Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Трансдукции сигнала пути играют важную роль практически во всех клеточных процессов и позволяют клетке быстро реагировать на внешние сигналы. 1 Эти пути часто вызываются связывание сигнальной молекулы с внеклеточным рецептором, что приводит к активации внутриклеточных ферментов. Усиление и распространение этого сигнала внутри клетки опосредовано функцией сигнальных белков, которые образуют сеть белок-белковых взаимодействий, в котором ферменты обратимо активированную с высокой специфичностью. Поскольку дисрегуляция этих сетей часто приводит к развитию рака, наблюдается большой интерес к созданию "сигнальной трансдукции терапии рака ', 2 ' в результате чего препараты предназначены для разрушения злокачественных сигнальных путей. Недавно мы предложили альтернативный подход к сигнальной трансдукции терапии, который зависит от способности препаратов генерировать неестественные пути передачи сигнала.

Для того, чтобы продемонстрировать возможность такого подхода, мы недавно создали синтетический 'химический датчик' 4 , который позволяет тромбоцитарный фактор роста (PDGF) , чтобы вызвать расщепление противоопухолевого пролекарства путем активации глутатион-S-трансферазы (GST), который не его естественный партнер по связыванию. Структура этого «датчика» состоит из анти-PDGF ДНК аптамеров, который модифицирован с ингибитором двухвалентной для GST. Следовательно, этот синтетический агент принадлежит к семейству молекул с сайтами связывания дляразличные белки, 5-7 , таких как химические индукторы димеризации (ИДС) 8-10 , а также к группе белков-связующие на основе олигонуклеотидных конъюгатов-синтетической молекулы. 11-21

Общие принципы, лежащие в основе конструкции таких систем описаны здесь и подробные протоколы для синтеза и тестирования функции этого «датчика» с обычными ферментативных анализов предоставляются. Эта работа предназначена для облегчения разработки дополнительных «преобразователей» этого класса, который может быть использован в качестве посредника внутриклеточный связи белок-белок, и, следовательно, для индукции искусственных сигнальных путей клеток.

На рисунке 1 схематически описывает принципы работы синтетических «химических преобразователей» , которые могут опосредовать неестественные белок-белковые связи. На этой иллюстрации, а 'химический преобразователь », который объединяет синтетические связующие вещества для PROTEins I и II (связующие вещества I и II), позволяет белок II, чтобы вызвать каталитическую активность белка I, который не является ее естественным партнером связывания. При отсутствии белка II, преобразователь связывает каталитический участок фермента (белка I) и ингибирует его активность (Рисунок 1, стенд II). Связывание "преобразователя" к белку II, тем не менее, обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II (рис 1, стенд III), что снижает его сродство к белковой I. В результате эффективная концентрация ' свободный 'датчик в растворе уменьшается, что приводит к диссоциации преобразователя-белка I комплекса и реактивации белка I (рис 1, состояние IV). Взятые вместе, эти шаги выделить три основные принципы, лежащие в основе создания эффективных 'преобразователей': (1) 'датчик' должен иметь конкретное связующее для каждого из белковых мишеней, (2) взаимодействие betweен вяжущего II и белка II должен быть сильнее, чем взаимодействие между связующей I и белка I, и (3) вяжущего я должен иметь возможность взаимодействовать с поверхностью белка II. Этот последний принцип не обязательно требует, чтобы связующее только я бы высокое сродство и избирательность по отношению к белку II. Вместо этого, оно основано на наших недавних исследований , которые показали , что в результате чего синтетическую молекулу , в непосредственной близости к белку может способствовать взаимодействие между этой молекулой и поверхностью белка. 19,22,23

Рисунок 1

Рисунок 1:. Принцип работы технологии 'химических преобразователей "Когда" химический преобразователь' добавляется в активный белок I (состояние I), он связывается с его активным сайтом через связующее I и ингибирует его активность (состояние II). В присутствии белка II, однако, несвязанный "химический тransducer 'взаимодействует с белком II через вяжущего II, который обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II. Это побудило связующее I-II белок взаимодействие снижает эффективную концентрацию связующего вещества I, что приводит к диссоциации "transducer'-белка I комплекса и белка I реактивации (состояние IV). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез '' Chemical Transducer

