Abstract
Приемные передача ех естественных условиях расширил аутологичных опухоль-инфильтрации лимфоцитов (Tīls) могут опосредовать прочные и полные ответы в значительных группах пациентов с метастатической меланомой. Основными препятствиями такого подхода являются сниженная жизнеспособность переданных Т-клеток, вызванных укорочение теломер, и ограниченное число Tīls, полученных от пациентов. Менее дифференцированные Т-клеток с длинными теломерами бы идеальным Т-клеток подмножеством для приемному клеточной терапии Т, однако, генерировать большое количество этих менее дифференцированных Т-клеток является проблематичным. Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), что самообновлению, поддерживать плюрипотентности, имеют удлиненные теломеры, и обеспечивают неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Здесь мы приводим протокол для создания ИПСК с помощью вирусного вектора Сэндай для трансдукции факторов перепрограммирования в Tīls. Этот протокол генерацииS полностью перепрограммировать, вектор свободных клонов. Эти TIL-производные иПСК может быть в состоянии генерировать менее дифференцированные пациенто и опухоль-специфичные Т-клетки для клеточной терапии приемному Т.
Introduction
Клеточная технология перепрограммирования , что позволяет генерировать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью избыточной экспрессии определенного набора факторов транскрипции имеет большие перспективы в области клеточной терапии 1,2. Эти иПСК обладают транскрипционные и эпигенетические особенности и обладают способностью к самообновлению и плюрипотентности, подобно эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) 3-5. Примечателен прогресс в перепрограммирования технологии за последнее десятилетие позволило нам генерировать человеческие иПСК даже из терминально дифференцированных клеток, таких как Т - клетки 6-8. Т - клеточные производные иПСК (TiPSCs) сохраняют ту же переставить конфигурацию Т - клеточного рецептора (TCR) генов цепи как исходных Т - клеток, что позволяет регенерацию антиген-специфических Т - клеток из TiPSCs 9-11.
Почти 80% с меланомой инфильтрации лимфоцитов (Тилсом), полученные из опухоли пациента специфически распознавать опухолевый антигены, ассоциированные с Aй поддерживать цитотоксичность против первоначальных раковых клеток 12. Следует отметить, что было установлено , что экспрессия смерти запрограммированным клеток белок-1 (ПД-1) на Тилсом для идентификации аутологичных опухоле-реактивных репертуар, в том числе мутантным неоантигена-специфических CD8 + лимфоциты 13. Адаптивная передача экс-виво расширенных аутологичных Тилсом в сочетании с препаративных режимами lymphodepleting и системного введения интерлейкин-2 (IL-2) , может привести к существенной регрессии метастатической меланомой в группах пациентов 14. Несмотря на обнадеживающие результаты в доклинических моделях и у пациентов, плохое выживание вливали Т-клеток и наличие иммуносупрессивной путей, по всей видимости поставить под угрозу весь потенциал приемному клеточной терапии Т. Текущие клинические протоколы требуют больших ех естественных условиях манипулирование аутологичных Т - клеток, чтобы получить большое количество. Это приводит к образованию терминально дифференцированных Т-клеток, которые имеют плохую выживаемость, снижение Proliferative потенциала, а также высокие уровни PD-1 15.
Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью ИПСК, которые могут обеспечить неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Недавно мы сообщали о перепрограммирование меланомой Tīls , выражающую высокие уровни PD-1 от вируса Сендай (SeV) опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус 16. В то время как ретровирус векторы требуют интеграции в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммировать, SEV векторы неинтегрирующих и в конечном счете исключены из цитоплазмы. Перепрограммирование эффективность значительно выше , с системой SeV по сравнению с лентивирусов или ретровирусов векторами 6-8. Кроме того, SEV может специфически перепрограммировать Т - клеток в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), в то время как некоторые Ipsc клоны , порожденные лентивирусов или ретровирусов векторы могут быть из нелимфоидных родословных 6-8. Здесь мы подробнопроцедуры реализованы для выделения и активации меланомы человека Тилсом и для генерации TIL-производных ИПСК с использованием системы перепрограммирования SEV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Пациенты должны дать информированное согласие на участие в Совете по институциональному обзору и человека плюрипотентных стволовых комитет Cell одобрено исследование.
1. Выделение и культура Tīls
- Получить материал опухоли, которая не требуется для гистологического диагноза из основных закупок патологии службы / ткани. Поместите 20-100 г образцов опухоли в 50-мл пробирку с 30 мл сбора опухолевые сред (таблица 1).
- Рассеките твердый, твердый, нормальная ткань опухоли образца из хрупких и / или кровавых некротических областей с помощью ножниц. После удаления некротических тканей, используйте ножницы, чтобы пропустить через мясорубку образец как можно меньше.
- Диссоциируют фарша образца, в одной клеточной суспензии с использованием диссоциатора и опухолевый диссоциации набора (человека) в соответствии с инструкциями изготовителя. Суспензию фильтруют с 70 ячейки фильтра мкм, который установлен на 50 мл трубки и промыть сетчатый фильтр 2 раза2 мл среды RPMI 1640.
- Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 10 мл клеточных сред T (таблица 1).
- Готовят раствор градиента двухступенчатый такие как Ficoll (градиент раствора) в 50-мл пробирку, с более низкой ступени 10 мл 100% раствора градиента и средней ступени 30 мл 75% раствора в градиенте разбавленным фосфатным Дульбекко буферный солевой раствор, без кальция, магния нет (D-PBS (-)).
- Слой клеточной суспензии (со стадии 1.4) на растворе градиента (со стадии 1.5). Центрифуга при 400 мкг при 20 ° С в течение 45 мин.
- Собирают слой, содержащий обогащенные Тилсом на границе раздела между 100% -го раствора градиента и 75% -го раствора градиента в 50 мл пробирку. Развести слой раствора с обогащенными Тилсом добавлением 20-30 мл D-PBS (-).
- Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют TIL-обогащенную фракцию в 10 млклеточных сред T.
- Культура фракция (из шага 1.8) с 2 мл среды Т - клеток и 6000 МЕ / мл рекомбинантного человеческого (РЗ) IL-2 в 6-луночный планшет при 37 ° С, 5% СО 2.
- Изменение половину средств массовой информации на 5-й день после начала культивирования и через каждые 2-3 дня после этого.
- Разделение клеток в соотношении 1: 2 без трипсином после мягко суспендирующие, удвоение числа скважин при достижении 80-90% сплошности. Добавление половины объема (1 мл) свежих Т-клеточных сред и рИЛ-2 при 6000 МЕ / мл.
2. Приготовление митомицин-С-обработанного SNL Feeder клеточной пластинки
- Культура SNL фидерных клеток в 10 мл SNL питатель клеточных сред (таблица 1) на 0,1% желатин покрытием 10 см чашку с вплоть до 80-90% слияния (3-4 × 10 6 клеток) достигается.
- Добавить 310 мкл 0,4 мг / мл митомицина C раствора непосредственно в SNL питателя для культивирования клеток Петри и инкубируют при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в течение 2 ч и 15 мин. Аспирируйте ПРЕССЫе промыть клетки дважды 5 мл D-PBS (-).
- Добавить 0,5 мл 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин для диссоциации клеток. Добавить 4,5 мл питатель клеточных сред SNL для нейтрализации и повторно приостанавливать клетки в одной подвеске.
- Передача клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте средства массовой информации и подсчета клеток с помощью гемоцитометра после ресуспендирования в 10 мл SNL питателя клеточных сред.
- Пластина 1,5 х 10 6 клеток на лунку фидерных клеток SNL на 10 см чашку и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Используйте фидерные клетки SNL в течение 3-х дней.
3. Генерация ИПСК Используя вирус Сендай (SeV) Вектор
- Урожай Тилсом (с шага 1.11) и активировать 5 х 10 5 клеток Тилсом с пластинчатым переплете мышиного CD3 анти-человеческий (1 мкг / мл) и растворимого мышиного антитела против человеческого CD28 (5 мкг / мл), с чрИЛ-2 (6000 МЕ / мл) в 2 мл клеточных сред Т в 6-луночный планшет в 37 ° С, 5% СО 2 в течение 5 дней.
- Урожай Tīls (со стадии 3.1) в 15 мл пробирку с помощью пипетки и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Реактивируйте 1 × 10 5 клеток Тилсом с пластинчатым переплете мышиного CD3 анти-человеческий (1 мкг / мл) и растворимого мышиного антитела против человеческого CD28 (5 мкг / мл), с рИЛ-2 (60 МЕ / мл) в 500 мкл перепрограммирования сред (таблица 1) на лунку в 24-луночный планшет при 37 ° с в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов. Подготовьте 3 скважины для SeV инфекции: Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус (1 хорошо); SeV инфекция (GFP: зеленый флуоресцентный белок) (1 хорошо); и количество клеток (1 лунку).
