, bazen kendi varisler (Şekil 4) gösteren birçok uzun nöritler uzanan bir düz hücre gövdesi gibi, görünür bir nöronal fenotipleri göstermelidir. Bu kontrol noktasında bir kez yapılır, LPS'nin taze ortam yoksun ihtiva N9 mikroglia uçlar farklılaşmış PC12 ihtiva eden oyuklara transfer edilebilir. Sitokinler ölçmek için, laktat dehidrogenaz serbest 15,16 yanı sıra bir ELISA 15 göre 24 saat ya da 48 saat sonra, hasat alt bölmeye ve sitotoksisite tahlilinde süpernatan, bir inkübasyon süresinden sonra, gerçekleştirilir. Gerçekten de geçirgen membran geçti ve PC12 hücrelerinin yüzeyi üzerinde reseptörlerini aktive edebilen sitokinler ölçmek için alt bölme süpernatant hasat önemlidir. Sonuçlar, üst bölmeden LPS ile aktive N9 mikroglia doza ve zamana bağlı CYT ürettiğini göstermektediralt bölmeye (Şekil 5) ayarlanan farklılaşmış nöronal PC12 hücreleri üzerinde otoxic etkisi. 0.5 ug / ml LPS durumu anlamlı değil ancak 24 saat ya da 48 saat sitoksik. sitotoksisite seviyesi 2 ug / ml LPS 48 saat durumda yaklaşık% 100 ulaşmak için bulunmuştur. Ayrıca, sonuçlar, pro-enflamatuar sitokinler, IL-6, gözlemlenen sitotoksisitesi ile eş zamanlı olarak yüzer artar IFN-γ, TNF-α konsantrasyonu. Özellikle, IL-6 seviyeleri, önemli ölçüde, aynı zamanda önemli ölçüde 48 saat (Şekil 6) sonra sitokin düzeyleri yüksektir verimleri LPS 1 ug / ml iken, sadece 2 mg / ml bir durum için 24 saat sonra artmıştır. Mikroglia da mi 1 ug / ve 2 ug / ml ile muamele edilir ve 24 saat ya da 48 saat (Şekil 7) başına farklı nöronal PC 12 hücreleri ile inkübe edildiğinde belirgin bir şekilde artan bir şekilde daha düşük bölme ulaşır IFN-y salgılayan. 0.5 ug / mlLPS durum bir kez daha önemli ölçüde IFN-γ düzeyleri artmaz. Son olarak, alt bölme TNF-α konsantrasyonları ELISA ile nicelleştirilmiştir neredeyse kontrol koşulu (Şekil 8) daha önemli yedi misli, en çok mikroglia LPS aktivasyonu güçlendirilecek ulaşan düzeyleri bulunmuştur. Özel olarak, her ikisi de 24 saat ve 48 saat inkübasyon süreleri yüzer TNF-α seviyelerinde önemli bir artışa neden olmuştur. Bununla birlikte, 1 ug / ml LPS durumu sadece 48 saat sonra TNF-α düzeylerinin önemli bir artış tespit edilmiştir. Bir bütün olarak, bu sonuçlar, salgılanan pro-enflamatuar sitokinler, en azından LPS farklı konsantrasyonları ile aktive mikroglia ile 24 saat veya 48 saat kuluçka süresini takiben farklı nöronal PC 12 hücrelerinde gözlenen sitotoksik etkilerini kısmen sorumlu olduğunu göstermektedir.