  1. Предварительные препараты
    1. Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
      Примечание: Этот раствор стабилен в течение многих лет.
    2. Готовят раствор 5 мМ аскорбиновой кислоты путем растворения 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл сверхчистой воды. Используйте свежий раствор; раствор стабилен в течение одного дня.
    3. Приготовьте Трис (Бензилтриазолилметил) Амин раствор 10 мМ Cu (II) / (ТБТА) путем растворения 25 мг бромида меди (II) пентагидрата сульфата в 10 мл сверхчистой воды и 58 мг ТБТА в 11 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Смешайте два решения. Хранить при комнатной температуре и защитить его от света.
  2. Сопряжение Процедура
    1. Растворить 100 нмоль модифицированного олигонуклеотида (ОДН-1) в 80 мклсвежего сверхчистой воды. Добавьте 20 мкл 2 М ТЕАА, рН = 7. Добавляют 80 мкл свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты (5 мМ в воде).
    2. Растворить 1,5 мкмоль (574,5 мкг) азидо-модифицированного этакриновая кислоты в 180 мкл ДМСО и добавить его к решению. Дегазирования раствора с использованием аргона в течение 60 секунд и быстро добавляют 40 мкл из (II) / раствор ТБТА Cu (10 мМ в 55% (об / об) ДМСО / вода).
    3. снова продувают аргоном, плотно закрыть, и перемешивают в течение ночи.
    4. Контроль за ходом реакции и очистки конъюгата с помощью ОФ-ВЭЖХ (подвижная фаза: А) 5% ацетонитрилом, 5% ТЕАА, 90% сверхчистой водой; Б) 65% ацетонитрила, 5% ТЕАА, 30% сверхчистой воды). 24

