Abstract
העברת מאמצת של vivo לשעבר מורחבת לימפוציטים עצמיים שחדר-גידול (TILs) יכולה לתווך תגובות יציבות ומלאות תת משמעותי של חולים עם מלנומה גרורתית. מכשולים עיקריים של גישה זו הם כדאיים המופחתת של תאי T להעברה, הנגרמים על ידי קיצור הטלומרים, והמספר המצומצם של TILs המתקבל חולה. פחות בדיל תאי T טלומרים ארוכים יהיו משנה תאי T אידיאלי עבור טיפול בתאים T מאמצת, אולם יצירת מספר גדול של תאי T פחות בדיל אלה הן בעייתית. מגבלה זו של טיפול T תא מאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי על ידי תאי גזע מושרים אלקטרוניים (iPSCs) כי עצמי לחדש, לשמור pluripotency, יש טלומרים מוארכים, ומהווה מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור iPSCs באמצעות וקטורי וירוס סנדאי עבור התמרה של גורמי תכנות מחדש לתוך TILs. פרוטוקול זה ליצורזה מלא לתכנות מחדש, שיבוטים וקטור חינם. TIL נגזר אלה iPSCs עלול להיות מסוגל לייצר פחות בדיל בפציינט, ואת הגידול ספציפי תא T עבור טיפול בתא מאמצת T.
Introduction
הטכנולוגיה לתכנות מחדש של תאים המאפשר דור של תאי גזע מושרים (iPSCs) דרך ביטוי יתר של קבוצה מוגדרת של גורמי שעתוק טומן בחובו הבטחה גדולה בתחום טיפולים מבוססי תאים 1,2. IPSCs אלה להפגין תכונות תעתיק ו אפיגנטיים ויש להם את היכולת התחדשות עצמית pluripotency, בדומה לתאי גזע עובריים (ESCs) 3-5. התקדמות מרשימה שנעשו בטכנולוגיה תכנות מחדש בעשור האחרון אפשרה לנו ליצור iPSCs האנושית אפילו תאים מובחנים סופני, כגון תאי T 6-8. T תאים שמקורם iPSCs (TiPSCs) לשמור על אותה התצורה מחדש של קולטן תא T (TCR) גני שרשרת כמו תאי T המקוריים, אשר מאפשרת התחדשות של תאי T אנטיגן ספציפי מן TiPSCs 9-11.
כמעט 80% של לימפוציטים שחדר מלנומה (TILs) המתקבל גידול של המטופל במיוחד להכיר אנטיגנים גידולים הקשוריםnd לשמור cytotoxicity נגד תאי הסרטן המקורי 12. יש לציין, כי הביטוי של-1 חלבון מוות תאי מתוכנת (PD-1) על TILs נמצא לזהות את רפרטואר גידול-reactive העצמי, כולל CD8 neoantigen ספציפי מוטציה + לימפוציטים 13. העברת מאמצת של TILs העצמי המורחב לשעבר vivo בשילוב עם משטרי lymphodepleting preparative ומנהל מערכתי של אינטרלויקין -2 (IL-2) יכולה לגרום רגרסיה משמעותית של מלנומה גרורתית תת קבוצות של חולים 14. למרות תוצאות מעודדות במודלים פרה ובחולים, הישרדות עניה של תאי T החדורים וקיומה של מסלולים מדכאים חיסון להופיע להתפשר את מלוא הפוטנציאל של טיפול בתא מאמצת T. פרוטוקולים קליניים נוכחי דורשים מניפולציה vivo לשעבר נרחב של תאי T עצמיים על מנת לקבל מספר גדול. זו תוצאה של הדור של תאי T בדיל סופנים שיש הישרדות עניה, prol מופחתקיבולת iferative, ורמות גבוהות של PD-1 15.