gösterilmiştir LPS ile aktive N9 mikroglia ve PC12 hücrelerinin ko-kültür sistemleri eklemenöro çalışmaya ve karşı koymak stratejiler oluşturulması özellikle yararlıdır. Bizim grup en son hücre kültüründe yetiştirilen LPS ile aktive N9 mikroglia da ekin 15, 16, mikro-geçerek sinir büyüme faktörü-farklılaşmış PC12 hücrelerinin apoptosisi teşvik pro-enflamatuar sitokinlerin sergiler yüksek transkripsiyonunu ekler gösterdi. Aynı paradigmada, polifenolik bileşim resveratrol (0.1 uM, 3 saat) ile birlikte mikrogliyal nüfusun ön-işlem daha sonra, kaspaz-3 aktivasyonunu bloke tarafından pro-enflamatuar sitokinlerin transkripsiyonunu ve farklı nöronal PC 12 hücrelerinin ve bu şekilde engellenir apoptoz engelledi DNA parçalanması. Başka bir grup da N9-PC12 ko-kültür 26 E vitamininin nöroprotektif etkilerini göstermiştir. N9-PY12 ko-kültürler ek olarak, farklı ölümsüz hücre çizgileri veya birincil kültürleri de nöro bağlamında kullanılmaktadır. Örneğin,Murin mikroglia BV2 hücre hattı görünüşte, anti-enflamatuar, potansiyel 17 tarafından aracılık edilen polifenolik luteolin anti-apoptotik etki gösteren insan nöroblastoma SH-SY5Y hücreleri ile birlikte kültürlendi. Bunun yanı sıra, yaralı PC12 hücrelerinin aktive BV2 mikroglia mezenkimal kök hücrelerin 18, anti-apoptotik etkilerini uygulamak için gösterilmiştir. Karşılıklı sinyal altta yatan birincil mikroglia nöro primer serebellar granül nöronlar 19 tevcih anti-apoptotik mekanizmalar önemli olduğu gösterilmiştir. Bundan başka, birincil hippokampal nöronlar olan ko-kültive sistein değişimi ve sinaptik fonksiyon 20 daha sonra zayıflamasına glutamat salınmasını değerlendirmek için salgılanan amiloid ön-madde proteini aktive primer mikroglia ile. Son olarak, bir grup da sinyal fractalkine birincil hipokampal nöronlar ve ilgili birincil mikroglia arasında var karışma, bir kemokin yapısal expres gösterdireseptör mikroglia 21 yüzeyinde bulunan MSS nöronlar tarafından sed.
Bir ekleme eş-kültür sistemine Şekil 1. şematik temsili. Üst kısım bir hücre tipi ve apikal hümoral ortam tutan ucun oluşmaktadır. Alt bölme, ikinci hücre tipi içeren bir depo ya da çanağı içermektedir. insert multiwell doku kültürü plaka veya çanak kenarlarında dayanmaktadır. insert aşağıda büyüyen hücrelerin popülasyonunu dokunmamaya kadar sadece kuyunun dibine üzerinde yalan tasarlanmıştır. Alt bölme orta ilk hücre tipi ve ikinci hücre tipi apikal yüzeyinin taban yüzeyi hem de temas halindedir. Daha büyük bir vers görüntülemek için tıklayınBu rakamın iyon.
Şekil N9 mikroglia 2. Microphotographs. Ekler (A) İşlenmemiş dinlenme N9 mikroglia onları aktif olarak çevreyi izlemek için izin bir dallanmış hücresel morfoloji gösterirler. (B) 24 saat ekran aktif fenotip tipik bir amoeboid şekli için lipopolisakkarit (LPS) ile muamele Ekler, N9 mikroglia. Bu mikrofotoğrafıdır sadece Şekil 4. Ölçek çubuğu gösterildiği gibi farklılaşmış PC12 hücreleri içeren kuyulara bu aktive N9 mikroglia içeren eki aktarmadan önce çekildiği = 25 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil farklılaşmış nöronal PC12 hücrelerinin 4. Microphotographs. Yedi gün sinir büyüme faktörü-farklılaşmış nöronal PC12 hücreleri gibi uzun neurites ve varikoziteler olarak belirgin nöronal