2. Управление GST активность по PDGF

  1. Предварительные препараты
    1. Приготовьте 50 мл буфера для анализа путем смешивания 33,9 мл фосфатно-солевом буферном (PBSx1) с 16,1 мл сверхчистой воды для достижения 8 мМ конечной концентрации фосфата и объявлениег 23,8 мг MgCl 2 , чтобы достигнуть конечной концентрации 5 мМ.
    2. Готовят раствор GST M1-1 путем растворения белка в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) и 5 ​​мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 30 мкМ. Разделите это решение в виде небольших аликвот и хранят при -80 ° С. Развести свеже, в соответствии с разделом 2.1.5.1, в буфере для анализа и держать на льду.
      Примечание: Решение будет стабильным в течение приблизительно 5 часов, или до тех пор, пока не будет снижение активности фермента.
    3. Подготовьте субстрат в соответствии со следующими инструкциями:
      1. Растворите 10 мг восстановленного глутатиона (GSH) в 325 мкл сверхчистой воды до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 21 мкл из этого раствора в 979 мкл буфера для анализа до конечной концентрации 2,1 мМ рабочего раствора.
      2. Растворите 10 мг 2,4-динитрохлорбензола (CDNB) в 492 мкл еthanol до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 43,2 мкл из исходного раствора в 956,8 мкл буфера дл анализа до конечной концентрации 4,32 мМ рабочего раствора.
    4. В 96-луночный планшет, поместить каждую подложку в отдельной линии (12 лунок). Вставьте по меньшей мере, 60 мкл в каждую лунку, чтобы обеспечить быстрый и легкий отвод раствора. Закройте планшет с алюминиевым листом для легкой защиты.
    5. Готовят следующие растворы в буфере для анализа:
      1. Развести GST M1-1 от 50 до конечной концентрации 0,6 мкМ димера.
      2. Развести 'химический датчик' до 30 мкМ маточного раствора.
      3. Развести PDGF до конечной концентрации 40 мкМ.
      4. Развести PDGF аптамер до конечной концентрации 250 мкМ.
  2. Измерьте GST активность в присутствии этого "химического датчика" и PDGF.
    1. Настройка процедуры эксперимента Iп-ридере для кинетического измерения.
      1. Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
      2. Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
      3. В появившемся списке вверх на верхней части окна, выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
      4. Нажмите 'Read' в меню слева.
      5. Что касается метода обнаружения выберите 'Absorbance'.
      6. Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
      7. Написать длине волны 340 нм в окне длин волн.
      8. Нажмите на 'Full Plate' снизу на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
      9. 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
      10. Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
      11. Сделайте во время выполнения 10 мин.
      12. Выберите опцию минимальные интервалы.
      13. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      14. Перетащите "читать" линия, которую яNto кинетического измерения.
      15. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      16. Сохранить эксперимент.
      17. Нажмите на кнопку "играть". Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
    2. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготавливают четыре пробы каждая из которых содержит 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Добавить к каждому образцу 0, 1.2, 2.4 или 4.9 мкл PDGF и 123,5, 122,3, 121,1 или 118,6 мкл буфера для анализа, соответственно.
    3. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетных скважинах или только в четных скважин в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
    5. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл от каждого из тон субстраты, которые были предварительно подготовлены в 96-луночного планшета (раздел 2.1.4). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения. Поскольку кинетика GST довольно быстро, стараются свести к минимуму время между добавлением субстрата и началом кинетического измерения.
  3. GST активации / ингибирования Циклы опосредуется 'химического датчика'.
    1. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить 5 образцов каждый из которых содержит 84,5 мкл буфера для анализа, 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    2. Добавить 3,65 мкл буфера для анализа, чтобы образец 1 и 3,65 мкл PDGF для образцов 2-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    3. Добавить 3,12 мкл буфера для анализа до образцов 1-2 и 3,12 мкл PDGF аптамеров к образцам 3-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    4. Добавить 24,4 мкл буфера для анализа в образцах1-3 и 24,4 мкл PDGF к образцам 4-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    5. Добавить 7,8 мкл буфера для анализа в образцах 1-4 и 7,8 мкл PDGF аптамеров для образца 5. инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только в четных скважин в той же строке.
    7. С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из каждой подложки (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
    8. Вычислить V 0 [MOD / мин] при каждом условии вычитанием OD измеренной при длине волны 340 нм при Т = 0,5 мин от OD , измеренной при длине волны 340 нм при Т = 1,5 мин для оценки активации / ингибирования рециркулируемости. 25
  4. Оценка в режиме реального времени отклика "химического преобразователя" к изменениям в окружающей среде.
      <li> В режиме реального времени эффект PDGF дополнение
      1. Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
      2. Повторите шаги 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Сделайте время автономной работы 3,5 мин.
      4. Выберите опцию минимальные интервалы.
      5. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      6. Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
      7. Выберите Plate Out / In в меню слева.
      8. Выберите опцию 'осаждаются (без диалога) ".
      9. Выберите опцию 'Delay' в меню слева и введите 30 сек.
      10. Выберите Plate Out / In в меню слева.
      11. Выберите опцию 'пластину в (без диалога) ".
      12. Создание второго кинетического измерения, повторяя шаги 2.2.1.4 - 2.2.1.14, но в разделе 2.2.1.11 установить кинетическую быть 25 мин вместо 10 мин.
      13. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      14. Сохранить эксперимент.
      15. Нажмите 'PLAКнопка Y '. Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
      16. Готовят два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1 и 1 мкл 'химического датчика' в 38 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
      17. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
      18. Когда пластина открывает (через 3,5 мин), быстро добавить 1,125 мкл PDGF в одну из лунок, осторожно перемешивают и оставляют пластину , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
    1. В режиме реального времени эффект от добавления аптамер PDGF
      1. Повторите шаги 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Подготовить два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1, 1 мкл 'химический датчик ', и 1,125 мкл ФРПТ в 36,9 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
      3. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство, и начать кинетического измерения.
      4. Когда пластина открывает (через 1,5 мин), быстро добавляют 1,2 мкл PDGF аптамеров в одну из лунок, осторожно перемешать и дать пластины , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
  5. Мера JS-K в качестве пролекарств активации с помощью GST в Присутствия 'химического датчика' и PDGF.
    1. Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
      1. Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
      2. Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
      3. В появившемся списке вверх на верхней части окна выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
      4. Нажмите 'Read' в меню слева.
      5. Что касается метода обнаружения выбрал 'Absorbance'.
      6. Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
      7. Написать 305 нм на окне длин волн.
      8. Нажмите на кнопку "Full Plate" на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
      9. 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
      10. Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
      11. Сделайте во время выполнения 10 мин.
      12. Выберите опцию минимальные интервалы.
      13. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      14. Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
      15. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      16. Сохранить эксперимент.
      17. Нажмите на кнопку "играть". Диалог бох появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
    2. Для NO производства измерений используют комплект калориметрическое нитрита / нитрата. В 96-луночный планшет вставки 50 мкл буфера для анализа в один ряд, 70 мкл фенилантраниловая я реагента во второй ряд, и 70 мкл реагента Грисса II в третьем ряду.
    3. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить четыре образца каждая из которых содержит 4,8 мкл 'химического датчика'. Для образца 1, добавляют 155,2 мкл буфера для анализа; к образцу 2, добавить 3,2 мкл GST-M1-1 и 152 мкл буфера для анализа; к образцу 3, добавьте 9,6 мкл PDGF и 145,6 мкл буфера для анализа; и к образцу 4, добавьте 3,2 мкл GST-M1-1, 9,6 мкл PDGF и 142,4 мкл буфера для анализа.
    4. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 50 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только вдаже скважины в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
    6. Добавить 0,54 мкл JS-K (5 мМ в ДМСО) в каждую лунку.
    7. С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из раствора GSH (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет), аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырьков. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
    8. Сразу же после того, как кинетического измерения, с использованием 12-канального мульти-дозаторов, принимать по 50 мкл каждого образца в буфера для строки в заранее подготовленные 96-луночный планшет и быстро добавить к нему 50 мкл фенилантраниловая I реагента и 50 мкл Грисс II реагент. Выдержите, защищая от света в течение 10 мин при комнатной температуре и измеряют поглощение при 550 нм.
      Примечание: Буфер для анализа и объемы реагентов зависят от протокола Аптечки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дизайн, синтез и механизм действия в «химического преобразователя» , который может вызвать искусственную связь между PDGF и GST представлены на рисунке 2. Структура «преобразователя» интегрирует аптамер PDGF ДНК и бис-этакриновая амид (БЭА ), который является известным ингибитором GST (рис 2а). 19 Эти связующие позволяют 'датчик' , чтобы связывать как PDGF и GST с различным сродством, а именно, с константами диссоциации (K D 'ы) от 26 нМ и 144 нМ соответственно . 4 Кроме того, в соответствии с этой конструкции, связывание с PDGF должно вызывать неспецифических взаимодействий между блоком от BEA и поверхностью PDGF, которая бы заметно снизить эффективность ингибитора от BEA. 19,22,23 Рисунок 2b иллюстрирует рабочий механизм, лежащий в основе этой системы. После добавления '' датчика к активному GST, тодве единицы EA одновременно связывают оба активных участков этого димерного фермента и ингибировать его активность. В присутствии ФРПТ, однако,-'transducer ФРПТ комплекс "формируется, который предотвращает устройство от BEA от ингибирования GST. Это в свою очередь приводит к диссоциации GST-'transducer "сложной и GST реактивации. GST, может быть повторно ингибируется добавлением неизмененный PDGF аптамер, который смещает 'химический преобразователь' и позволяет ему снова подавлять GST.