- Через 24 часа (из шага 3.3), подсчет числа клеток с помощью гемоцитометра и определить объем каждого вируса для различных (3-20) кратностью инфекции (МВД). Удалить один набор вируса Сендай векторных трубок от -80 ° C хранения. Растаяйте векторы SEV быстро на водяной бане (37 ° C) и поместите их на лед.
Объем вируса (мкл)= MOI (CIU / ячейка) х количество клеток / титр вируса (CIU / мл) × 10-3 (мкл / мл) - Добавьте расчетные объемы каждого из четырех векторного вируса Сендай трубок, которые по отдельности, проведенных Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус путем добавления смеси векторов SEV при 10-20 MOI в средствах массовой информации, в том числе активированного Тилсом.
- Для определения эффективности трансдукции, добавьте вычисленные объемы SeV-GFP в скважину активированных Тилсом.
- Поместите блюдо (из шага 3.5 и Шаг 3.6) в термостате при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов. Через 24 часа оценивают эффективность инфекции использованием Тилсом инфицированных SeV-GFP под флуоресцентным микроскопом.
- Собирают клетки (со стадии 3.5) в 15 мл трубки. Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 0,5 мл чЭСК сред с Предстоятель ES клеточной среды и основного фактора роста фибробластов (bFGF, 4 нг / мл).
- Передача суспензии в 10 см блюдо, которое Contàмодули митомицин-С обработанных фидерные клетки SNL в 10 мл чЭСК средах. Изменение СМИ чЭСК каждый день до тех пор, пока колонии выращивают.
- Примерно в 18-й день до 21, удалить фидерные клетки SNL вокруг колоний под микроскопом с помощью 10-мкл наконечник в чистом столе.
- Наскребать колонии с помощью 10-мкл наконечник и передавать их с помощью 200-мкл наконечник в 100 мкл ИПСК сред на лунку 96-луночного планшета для культуры ткани с. Пипеткой вверх и вниз в 2-3 раза, чтобы разбить колонии на мелкие комки со средним размером 50-100 мкм.
- Перенести небольшие сгустки в 6-луночных культуральных планшетах с митомицином-С-обработанных клеток фидерных SNL (со стадии 2) в 2 мл на лунку ИПСК сред с основного фактора роста фибробластов (bFGF, 4 нг / мл). Изменение ИПСК СМИ каждый день.
- Передача ИПСК в 6-луночных культуральных планшетах со свежими митомицин-С-обработанных фидерных клеток SNL с 1 мг / мл коллагеназы IV каждые 5-6 дней. Подготовьте 2 скважины на пластинах каждого клона для Immunostaining.
- Определить полное перепрограммирование каждого клона путем иммуногистохимического окрашивания плюрипотентности маркеров (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 и Oct3 / 4) 1.
Примечание: Для дальнейшей оценки потенциала плюрипотентности, подтверждают , что полностью перепрограммировать линии IPSC могут дифференцироваться в трех зародышевых слоев путем эмбриоидного формирования тела и дифференциации анализа или анализа формирования тератомы 16. - Убедитесь, что полностью перепрограммировать линии IPSC демонстрируют нормальный кариотип путем цитогенетического анализа.
- Для формирования тератомы, впрыснуть недифференцированной TIL производный IPSC (1 х 10 6) суспензии в 100 мкл DMEM , содержащей 10% FCS в подкожную ткань 6-8 недельных самок мышей NOD / SCID. Пятно секции тератомы с гематоксилином и эозином.
4. Иммунофлуоресценции Окрашивание ИПСК для SSEA3, SSEA4, TRA1-60 и TRA1-81
- Мытье иПСК с 1 мл PBS и фиксируют ИПСК с 1 мл 4% годовыхraformaldehyde раствор в течение 10 мин. Удалите 4% раствора параформальдегида и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза.
Примечание: Будьте осторожны при использовании параформальдегида, потому что он является токсичным. - Предварительно обработать ИПСК с блокирующим буфером (таблица 1) в течение 30 мин. В то же время, разбавленные первичные антитела (крысы против человеческого SSEA3, мышиное анти-человеческий SSEA4, мышиное анти-человеческий TRA1-60, и мышиное анти-человеческий TRA1-81) 1:50 в 1,5% раствор козьей сыворотки, разбавленные PBS и Тритон -100 (общий объем: 1 мл).
- Удалите блокирующий буфер (таблица 1). Добавьте разбавленный раствор первичного антитела и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. В то же время, развести вторичного антитела (анти-IgG мыши и IgM или анти-крысу IgM) 1:50 в 1,5% раствор козьей сыворотки.
- Удалить разбавленный раствор первичного антитела и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый в течение 5 мин. Добавьте разбавленный раствор вторичного антитела и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре в темном помещении. Удалите разбавленный раствор вторичного антитела и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый из которых в течение 5 мин. Обратите внимание на ИПСК с иммунофлюоресценции микроскопии.
5. Иммунофлуоресценции Окрашивание ИПСК для Oct3 / 4
- Мытье иПСК с 1 мл PBS и фиксируют ИПСК с 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида в течение 10 мин. Удалите 4% раствора параформальдегида и промыть ИПСК с PBS 3 раза.
- Добавить пермеабилизирующего буфера (таблица 1) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Удалить буфер пермеабилизирующего и добавить блокирующем буфере (таблица 1).
- Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. В то же время, разбавленные первичное антитело (мышиное анти-человеческий Oct3 / 4) в соотношении 1:50 в блокирующем буфере.
- Добавьте разбавленный раствор первичного антитела и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
- Удалить разбавленный раствор первичного антитела и промыть ИПСК с 1мл PBS 3 раза, каждый в течение 5 мин. В то же время, дилютневая вторичное антитело (козий против мышиного IgG / IgM) 1: 100 в блокирующем буфере.
- Добавьте разбавленный раствор вторичного антитела и инкубируют при комнатной температуре в темном помещении в течение 45 мин.
- Удалите разбавленный раствор вторичного и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый из которых в течение 5 мин. Обратите внимание на ИПСК под иммунофлюоресценции микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан обзор процедуры , которая включает первоначальное расширение меланома Тилсом с рИЛ-2, который с последующей активацией анти-CD3 / CD28 и переноса гена Oct3 / 4, Klf4, Sox2 и с-Мус в Тилсом для генерации ИПСК. Как правило, Tīls по культуре с чрИЛ-2 начинают формироваться сфер 21-28 дней после начала культивирования. На данный момент, Тилсом готовы быть активирован с анти-CD3 / CD28 - . Фиг.2а Тилсом, по культуре с рИЛ-2 на 21 -й день, которые готовы быть активирован с анти-CD3 / CD28 - . На фиг.2В показано введение GFP от вируса Сендай (SeV) , трансфицированных при 20 MOI. Рисунок 2C показан типичный клон плюрипотентных на фидерных клеток SNL , который появляется 18-21 дней после заражения SeV. Рисунок 2D показывает , что генерируемые TIL-производные иПСК имеют нормальный кариотип. на рисунке 3 показана иммунофлуоресцентного окрашивания для подтверждения рВыражение маркера luripotency на ИПСК (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 и Oct3 / 4). Рисунок 4 показывает , что иПСК получены из меланомы Tīls способны образовывать тератомы , которые содержат множество клеток из трех зародышевых листков (нейронная ткани, эпителия дыхательных путей, и хрящ). На рисунке 5 показано , что генерируемые TIL-производные иПСК сохраняют TCR перестроек.
Рисунок 1:. Схематический обзор генерации ИПСК от меланомы Tīls Протокол включает в себя три этапа: Выделение и культивирование Tīls с IL-2, активации Т - клеток с анти-CD3 / CD28 и перепрограммирования клеток с вирусом Сендай (SeV) вектор , кодирующий Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Генерация ИПСК из меланомой Tīls (А) Изображение , представляющее морфологии Tīls в чрИЛ-2 , когда они начали расширяться через 2-3 недели после начала культивирования. (B) изображения , представляющие выражение морфологии и GFP из Tīls один день после SeV инфекции. (С) Типичный ESC-как IPSC колонии на 21 день после того, как SeV инфекции. Масштабировать бары = 200 мкм. (D) цитогенетический анализ на двадцать G-полосатых метафазных клеток из одной из ИПСК , полученных из меланомой Tīls. Рисунок (D) выполнен из Saito и др 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg "/>
Рис . 3: Иммунофлуоресценции окрашивание маркеров стволовых клеток плюрипотентные Анализ иммунофлюоресценции показывает , что TIL полученные из иПСК от двух пациентов являются положительными для SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 и Oct3 / 4. Шкала баров = 100 μm.The фигура заимствована из Сайто и др 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: вкл . Подтверждения плюрипотентности для ИПСК с тератомы образованием Hematoxylin- и эозином окрашенных репрезентативных участков тератомы , полученных из TIL-производного ИПСК клона ( через 6 недель после инъекции в NOD / SCID мышей) показаны. Рисунок адаптирован из Саито и др 16..com / файлы / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5:. Широкое разнообразие TCR-бета паттернов расположения генов в TIL-иПСК ТКС-бета гена перестроек в TIL-ИПСК идентифицированы с помощью капиллярного электрофореза. Зеленая линия является производным от полосы для гена Jβ1, а синяя линия получена из полосы для гена Jβ2. Фигура заимствована из Сайто и др 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Состав для Т - клеток, перепрограммирования, тumor сбора, SNL питатель клеток, и IPSC средств массовой информации, а также пермеабилизации и блокировки буферов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы показали протокол для перепрограммирования меланомы Tīls к ИПСК по SeV-опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Такой подход, с помощью системы SEV перепрограммировать Т - клетки, дает преимущество не встраивается метода 7.