מגבלה זו של טיפול T תא המאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי באמצעות iPSCs שיכול לספק מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. דיווחנו תכנות מחדש לאחרונה של מלנומה TILs להביע רמות גבוהות של PD-1 על ידי וירוס סנדאי (SEV) התמרה בתיווך מארבעת גורמי שעתוק, OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc 16. בעוד וקטורים רטרווירוס דורשים אינטגרציה לתוך הכרומוזומים מארחים לבטא גני תכנות מחדש, וקטורי sev הנם ללא שילוב ולבסוף מסולקות מן הציטופלסמה. תכנות מחדש יעילות גבוהה בהרבה עם מערכת sev לעומת וקטורי lentivirus או רטרו-וירוס 6-8. יתר על כן, sev יכול במיוחד לתכנת מחדש תאי T בתאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs), בעוד כמה שיבוטים iPSC שנוצר על ידי lentivirus או וקטורים רטרווירוס יכול להיות משורות nonlymphoid 6-8. כאן, אנו בפירוטהנהלים מיושמים עבור הבידוד והפעלת TILs מלנומה אנושי לייצור iPSCs TIL הנגזר באמצעות מערכת תכנות מחדש sev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: חולים צריכים לתת הסכמה מהדעת להשתתף דירקטוריון הסקירה המוסדי האנוש pluripotent גזע ועדת Cell אשרה מחקר.
1. ניתוק והתרבות של TILs
- להשיג חומר גידול כי אינו נדרש לאבחון histopathologic מליבת רכש פתולוגיה שירות / רקמות. מניחים 20-100 גרם של דגימות הגידול בתוך שפופרת 50 מ"ל עם 30 מ"ל התקשורת איסוף הגידול (טבלה 1).
- לנתח מוצק, מוצק, רקמות בריאות של דגימת גידול מאזורים נמקי שברירי ו / או דמים באמצעות מספריים. לאחר הסרת רקמות נימקים, להשתמש במספריים כדי לרכך את הדגימה קטנה ככל האפשר.
- לנתק את הדגימה הטחונה לתוך השעית תא בודד באמצעות ערכת דיסוציאציה Dissociator סרטנית (אדם) על פי הוראות היצרן. סנן את ההשעיה עם מסננת תא 70 מיקרומטר זה מוגדר על צינור 50 מ"ל ולשטוף את המסננת 2 פעמים עם2 מ"ל של RPMI 1640.
- צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של התקשורת תא T (טבלה 1).
- כן פתרון שיפוע שני שלבים כגון Ficoll (שיפוע פתרון) בצינור 50 מיליליטר, עם מדרגה תחתונה של 10 מיליליטר של תמיסת צבע 100% ו צעד באמצע 30 מיליליטר של תמיסת שיפוע 75% בדילול עם phosphate- של Dulbecco בופר, לא סידן, מגנזיום לא (D-PBS (-)).
- שכבת השעית התא (משלב 1.4) על שיפוע הפתרון (מ שלב 1.5). צנטריפוגה ב 400 XG ב 20 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
- אסוף את השכבה המכילה את TILs מועשר על הממשק בין שיפוע הפתרון 100% והפתרון שיפוע 75% בתוך שפופרת 50 מ"ל. לדלל את שכבת הפתרון עם TILs מועשר על ידי הוספת 20-30 מ"ל של D-PBS (-).
- צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend השבר TIL מועשר ב 10 מ"לשל תקשורת תא T.
- תרבות השבר (מ שלב 1.8) עם 2 מ"ל של התקשורת תא T ו- 6,000 IU / ml אנושי רקומביננטי (RH) IL-2 בצלחת 6-היטב על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- שנה וחצי בתקשורת ביום 5 לאחר תחילת התרבות וכל ואילך 2-3 ימים.
- פיצול התאים ביחס של 1: 2 ללא trypsinization לאחר השעיית ברכות, הכפלת מספר בארות כאשר מגיעים confluency 80-90%. הוספת נפח מחצית (1 מיליליטר) של תקשורת תא T הטריה rhIL-2 ב 6,000 IU / ml.
2. הכנת mitomycin-C שטופלו SNL מזין סלולרי פלייט
- תאים מזין תרבות SNL ב 10 מ"ל של התקשורת תא מזין SNL (טבלה 1) על צלחת 0.1% ג'לטין מצופה 10 ס"מ עד המפגש 80-90% (3-4 x 10 6 תאים) הוא הגיע.
- להוסיף 310 μl של 0.4 מ"ג / פתרון C mitomycin מ"ל ישירות לתוך צלחת תרבית תאים מזין SNL לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 על 2 שעה ו 15 דקות. לשאוב את התקשורתnd לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ"ל D-PBS (-).
- הוסף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה כדי לנתק את התאים. להוסיף 4.5 מיליליטר של תקשורת תא מזין SNL לנטרל מחדש להשעות את התאים לתוך השעיה בודדת.
- העברת התאים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב התקשורת לספור את התאים עם hemocytometer אחרי מחדש השעיית ב 10 מ"ל של התקשורת תא מזין SNL.
- פלייט 1.5 x 10 6 תאים לכל טוב של תאים מזין SNL על צלחת 10 ס"מ לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השתמש מזין תאי SNL בתוך 3 ימים.
דור 3. iPSCs שימוש וירוס סנדאי (SEV) וקטור
- קציר TILs (משלב 1.11) ולהפעיל 5 x 10 5 תאים של TILs עם אנטי אנושי העכבר צלחת הנכנס CD3 (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי אנושי עכבר מסיסים (5 מיקרוגרם / מ"ל), עם rhIL-2 (6,000 IU / ml) ב 2 מ"ל של התקשורת תא T בצלחת 6-היטב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ימים.
- קציר TILs (מ שלב 3.1) בצינור 15 מ"ל בעזרת פיפטה ולספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
- הפעל מחדש 1 x 10 5 תאים של TILs עם אנטי אנושי עכבר הנכנס צלחת CD3 (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי אנושי עכבר מסיסים (5 מיקרוגרם / מ"ל), עם rhIL-2 (60 IU / ml) ב 500 μl תכנות מחדש של התקשורת (טבלה 1) לכל היטב צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. כן 3 בארות עבור זיהום sev: OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc (1 טוב); זיהום sev (GFP: חלבון פלואורסצנטי ירוק) (1 טוב); וספירת כדוריות (1 היטב).
- לאחר 24 שעות (מ שלב 3.3), לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer ולקבוע את עוצמת הקול של כל וירוס עבור שונים (3-20) multiplicities של זיהום (משרד הפנים). הסר קבוצה אחת של צינורות וקטור וירוס סנדאי מהאחסון -80 ° C. הפשרת וקטורי sev במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומניח אותם על קרח.
נפח של הנגיף (μl)= מואה (CIU / תא) x מספר תאים / כייל הנגיף (CIU / מ"ל) × 10-3 (μl / מ"ל) - מוסיפים את הכרכים מחושב של אחד הצינורות וקטור וירוס ארבעה סנדאי שכל אחד מהם בנפרד נשאו OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc על ידי הוספת תערובת של וקטורים sev ב 10-20 הפנים לתוך התקשורת, כולל מופעל TILs.
- כדי לקבוע את היעילות התמר, להוסיף הכרכים המחושבים של sev-GFP לתוך באר של TILs מופעל.
- מניח את הצלחת (מ שלב 3.5 ו שלב 3.6) בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, להעריך את יעילות זיהום באמצעות TILs נגוע sev-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- אוספים את התאים (מ שלב 3.5) בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 0.5 מ"ל של התקשורת hESC עם המדיום הסלולרי ES הפרימאטים ו גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml).
- מעבירים את ההשעיה לתוך צלחת 10 ס"מ כי Contaתוספות mitomycin-C שטופלו תאים מזין SNL ב 10 מ"ל של התקשורת hESC. שנה את תקשורת hESC פעם בימים עד המושבות גדלות.
- בסביבות היום 18 עד 21, להסיר את תאי מזין SNL סביב המושבות תחת מיקרוסקופ באמצעות קצה של 10 μl של הספסל הנקי.
- גרדו את מושבות באמצעות קצה של 10 μl ולהעביר אותם באמצעות טיפ 200-μl לתוך 100 μl של התקשורת iPSCs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 96-היטב. Pipet מעלה ומטה 2-3 פעמים כדי לשבור את המושבות לגושים קטנים בהיקף ממוצע של 50-100 מיקרומטר.
- מעביר את הגושים הקטנים לתוך צלחות תרבית רקמת 6-היטב עם תאי מזין SNL mitomycin-C שטופלו (משלב 2) ב 2 מיליליטר לכל טוב של תקשורת iPSCs עם גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml). שינוי תקשורת iPSCs מדי יום.
- מעבירים את iPSCs צלחות בתרבית רקמה 6-היטב עם תאים מזין SNL שטופלו C-mitomycin טרי עם 1 מ"ג / IV collagenase מ"ל כל 5-6 ימים. כן 2 בארות לכל צלחות של כל שיבוט עבור immunostaining.
- קבע את תכנות מחדש מלא של כל שיבוט ידי מכתים immunohistochemical של סמנים pluripotency (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, tra-1-81, ו OCT3 / 4) 1.
הערה: לצורך הערכה נוספת של הפוטנציאל pluripotency, לאשר-לתכנות מחדש באופן מלא קווי iPSC יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט ידי היווצרות הגוף embryoid ו assay בידול או במערך teratoma assay 16. - ודא-לתכנות מחדש באופן מלא קווי iPSC להפגין קריוטיפ נורמלי ידי ניתוח ציטוגנטית.
- עבור היווצרות תפלצת רוחנית, להזריק iPSC TIL נגזרות מובחן (1 x 10 6) להשעיה 100 μl של DMEM המכיל 10% FCS לתוך הרקמה התת עורית של עכברי NOD / SCID נקבה בת 6-8 בשבוע. סעיפים teratoma הכתם עם hematoxylin ו eosin.
4. Immunofluorescence מכתים של iPSCs עבור SSEA3, SSEA4, TRA1-60 ו TRA1-81
- לשטוף iPSCs עם 1 מ"ל של PBS ולתקן את iPSCs עם 1 מ"ל של 4% לשנהפתרון raformaldehyde במשך 10 דקות. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% ולשטוף את iPSCs עם 1 מ"ל של 3 פעמים PBS.
הערה: היזהר בעת שימוש paraformaldehyde כי הוא רעיל. - Pretreat iPSCs עם חסימת חיץ (טבלה 1) במשך 30 דקות. בינתיים, לדלל את הנוגדנים הראשוניים (SSEA3 אנטי אנושי חולדה, SSEA4 אנטי אנושי עכבר, TRA1-60 אנטי אנושי עכבר TRA1-81 אנטי אנושי העכבר) 01:50 ב -1.5% פתרון עז בסרום מדולל עם PBS TritonX -100 (הנפח הכולל: 1 מ"ל).
- הסר את חוצץ חסימת (טבלה 1). מוסיפים את פתרון נוגדן ראשוני מדולל דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. בינתיים, לדלל את נוגדנים משני (IgG נגד העכבר IgM או-עכברוש אנטי IgM) 01:50 ב -1.5% פתרון סרום עיזים.
- הסר את הפתרון נוגדן ראשוני מדולל ולשטוף את iPSCs עם 1 מ"ל PBS 3 פעמים, כל 5 דקות. מוסיפים את פתרון נוגדנים משני בדילול דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחדר חשוך. הסר את הפתרון נוגדנים משני בדילול ולשטוף את iPSCs עם 1 מ"ל של 3 פעמים PBS, כל 5 דקות. שימו לב iPSCs עם מיקרוסקופ immunofluorescence.
5. Immunofluorescence מכתים של iPSCs עבור Oct3 / 4
- לשטוף iPSCs עם 1 מ"ל של PBS ולתקן את iPSCs עם 1 מ"ל של תמיסת paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% ולשטוף את iPSCs עם 3 פעמים PBS.
- הוסף חוצץ permeabilization (טבלה 1) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את חוצץ permeabilization ולהוסיף חיץ חסימת (טבלה 1).
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בינתיים, לדלל את הנוגדן הראשוני (עכבר אנטי אנושי Oct3 / 4) 01:50 בחסימת המאגר.
- מוסיפים את פתרון נוגדן ראשוני מדולל דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר את פתרון הנוגדן הראשוני המדולל ולשטוף את iPSCs עם 1ml של PBS 3 פעמים, כל 5 דקות. בינתיים, דילאוטה נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG / IgM) 1: 100 בחסימת המאגר.
- מוסיפים את פתרון נוגדנים משני בדילול דגירה בטמפרטורת החדר בחדר חשוך במשך 45 דקות.
- הסר את הפתרון משני מדולל ולשטוף את iPSCs עם 1 מ"ל של 3 פעמים PBS, כל 5 דקות. שימו לב iPSCs תחת מיקרוסקופ immunofluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג סקירה כללית של ההליך המערבת את ההתפשטות הראשונית של מלנומה TILs עם rhIL-2, אשר מלווה הפעלה עם אנטי CD3 / CD28 ו הגן העברת OCT3 / 4, KLF4, Sox2, ו- c-myc כדי TILs עבור הדור של iPSCs. בדרך כלל, TILs על תרבות עם תחילת rhIL-2 כדי ליצור כדורים 21-28 ימים לאחר תחילת התרבות. בשלב זה, TILs מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3 / CD28. איור 2 א מראה TILs, על תרבות עם rhIL-2 ביום 21, כי הם מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3 / CD28. איור 2B מראה מבוא GFP על ידי וירוס סנדאי (SEV) transfected ב 20 משרד פנים. איור 2C מציג שיבוט פלוריפוטנטיים טיפוסי על תאי מזין SNL המופיע 18-21 ימים לאחר הדבקת sev. איור 2 ד מראה כי iPSCs יש TIL הנגזרת שנוצר קריוטיפ נורמלי. איור 3 מראה מכתים immunofluorescent לאשר p ביטוי סמן luripotency על iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, ו OCT3 / 4). איור 4 מראה כי iPSCs נגזר TILs מלנומה מסוגל ליצור teratoma המכיל מגוון של תאים משלוש שכבות ניבטות (עצבי רקמות, אפיתל הנשימה, וסחוס). איור 5 מראה כי שנוצר iPSCs הנגזרות TIL לשמור rearrangements TCR.
איור 1:. סקירה סכמטי של דור iPSCs ממלנומה TILs פרוטוקול כרוכה בשלושה שלבים: בידוד והתרבות של TILs עם IL-2, הפעלת תא T עם אנטי CD3 / CD28, ו תכנות מחדש תאים בנגיף סנדאי (SEV) OCT3 קידוד וקטור / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 2:. הדור של iPSCs ממלנומה TILs (א) תמונה המייצגת את המורפולוגיה של TILs ב rhIL-2 כשהתחילו להרחיב 2-3 שבועות לאחר תחילת התרבות. תמונות (B) המייצגים ביטוי מורפולוגיה GFP של יום TILs אחד לאחר ההדבקה שב. (C) מושבה ESC דמוי iPSC טיפוסי ביום 21 לאחר ההדבקה שב. הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. (ד) ניתוח ציטוגנטית על עשרים תאים metaphase של רצועה G מאחד iPSCs נגזר מלנומה TILs. איור (ד) מותאם סאיטו et al 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ftp_upload / 54,375 / 54375fig3.jpg "/>
איור 3:. Immunofluorescence מכתים עם סמנים pluripotent תאי גזע את assay immunofluorescence מראה כי iPSCs הנגזרות TIL משני חולים הן חיוביות עבור SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, tra-1-60, ו OCT3 / 4. ברי Scale = 100 דמויות μm.The מותאמות סאיטו et al 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. אישור של pluripotency עבור iPSCs עם היווצרות teratoma Hematoxylin- וחתכים teratoma נציג מוכתם eosin נגזר לשבט iPSCs הנגזרות TIL (6 שבועות לאחר ההזרקה לתוך NOD / עכברים SCID) מוצגים. האיור המותאם סאיטו et al 16..com / קבצים / ftp_upload / 54,375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. מגוון רחב של דפוסי הסדר גן TCR-β ב TIL-iPSCs rearrangements גן TCR-β ב TIL-iPSCs מזוהה על ידי אלקטרופורזה נימים. הקו הירוק נגזר הלהקה עבור גן Jβ1, ואת הקו הכחול נגזר הלהקה עבור גן Jβ2. הדמות מותאמת סאיטו et al 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: הרכב לתא T, תכנות מחדש, tumor איסוף, תא מזין SNL, ומדיה iPSC, ואת permeabilization או מאגר חסימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, הראינו פרוטוקול תכנות מחדש מלנומה TILs כדי iPSCs ידי התמרה בתיווך sev של שעתוק ארבעה גורמים OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc. גישה זו, באמצעות מערכת sev לתכנת מחדש תאי T, מציעה את היתרון של שיטת שילוב אי 7.
מחקר קודם הראה כי מערכת תכנות מחדש sev היה יעיל מאוד ואמין לתכנת מחדש לא רק פיברובלסטים אלא גם תאים היקפיים דם T 7,17. בנוסף, אנו לאחרונה הראינו כי TILs מלנומה כי הם מובחנים יותר ולהביע רמות גבוהות יותר של קולטנים מעכב כגון PD-1 מאשר תאי T הדם היקפיים ניתן גם לתכנת מחדש באמצעות sev וקטורי 16. עיתוי גירוי עם אנטי CD3 / CD28 וזיהום עם וקטור sev היה קריטי תכנות מחדש TILs. יכול להיות מגורה תאי T דם היקפיים עם-CD3 אנטי ו- IL-2 עבור תכנות מחדש מיד לאחר הקציר מהנושא 7, whilTILs הדואר צריך להיות מתורבת במשך 3-4 שבועות עם IL-2 לפני גירוי.
למרות שיותר מ -99% של TILs היו CD8 T תאים לאחר 3-4 שבועות של תרבות עם IL-2 והפעלה עם אנטי CD3 / CD28 16, אנו ממליצים ניתוח של התארגנות TCR ב iPSCs כדי לאשר שנוצר iPSCs הם מן TILs (איור 5). מן הראוי לציין כי מחקרים קודמים כולל שלנו עולה כי כל iPSCs שנוצר באמצעות sev מתאי דם היקפיים mononuclear או TILs היה TCR התארגנות 7,16.
למרות דור iPSCs ממלנומה TILs היה ריאלי, מצאנו כי יעילות תכנות מחדש של מלנומה TILs היה נמוך יותר (0.01-0.05%) 16 מזה של תאי דם היקפיים T (0.1%) 7. הסיבה לכך עדיין לא ברורה, אבל זה עשוי להיות קשור עם הביטוי הגבוה של רצפטורים מעכבים או המספר הגדול יותר של תת T-cell בדיל ב TILs 13,16. התקדמות משמעותית אחרונהעבור טכנולוגית תכנות מחדש עשויים לשפר את יעילות תכנות מחדש עבור דור של TIL-iPSCs. וקטור sev הדור השני, TS12KOS, נמצא כבעלת יעילות גבוהה יותר של דור iPSC מאשר וקטור sev הקונבנציונלי המשמש 18,19 במחקר הקודם.
למרות הגזירה של iPSCs אדם עם מערכת תכנות מחדש sev אינה ריאלית, יש מספר מגבלות להיחשב בפרוטוקול זה. אנו משתמשים בסרום שור עובר במהלך הדבקת sev בפרוטוקול זה. מצאנו כי יעיל תכנות מחדש של מלנומה TILs היה נמוך משמעותי אם באמצעות תקשורת עם סרום אנושי במהלך הדבקת sev לעומת אחד עם בסרום שור עובר, למרות התפשטות דומה של TILs. בנוסף, אנו משתמשים שכבת מזין עכבר עבור דור ותחזוקת iPSC, אלא מערכת מזין ללא מוגדר וחופשי-קסנו עשויה להיות שיטות חלופיות במחקרים עתידיים.
זה לוקח בערך חודשיים מרגע הבציר הגידול ליצור iPSCsממלנומה TILs. בנוסף, זה ייקח 1-2 חודשים נוספים כדי להשיג iPSCs transgene חינם. זה עשוי להתקצר על ידי שימוש בסוג חדש של וקטור sev, TS12KOS, שהראה שיעור חיסול וירוס יעיל יותר 19.
לסיכום, הדור של iPSCs האדם ממלנומה TILs אינו ריאלי. הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיות צעד חשוב ליצירת מספר אינסופי של תאי T-גידולים ספציפיים עבור טיפול בתאי T המאמצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