Способность PDGF контролировать активность GST была впервые продемонстрирована путем измерения GST (10 нМ) активность с и без 'химического преобразователя' (500 нм), и измерения активности преобразователя комплекса GST-'chemical 'в присутствии различных концентраций ФРПТ (250, 500 и 1000 нм) (рис 3а). После установления, что "химический преобразователь 'индуцирует искусственную PDGF-GST связь, мыСледующим было установлено, что этот искусственный связи, аналогичны этапам сигнальной трансдукции, также является обратимым и быстро адаптируется к изменениям в окружающей среде. Реверсивный активация / торможение GST проводили последовательными добавлениями PDGF и PDGF неизмененном аптамеров к GST-'chemical преобразователя 'комплекс (рис 3b). Реакция системы на изменения в режиме реального времени в его среде оценивали путем измерения активности GST при добавлении различных входов. Быстрое увеличение GST активности наблюдалось при добавлении PDGF (750 нм) к GST-'transducer 'комплекса (10 500 нм, соответственно) 3,5 минут после добавления основания (рисунок 4а). Аналогичным образом , наблюдалось снижение GST активности при добавлении PDGF аптамеров (5 мкМ) в смеси GST (10 нМ), PDGF (750 нМ), и 'химический преобразователь' (500 нМ) (4б).