fenotipleri göstermektedir. Bu mikrofotoğrafıdır sadece Şekil 2. Ölçek çubuğu resimdeki gibi aktive N9 mikroglia içeren ekler aktarmadan önce çekildiği = 25 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lipopolisakkarid Şekil 5. Sitotoksik etkisi (LPS) farklılaşmış nöronal PC12 hücreleri üzerinde mikroglia -etkinleştirilmiş.N9 mikroglia 24 saat boyunca LPS farklı konsantrasyonları ile aktive edilmiştir, daha sonra 24 saat ya da 48 saat boyunca farklı nöronal PC 12 hücreleri ihtiva eden gözlere aktarılabilir. Sitotoksisite alt bölme süpernatantı üzerinde gerçekleştirilen bir laktat dehidrogenaz salma tahlili kullanılarak değerlendirildi. Gruplar arasında önemli fark, Windows için GraphPad InStat programı ile Tukey post-hoc analizi, sürüm 3.06 (; www.graphpad.com San Diego, CA) ardından varyansın tek-yönlü analizi ile tespit edildi. 6 kuyu kabul edildiği 3 bağımsız deneyden ortalama ± standart hatası olarak% 95 güven aralığında analiz edilen tüm veriler, ifade edilmiştir. Yıldız tedavi ve kontrol koşulu (*** p <0.001) arasında istatistiksel olarak farklılık göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
I Şekil 6. konsantrasyon-6 nterleukin (IL-6) lipopolisakarit (LPS) ile N9 aktivasyonundan sonra süpernatan içinde. N9 mikroglia 24 saat boyunca LPS farklı konsantrasyonları ile aktive edildi ve daha sonra, farklı nöronal PC 12 hücreleri ihtiva eden gözlere aktarılabilir 24 saat veya 48 saat. alt bölme süpernatantı, IL-6 seviyeleri, ELISA ile değerlendirildi. Gruplar arasında önemli fark, Windows için GraphPad InStat programı ile Tukey post-hoc analizi, sürüm 3.06 (; www.graphpad.com San Diego, CA) ardından varyansın tek-yönlü analizi ile tespit edildi. 6 kuyu kabul edildiği 3 bağımsız deneyden ortalama ± standart hatası olarak% 95 güven aralığında analiz edilen tüm veriler, ifade edilmiştir. Yıldız tedavi ve aleyhte arasındaki istatistiksel farklılık göstermemektedirtrol durumu (*** p <0.001, ** p <0.01 ve * p <0.05). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lipopolisakarit (LPS) ile N9 aktivasyonu takiben üstte yüzen madde içindeki interferon gamma (IFN-γ), Şekil 7. konsantre. N9 mikroglia 24 saat boyunca LPS farklı konsantrasyonları ile aktive edilir ve daha sonra 24 saat boyunca farklı nöronal PC 12 hücreleri ihtiva eden gözlere aktarıldı ya da 48 saat. Alt bölmenin süpernatan IFN-γ konsantrasyonu, bir ELISA kullanılarak belirlendi. gruplar arasında anlamlı farklılık GraphPad Instant programı ile Tukey post-hoc analizi, sürüm 3.06, ardından varyans tek yönlü analizi ile tespit edilmiştirWindows (; www.graphpad.com San Diego, CA) için. 6 kuyu kabul edildiği 3 bağımsız deneyden ortalama ± standart hatası olarak% 95 güven aralığında analiz edilen tüm veriler, ifade edilmiştir. Yıldız tedavi ve kontrol koşulu arasındaki istatistiksel farklılıkları göstermektedir (** p <0.01 ve * p <0.05). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lipopolisakarit (LPS) ile N9 aktivasyonu takiben süpernatan tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) Şekil 8. Konsantrasyon. N9 mikroglia 24 saat boyunca LPS farklı konsantrasyonları ile aktive edilir ve daha sonra da farklı nöronal PC 12 hücreleri ihtiva eden gözlere aktarıldı 24 saat veya 48 saat. TNF-αAlt bölmenin üstte yüzen madde içindeki konsantrasyonu, bir ELISA kullanılarak belirlendi. Gruplar arasında önemli fark, Windows için GraphPad InStat programı ile Tukey post-hoc analizi, sürüm 3.06 (; www.graphpad.com San Diego, CA) ardından varyansın tek-yönlü analizi ile tespit edildi. 6 kuyu kabul edildiği 3 bağımsız deneyden ortalama ± standart hatası olarak% 95 güven aralığında analiz edilen tüm veriler, ifade edilmiştir. Yıldız tedavi ve kontrol koşulu (*** p <0.001) arasında istatistiksel olarak farklılık göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Herhangi bir ekleme ko-kültür sistemi deney en kritik adım aslında kullanmak için uygun parçayı seçiminde yaşıyor. Gözenek büyüklüğü ve membran malzemesi ekilmiş olan hücre türü ve deney amacı dikkate unutulmadan, ayrıntılı göz önüne alınmalıdır. Örneğin, chemotaxic deneyler, hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin neden olduğu hücre davranışı modülasyon analiz hücre birleşik kültürlerinden daha membran aynı tip kullanabilir. Hücre göçü ve hücre-hücre temasını engelleyecek, hücre göçü izin vermek için, eski daha büyük olanları, ve ikinci daha küçük olanlar: Bununla birlikte, deneyler her iki tip, farklı gözenek boyutlarına gerektirir. hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörler aracılık ettiği hücresel değişikliklerin değerlendirilmesi için, 0.4 um ya da 3 um boyutlar geçmeyip yaparak en hücreleri önlemek için, bu tür proteinler gibi büyük moleküller için izin verdiği, genellikle, uygun olan gözenek yani. ZarMalzeme, büyük ölçüde hücre tipine bağlıdır ve teknikler, hücre kültürü protokolünün sonunda kullanılır. Onlar açık ama kolajen destek tedavi edilmesi için gerekli yapışık hücreler için bir sorun olabilir, kaplamalı değil gibi Kısaca, PET membranlar iyi hücre görünürlük sağlar. Onlar da onların iyi optik özellikleri yanında, histolojik çalışmalar için ideal hale getiriyor, fiksatif en iyi kimyasal dirence sahiptir. yarı saydam olan ve kolajen kaplı değildir Öte yandan, bilgisayar membranlar kötü hücre görünürlük sağlar. Ancak, gözeneklerin en yüksek yoğunluğa ve gözenek boyutlarının en geniş kullanılabilirliği sahiptirler. Sadece hücre görselleştirme mikroskop özetliyor izin ıslakken ama sonunda, PTFE membranlar açıktır. büyük bir avantaj olarak, onlar da onları biraz daha kalın kılan kaplı kolajen. Kollajen PET veya PC membran ekler kaplama gözenekleri tıkayabilir ve çözünür facto çapariz dikkat etmek önemlidirrs. Her durumda, çoğu insert üreticileri uygun parçayı seçerken araştırmacılar yardımcı olmak için kapsamlı rehberler sunmaktadır. Bizim özel paradigmada, PC12 hücreleri için plaka yoğunluğunda, ortam serum konsantrasyonu, farklılaşma gün LPS aktivasyon gün LPS'nin konsantrasyonları ve şişe kaplamanın seçenekler, bu ko-kültür sistemleri 15 ile birlikte çalışma yıl içinde optimize edilmiş 16. Dikkate değer, insert içinde N9 mikroglia kaplama yoğunluğu dolayısıyla, ko-kültür başlamadan anda% 40-50 izdiham elde etmek ve 60.000 ¢ / cm 2 seçildi, onlara aktivasyon üzerine çoğalmaya yer vermek LPS tarafından. aynı zamanda, nativ PC12 bakım amaçlı şişelerinde L-lizin ile kollajen ikame olarak tatmin edici sonuçlar, verebilir optimize diğer durumlar.
Sonuçların sürekliliğini geliştirmek için, çeşitli kontrol gerçekleştirilebilir. çözünür faktörler kanıtlamaya çalışırkenDoğrudan hücre-hücre teması ve koşullu ortam deneyleri tezahür karışık kültürlerinin gözlenen etkilerinden sorumlu yapılmalıdır edilir. Ayrıca, antikor kullanarak, belirli bir salgılanmış faktörü algılanan parakrin etkisinden sorumlu molekül belirlenmesine yardımcı olacaktır nötralize etmek. Mümkün olduğunda, bir alıcı veya reseptörün tam özdeşlikte aktif hale kesin olarak belirlemek için olan bir sinyal yolunun bir kısmını bloke eder. Bir molekül, daha önce tarif edilen örnekte olduğu gibi, ikinci bir hücre tipi ile ko-kültür deney öncesinde bir hücre popülasyonu aktifleştirilmesi için kullanılır, göz önüne sisteminde molekülün varlığı almak önemlidir. Birinci seçenek olarak, ortam tamamen molekülü tamamen sistemden mevcut olduğundan emin olmak için, ko-kültür deney öncesi değiştirilmelidir. Tek başına molekülü için ikinci hücre tipi ile inkübe edilir burada ikinci bir seçenek olarak, bir koşul eklenmelidirİlk hücre tipinde yokluğunda etkisini değerlendirmek. ikinci bir hücre tipine molekülün herhangi bir etkisi varsa, ko-kültür, deneyden önce orta değiştirmeye gerek olacaktır. Her iki hücre tipi, aynı hücre kültürü ortamında yetiştirilmeyen, benzer şekilde, aynı koruyucu önlemler, orta bileşim içinde farklar bir ya da başka bir hücre popülasyonu etkilemez olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Her iki ortam ilk uç membran ile ayrılmış olmakla beraber, difüzyon daha uzun kuluçka dönemleri boyunca karıştırın olmasını sağlamak için bağlanır. Dahası, çeşitli problemler çözülebilir faktörü reseptörü ilişkileri olarak anormal bozulması ortaya çıkabilir. hata çeşitli nedenleri arasında, enzimatik ayrılma aşırı kullanımı ve serum önemli konsantrasyonlarda bulunması hücre yüzey reseptörleri ile etkileşime girebilir. insert ko-kültür sistemlerinde hata diğer nedenleri içerir, ancak: 1) bu tür hücrenin bütününü kaldırma gibi uygunsuz hücre kültürü teknikleri, bunlarla sınırlı değildirkuru hücrelerin yol açarak çok sayıda kuyu kültür ortamı, 2) uç membran sızdırmaz kılmakta ve apikal-salgılanan moleküller önlenmesi sorumlu çok insert yer birleşmiş olan bir tek-tabakalı, düşük bölme ulaşmak için, ve 3) hatalı-ayarlanmaya eğimli fizyolojik alakasız sonuçlar ya da herhangi bir etkisinin olmaması yol açan çözünür faktörlerin bir aşırı veya yetersiz ifadesini neden hücre izdiham.
insert ko-kültür sadece bir senaryo burada sunuldu iken, bu çok yönlü tekniğin kullanımını sağlamak için çeşitli yolları vardır. Burada, tek bir hücre tipi, oyuğa ekleme aktarılması üzerine, ikinci bir hücre tipinde davranışını etkiler çözünebilir faktörün salgılanmasını uyarmak için sorumlu bir molekül ile ön-muamele edilmiştir. Gizli bir tedavi, bir veya her iki hücre popülasyonlarının artan hassasiyeti ya da direnç tespit etmek için bunları ayıran önce bir ko-kültür sisteminde hep birlikte hücre tipleri inkübe edilmesi de mümkündür. Hoonun en ilkel şeklini göz önüne alındığında Wever, bu teknik, bazal parakrin karşılıklı sinyalizasyon değerlendirmek amacı ile, herhangi bir tedavi olmadan birlikte kuluçkaya hücrelerin iki nüfus yararlanabilir.
Bu tekniğin en önemli sınırlama gibi reaktif oksijen türleri olarak çok kısa ömürlü moleküler varlıklar üst bölmeye ve alt bölme 82 birinde büyüyen hücre popülasyonunu ayıran mesafeyi hayatta kalmamasıdır. Ko-kültür teknikleri son gelişme mikro yakınlık 83 iki hücre popülasyonlarının koruyabilmiştir bir microfabricated kültür substratı kullanarak bu sorunu cevaplamak için çalıştı. Bu tür değişikliklerin ve çift yönlü sinyalleşme nüfusu özgü algılama gibi uç ko-kültür sistemleri, tüm avantajlarını taşıyan ek olarak, bu mikrofabrike ekranı da mümkündür d daha önce olduğu kısa menzilli etkileşimlerinin tespit olmak için gösterilmiştirmesafelerde çözünür faktörler çürüme nedeniyle etectable. Bu hücre kültürü platformu hücre ko-kültür son yenilik ve unravel önce gözardı hücreler arasındaki mekanizmalar sinyal yardım sözü verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