Предыдущее исследование показало , что система перепрограммирование SeV была очень эффективной и надежной , чтобы перепрограммировать не только фибробласты , но и Т - клетки периферической крови 7,17. Кроме того, мы недавно показали , что меланома Tīls , которые являются более дифференцированными и выражают более высокие уровни ингибирующих рецепторов , такие как PD-1 , чем периферической крови Т - клеток также может быть перепрограммирован с помощью SeV векторов 16. Выбор времени стимуляции с помощью анти-CD3 / CD28 и инфекции с SeV вектором имеет решающее значение при перепрограммировании Тилсом. Периферической крови Т - клетки могут быть стимулированы анти-CD3 и IL-2 для перепрограммирования сразу после сбора из предмета 7, whilе Тилсом должны быть культивировали в течение 3-4 недель с IL-2 до раздражения.
Несмотря на более чем 99% Tīls были CD8 Т - клетки через 3-4 недель культивирования с ИЛ-2 и активации с анти-CD3 / CD28 16, мы рекомендуем анализ TCR перегруппировки в ИПСК , чтобы подтвердить , что генерируется иПСК взяты из Tīls (рис 5). Следует отметить, что предыдущие исследования , включая наши показали , что каждый иПСК генерируется с использованием SEV из мононуклеарных клеток периферической крови или Tīls имел TCR перегруппировку 7,16.
Хотя поколение ИПСК меланомой Тилсом было выполнимо, мы обнаружили , что эффективность перепрограммирования меланома Тилсом была ниже (0,01-0,05%) 16 , чем у периферической крови Т - клеток (0,1%) 7. Причина этого остается неясным, но это может быть связано с более высокой экспрессии ингибиторных рецепторов или большего числа дифференцированных подмножеств Т-клеток в Тилсом 13,16. Последние значительный прогрессдля перепрограммирования технологии могут повысить эффективность перепрограммирования для генерации TIL-ИПСК. Второе поколение SeV вектор, TS12KOS, было установлено, что более высокую эффективность генерации иПСК , чем обычный вектор SeV , используемого в предыдущем исследовании 18,19.
Хотя вывод человеческих ИПСК с системой SeV перепрограммирования осуществимо, есть несколько ограничений, которые необходимо учитывать в этом протоколе. Мы используем эмбриональной бычьей сыворотки во время SeV инфекции в этом протоколе. Мы обнаружили, что эффективность перепрограммирования меланома Тилсом была значительно ниже при использовании среды с сывороткой человека во время SeV инфекции по сравнению с одним с эмбриональной бычьей сыворотки, несмотря на аналогичный пролиферацию Тилсом. Мы также используем фидерный слой мыши для генерации и поддержания иПСК, а определяется фидерных свободным и Зенона свободная система может быть альтернативные методы в будущих исследованиях.
Она занимает около двух месяцев с момента сбора урожая опухоли генерировать ИПСКот меланомы Tīls. Кроме того, потребуется еще 1-2 месяцев, чтобы получить трансгенов свободных ИПСК. Это может быть сокращено за счет использования нового типа SeV вектора, TS12KOS, который показал более эффективную скорость элиминации вируса 19.
В заключение отметим, что генерация человеческих ИПСК меланомой Тилсом выполнима. Текущий протокол может быть важным шагом для создания бесконечного числа опухолей-специфических Т-клеток для клеточной терапии приемному Т.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