Fаконец, мы продемонстрировали способность такой системы, чтобы контролировать активацию пролекарственного в ответ на изменения в окружающей среде. JS-K является противораковым пролекарством активируется GST выделять токсичных NO (Рисунок 5а). Количество NO высвобождается при добавлении JS-K (45 мкМ) в 'химического датчика' (750 нм) и различных комбинаций GST (10 нМ) и PDGF (2 мкМ) были измерены (5б), таким образом подтверждая что только присутствие обоих GST и PDGF приведет к активации предшественника лекарственного средства.

фигура 2
Рисунок 2. 'Химический преобразователь -. Синтез и рабочий механизм (а)' химический преобразователь 'состоит из PDGF аптамеров, ингибитор GST двухвалентный этакриновая амид (EA), флуорофор (FAM) и гасителем (Dabcyl) , Этот конъюгат аптамеров-ингибиторсинтезируют путем присоединения азид-модифицированный этакриновая амид (ЕА) производного к dialkyne-модифицированного и флуоресцентно меченных ДНК аптамеров (ОДН-1). Перепечатана с разрешения автора из ссылки 4. (Б) Ферментативная активность GST ингибируется 'химического датчика', из - за связывания групп EA в активных участках фермента. Добавление ФРПТ приводит к формированию "комплекса, который разрушает 'PDGF-'chemical преобразователь взаимодействия transducer'-GST, поэтому восстановление ферментативной активности. Следующее добавление неизмененном PDGF аптамеров выпускает "химический датчик" и позволяет ему повторно ингибировать фермент. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Fi. фигура 3: PDGF-контролируемых GST активность (а) GST (10 нМ) , ферментативная активность в присутствии (-) и отсутствие (-) от «химического датчика» (500 нМ), и в присутствии 'химического датчика '(500 нМ) с возрастающими концентрациями (250, 500, или 1000 нм) ФРПТ (---). (Б) циклы ингибирования-активации ферментативной активности GST проявляющиеся изменением начальной скорости (V 0) в ответ на последовательные добавлений (ИГВ) ФРПТ и немодифицированной PDGF аптамеров к GST-'chemical преобразователя 'комплекс: (I) не существует, (II), PDGF (750 нМ), (III), PDGF аптамеров (4 мкМ), (IV ) ФРПТ (5 мкМ), и (V), PDGF аптамеров (10 мкМ). На графике представлены среднее значение ± СТАНДОТКЛОН из трех повторах. Перепечатана с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.

Рисунок 4
. Рисунок 4: Управление в реальном времени от GST активности (а) Повышение GST ферментативной активности , обнаруживаемой сразу после добавления 750 нМ PDGF (-) к раствору , содержащему GST (10 нМ) и 'химического датчика' (500 нМ) ( -) при Т = 3,5 мин. (Б) Добавление немодифицированных ФРПТ аптамеров (5 мкМ) (-) к раствору , содержащему GST (10 нМ), PDGF (750 нм), а также "химический датчик" (500 нМ) (-) при Т = 1,5 мин приводит к немедленному уменьшению скорости ферментативной реакции. Перепечатана с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
Рис . 5: Controlled пролекарство активации (а) активации GST из JS-K пролекарством выделять токсичных NO. (Б) не высвобождают в присутствии 'химического датчика' и различными комбинациями GST (10 нМ) и PDGF (2 мкМ). На графике представлены среднее значение ± СТАНДОТКЛОН из трех повторах. Изменено с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Минерва, Фондом HFSP организации, и научно-исследовательского гранта Европейского Совета (Начиная Грант 338265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 115 Искусственный трансдукции сигнала целевого высвобождения лекарственного средства биомиметический химия синтетические белковые рецепторы химическая биология основанные на ДНК белковые рецепторы переключаемых белковые связующие
Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter