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Genetics

शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग

Published: June 10, 2017 doi: 10.3791/54399
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Innovation Laboratory, Center for Molecular Oncology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Flow-Sorting Core Facility, Weill Cornell Medical College, 3Department of Laboratory Medicine, University of Washington, 4Department of Physiology and Biophysics, Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College, 6Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

यहां, हम एक संयुक्त प्रवाह cytometric सेल सॉर्टिंग और कम इनपुट, अगली पीढ़ी के लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा (सीएलएल) के हॉजकिन रीड-स्टर्नबर्ग (एचआरएस) कोशिकाओं से उच्च-गुणवत्ता वाले, पूरे-एक्सएम डेटा का निर्माण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।

Abstract

शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा की हॉजकिन रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाएं सूजन में लिम्फोसाइटों की पृष्ठभूमि में बहुत ही कम मात्रा में वितरित की जाती हैं और आम तौर पर ट्यूमर द्रव्यमान का 1% से भी कम शामिल होती हैं। बल्क ट्यूमर से प्राप्त सामग्री में लक्षण वर्णन के लिए अपर्याप्त एकाग्रता में ट्यूमर सामग्री होती है। इसलिए, आठ एंटीबॉडी, साथ ही साइड- और फॉरवर्ड-स्कैटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग, इसे बाद में अध्ययन के लिए ट्यूमर से उच्च शुद्धता हजारों एचआरएस कोशिकाओं के साथ तेजी से अलग और ध्यान केंद्रित करने की एक विधि के रूप में वर्णित है। उसी समय, क्योंकि एक्सएम अनुक्रमण के लिए मानक प्रोटोकॉल को आम तौर पर 100-1000 एनजी इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है, जो अक्सर बहुत अधिक होता है, यहां तक ​​कि प्रवाह सॉर्टिंग के साथ, हम उच्च-गुणवत्ता वाले उत्पादन के लिए सक्षम एक अनुकूलित, कम-इनपुट लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं इनपुट डीएनए के 10 एनजी जितना छोटा डेटा यह संयोजन पूरे-ए के हाइब्रिडिज़ेशन कैप्चर के लिए उपयुक्त अगली पीढ़ी के पुस्तकालयों को बनाने में सक्षम हैXome baits या अधिक केंद्रित लक्षित पैनल, वांछित के रूप में स्वस्थ intratumor टी या बी कोशिकाओं के साथ तुलना में एचआरएस कोशिकाओं की तुलना करना, एग्जाम अनुक्रमण, म्यूटेशन, सम्मिलन और विलोपन सहित नकली परिवर्तनों की पहचान कर सकता है, और कॉपी संख्या में बदलाव। ये शोध एचआरएस कोशिकाओं के आणविक जीव विज्ञान को स्पष्ट करते हैं और लक्षित दवाओं के उपचार के लिए रास्ते प्रकट कर सकते हैं।

Introduction

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के परिणामस्वरूप कैंसर जीनोमिक्स में प्रगति ने चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान और कई हेमटोग्लोलिक और गैर हेमेटाल्जिक न्यूप्लाज्म के लिए भविष्यवाणी में महत्वपूर्ण सफलताओं को जन्म दिया है। विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों के आधार पर नई व्यक्तिगत उपचार रणनीतियों को तेजी से कई ट्यूमर प्रकारों में पेश किया जा रहा है (संदर्भ 1 , 2 में समीक्षा) लिम्फोमा जीनोमिक्स में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद शास्त्रीय हॉजकिन लिंफोमा (सीएचएल) में नवोप्लास्टिक एचआरएस कोशिकाओं के जीनोम को अंडरेक्सप्लार्ड किया गया था। एक प्रतिक्रियाशील microenvironment के भीतर नेपलास्टिक एचआरएस कोशिकाओं की कमी से जांच में बाधा आ गई है, जिससे शुद्ध एचआरएस सेल आबादी 3 को अलग करना मुश्किल हो गया है।

प्राथमिक ट्यूमर से व्यवहार्य एचआरएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि फ्रॉम एट अल द्वारा विकसित किया गया था 4 ,सीएफएल ट्यूमर निलंबन से एचआरएस कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से पहचानने के लिए सीडी 30, सीडी 15, सीडी 40, सीडी 5 9, सीडी 45 सीडी 20, सीडी 5, और सीडी 464 से मिलकर इस पद्धति में आठ एंटीबॉडी कॉकटेल का इस्तेमाल होता है। इस पद्धति का उपयोग करके, हम कम से कम 10 7 कोशिकाओं (लगभग 10 मिलीग्राम ऊतक) से युक्त ट्यूमर बायोप्सी से ताजा या फ्रोजन सेल निलंबन से कम से कम 1,000 व्यावहारिक एचआरएस कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम हैं। शुद्धता cytometric विश्लेषण द्वारा शुद्धता 90% से अधिक है और इसका अनुमान दस लगातार मामलों के एक्समो जीनोमिक विश्लेषण द्वारा कम से कम 80%

हमने एक प्रवाह साइटेमेट्रिक सेल अलगाव तकनीक को परिष्कृत किया है, जिसने प्रक्रिया को बहुत कम किया है, जिससे प्राथमिक सीएचएल ट्यूमर 7 से हजारों व्यवहार्य मानव संसाधन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव की अनुमति मिलती है। हमने हॉजकिन लिंफोमा के प्राथमिक मामलों में ट्यूमर कोशिकाओं के पहले पूर्ण-एक्सएम अनुक्रम के रूप में माना जाने वाला तकनीक तैयार करने के लिए तकनीक का उपयोग किया है। हमारा अध्ययन वें प्रदर्शित करता हैएसएचएल मामलों के व्यक्तियों के उच्च-थ्रूपूट, जीनोम-विस्तृत अध्ययन की व्यवहार्यता और सीएलएल पैथोजेनेसिस के पहलुओं की व्याख्या करने की क्षमता के साथ उपन्यास जीनोमिक परिवर्तन की पहचान करने के लिए पहले ही पैदा हुई है।

हमने उच्च-थ्रुपुट जीनोमिक अध्ययनों के लिए निकाले गए डीएनए का उपयोग करने के लिए एक पाइपलाइन विकसित की है। 1,000 से अधिक सॉर्ट एचआरएस कोशिकाओं (न्यूनतम अनुक्रमिक मामलों से प्राप्त) से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने आगे संशोधित अगली पीढ़ी के डीएनए पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया 8 विकसित की, जिससे हमें एडेप्टर लैगिंग दक्षता में वृद्धि करने और डीएनए टुकड़ा पुस्तकालयों को बनाने में मदद मिली। अत्यधिक प्रवर्धन के बिना इस पद्धति से नियमित नैदानिक ​​नमूनों के विश्लेषण और आवर्तक उत्परिवर्तन और क्रोमोसोमल परिवर्तन 7 का पता लगाने की अनुमति मिलती है।

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Protocol

1. ऊतक प्रसंस्करण और बर्फ़ीली

  1. फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) या रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट माध्यम (आरपीएमआई) में लिम्फ नोड ऊतक लीजिए और 24 घंटों के भीतर प्रक्रिया। एक्सपीसिव लिम्फ नोड ऊतक 9 को पेट्री डिश में 2% भ्रूण वाले बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ 10 एमएल आरपीएम के साथ ट्रांसफर करें और इसे एक ताजा स्केलपेल ब्लेड के साथ छानक दें। ऊतक को पीसने / अलग करने के लिए 10 एमएल सिरिंज सवार के पीछे का प्रयोग करें।
  2. एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तरल स्थानांतरण। पेटी डिश और आरपीएमआई 2% एफसीएस की एक अतिरिक्त 10 एमएल के साथ फिल्टर कुल्ला।
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर या हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके एक सेल गिनती प्राप्त करें
    नोट: आम तौर पर, कम से कम 2 x 10 7 कोशिकाओं की संभावना लगभग 5 मिमी 3 सीएचएल लिम्फ नोड ऊतक से होगी। 80% से अधिक की व्यवहार्यता की उम्मीद है, लेकिन यह नमूना द्वारा भिन्न हो सकता है।
  4. 10 मिनट और एस्पिरा के लिए 400 xg पर कोशिकाओं को स्पिन करेंते सतह पर तैरनेवाला बर्फ पर सेल गोली युक्त ट्यूब रखें।
  5. बर्फ पर प्री-ठंड फ्रीज़िंग माध्यम 2 x 10 7 / एमएल की एकाग्रता में ठंड फ्रीज़िंग माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खोलें और पिपेट करने से इसे फिर से खोलें। भंवर न करें 10 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन सेते हैं
  6. नमूनों 1 एमएल / क्रायो शीशी (बर्फ पर पूर्व ठंडा) का नमूना। 1-2 दिनों के लिए शीशियों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में स्थानांतरण करें और उन्हें तरल नाइट्रोजन पर फिर से स्थानांतरित करें।

सेल सेलिंग के लिए सेल सस्पेंशन तैयार करना

नोट: 300-μΛ धुंधला मात्रा में 10 मिलियन कोशिकाओं का उपयोग करके प्रत्येक एंटीबॉडी को ठीक तरह से तने हुए होना चाहिए। सीडी 30 को छोड़कर सभी एंटीबॉडी के लिए परिधीय रक्त का इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके लिए परिधीय खून में केएमएच 2 कोशिका रेखा को बढ़ाया जा सकता है। हम आम तौर पर एंटीबॉडी के निर्माता-अनुशंसित मात्रा के साथ शुरू करते हैं और दो दो गुना कमर और एक दो गुना वृद्धि (चार डेटा बिंदु)प्रत्येक एंटीबॉडी अनुमापन के लिए उदाहरण के लिए, यदि निर्माता 10-μL मात्रा की सिफारिश करता है, तो हम 2, 5, 10, और 20 μL संस्करणों का उपयोग करते हुए अनुमापन करते हैं।

  1. पानी के नहाने को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें प्रीमिक्स को एक गिलास कांच शीशा में एंटीबॉडी का सिकुड़ा हुआ मात्रा और 100 μL की कुल कॉकटेल मात्रा के लिए पीबीएस + 2% बीएसए जोड़ें।
    नोट: यद्यपि हम एंटीबॉडीज़ को इंगित करने की सलाह देते हैं, तो निम्न खंडों को प्रारंभ बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: CD64, 20 μL; सीडी 9 5, 5 μL; सीडी 30, 20 μL; सीडी 5, 10 μL; सीडी 20, 10 μL; सीडी 15, 20 μL; सीडी 40, 5 μL; और सीडी 45, 10 μL।
  2. तरल नाइट्रोजन से शीशी को एक बर्फ की बाल्टी में स्थानांतरण करें जिसमें सूखी बर्फ है जो विच्छेदन को रोकने के लिए है। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में आरपीएमआई / 20% एफसीएस / डीएनज़ (100 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त पूर्व गर्म 50 मिलीलीटर विरंजन माध्यम।
  3. 45 मिलीलीटर विगलन के माध्यम से ताजे ट्यूब में स्थानांतरण करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के बल्ले में एक क्रायोजेनिक शीशी पकड़े हुए कोशिकाओं को तेजी से पिघलनाज केवल जब तक एक बहुत ही छोटा जमे हुए भाग रहता है।
  4. ट्यूब में वायल सामग्री को 45 मिलीलीटर विगलन के माध्यम से डालें। खाली क्रायोजेनिक शीशी 2 बार विगलन माध्यम के 1 एमएल के साथ कुल्ला और rinses गठबंधन।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते डीएनसी पाचन और सेल पुन: संतुलन के लिए अनुमति देते हैं। 10 मिनट के लिए 500 xg पर कोशिकाओं को स्पिन करें और सतह पर तैरने वाले को महाप्राणु की रूपरेखा करें।
  6. लगभग 200 μL में पिघलते हुए मध्यम (5 एमएल) कोशिकाओं में कोशिकाओं को फिर से खोलें और इसे 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करें। 70% फ्रोजन वाले व्यवहार्य सेल की वसूली की उम्मीद है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सॉर्ट किए गए एचआरएस कोशिकाओं की अधिक शुद्धता के लिए जो संलग्न टी कोशिकाओं द्वारा रोशन किए जा सकते हैं, इस चरण में अनलिबैलेड एंटीबॉडी का कॉकटेल जोड़ा जा सकता है (वैकल्पिक प्रोटोकॉल देखें)।
  7. एक एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μL जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए, प्रकाश से सुरक्षित रखें। सॉर्टिंग माध्यम के 3 एमएल जोड़ें, 500 x ग्रा में कोशिकाओं को स्पिन करें10 मिनट के लिए, और सतह पर तैरनेवाला aspirate
  8. 1 एमएल सॉर्टिंग माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खोलें और उन्हें 5 एमएल प्रवाह ट्यूब टॉप स्ट्रेनर में स्थानांतरित करें।
  9. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और सेल स्ट्रेनर दोनों को कुल्ला, एक अतिरिक्त 1 एमएल सॉर्टिंग मध्यम और जगह कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

3. (वैकल्पिक प्रोटोकॉल) टी सेल रोसेट ब्लॉकिंग

नोट: एचआरएस कोशिकाओं को ऊतक वर्गों और सेल निलंबन में टी कोशिकाओं द्वारा रोशन कर दिया जाता है, और ये टी कोशिकाओं क्रमशः एचआरएस अंश को संभावित रूप से दूषित कर सकती हैं इन इंटरैक्शन को सीडी54 और सीडी58 द्वारा एचआरएस सेल पर टी 4 कोशिकाओं , 11 पर एलएफए -1 और सीडी 2 के लिए बाइंडिंग में मध्यस्थता दी गई है। इन इंटरैक्शन को अनलेैलेटेड एंटीबॉडी से इन आसंजन अणुओं के लिए अवरुद्ध किया जा सकता है।

  1. RPMI के 100 μL में 100,000 से 500,000 कोशिकाओं की विभाज्यता
  2. 1 घंटे के लिए बर्फ पर सीडी 2, सीडी 5, सीडी 58 और एलएफए -1 (10 μL प्रत्येक) के लिए बिना लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ सेल निलंबन सेते हैं। टीवह सेल निलंबन अब फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है।

4. सेल वर्गीकरण का उपयोग करते हुए एचआरएस-, बी-, और टी-सेल अलगाव

नोट: यद्यपि हमने 5 लेसरों (सामग्री स्प्रेडशीट देखें) का उपयोग करते हुए एक विशेष अनुसंधान ऑर्डर साधन का इस्तेमाल किया है, लेकिन एंटीबॉडी पैनल में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरायोक्रोम्स की क्षमता के साथ कोई सॉर्टर पर्याप्त होना चाहिए। नीचे दिए गए चरणों का निष्पादन सॉफ़्टवेयर 12 फंक्शन और सेल सॉर्टर ऑपरेशन के मूल ज्ञान के साथ परिचित होना आवश्यक है। कृपया विस्तृत निर्देशों के लिए ऑनलाइन सॉफ़्टवेयर मैनुअल देखें।

  1. साइटोमीटर सेटअप:
    1. कंप्यूटर और लॉगिन चालू करें बीएससी (और बीएससी आउटलेट) पर पावर, और फिर साइटोमीटर पर बिजली। शुरू करने के लिए साइटोमीटर की आंतरिक सीपीयू के लिए कम से कम 90 सेकंड रुको, और फिर लेजर कंट्रोल सॉफ़्टवेयर खोलें और सत्यापित करें कि सभी लेज़रों को संचालित किया गया है। साइटोमीटर सॉफ्टवेयर 13 लॉन्च करें और लॉगिन करें।
    2. साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर के अंदर, "साइटोमीटर → दृश्य कॉन्फ़िगरेशन" पर क्लिक करें। कॉन्फ़िगरेशन उप-प्रोग्राम के लिए संवाद बॉक्स खोलता है, 130-माइक्रोन कस्टम विन्यास को हाइलाइट करें और "सेट कॉन्फ़िगरेशन" और "ओके" पर क्लिक करें। कॉन्फ़िगरेशन उप-प्रोग्राम से बाहर निकलें
    3. साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर में डायलॉग बॉक्स को देखें और "सीएस एंड टी सेटिंग्स का उपयोग करें" पर क्लिक करें। उपकरण में 130-माइक्रोन नोजल स्थापित करें और धारा विंडो में लाल "एक्स" बटन पर क्लिक करके स्ट्रीम को चालू करें। उपकरण को कम से कम 30 मिनट तक गर्म करने की अनुमति दें
    4. वांछित विधि का उपयोग करके उपकरण पर प्रदर्शन की जांच करें (एक प्रदर्शन-ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर मॉड्यूल यहां वर्णित सॉर्टर के साथ शामिल है, सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें (पीपी। 117 - 122) और संदर्भ मानक (इसमें इस्तेमाल मानक के लिए सामग्री देखें यह सेटअप)
      1. "साइटोमीटर → सीएसटी" पर क्लिक करें, यह सुनिश्चित करें कि "विशेषता" फ़ील्ड "Chec" पर सेट हैकश्मीर प्रदर्शन "पर क्लिक करें, और" भागो "पर क्लिक करें। जब सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत दिया जाता है, नमूना चरण पर संदर्भ कणों की एक ट्यूब लोड करें और" ओके "पर क्लिक करें।
      2. रन पूर्ण होने के बाद, "समाप्त" पर क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर मॉड्यूल बंद करें। साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर ने साइटोमीटर से पुनः कनेक्ट होने के बाद, दिखाई देने वाले डायलॉग बॉक्स में "सीएस एंड टी सेटिंग्स का उपयोग करें" पर क्लिक करें।
    5. साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर की स्वचालित ड्रॉप विलंब सुविधा का उपयोग करके सही ड्रॉप देरी का निर्धारण करें (सॉफ्टवेयर मैनुअल का पृष्ठ 154 - 161 देखें)।
      1. साइटमोर सॉफ्टवेयर के "ब्राउज़र" विंडो में "ड्रॉप डेले" प्रयोग खोलें, नमूना चरण पर कैलिब्रेशन कणों की एक ट्यूब स्थापित करें, और "अधिग्रहण डैशबोर्ड" विंडो में "लोड" पर क्लिक करें। "स्ट्रीम" विंडो में "स्वीट स्पॉट" बटन पर क्लिक करके स्वचालित स्ट्रीम मॉनिटरिंग सुविधा को चालू करें। सभी फ़िलिन के लिए इस सुविधा को हर समय छोड़ देंजी कदम
      2. साइड-स्ट्रीम विंडो में "वोल्टेज" बटन पर क्लिक करके विक्षेपन प्लेट वोल्टेज चालू करें, और फिर "वोल्ट" बटन से तत्काल "टेस्ट सॉर्ट" बटन पर क्लिक करके टेस्ट सॉर्टिंग चालू करें।
      3. बाईं तरफ स्ट्रीम को छोड़कर सभी पक्ष स्ट्रीम सेटिंग्स को शून्य में समायोजित करें बाईं ओर की स्ट्रीम सेटिंग को समायोजित करें जैसे कि दो स्ट्रीम-स्पॉट साइड-स्ट्रीम विंडो में दिखाई दे रहे हैं। "ऑप्टिकल फ़िल्टर" बटन पर क्लिक करें और सत्यापित करें कि बाईं ओर-स्ट्रीम स्थान बाएं बॉक्स के भीतर आ जाएगा जो साइड-स्ट्रीम विंडो के काली क्षेत्र में दिखाई देता है।
      4. यदि आवश्यक हो तो बाईं ओर-स्ट्रीम सेटिंग समायोजित करें फिर "टेस्ट सॉर्ट करें" बटन पर क्लिक करके टेस्ट सॉर्टिंग को बंद करें "ब्राउज़र" विंडो में, "+" पर क्लिक करके "ड्रॉप विलंब" प्रयोग के "ग्लोबल वर्कशीट" तत्व का विस्तार करें।
      5. सॉर्ट लेआउट को खोलने के लिए "सॉर्ट लेआउट_001" पर डबल-क्लिक करें, विज़ुअल इन्वेस्ट द्वारा सत्यापित करेंआयन यह है कि बाईं तरह की जनसंख्या में "P1" को निर्दिष्ट किया गया है, और "सॉर्ट लेआउट" विंडो में "सॉर्ट" पर क्लिक करें। "सॉर्ट लेआउट" विंडो में, "ऑटो डेले" पर क्लिक करें और फिर "रन" क्लिक करें।
      6. रन पूर्ण होने पर, "बाहर निकलें" पर क्लिक करें। नमूना चरण पर बाँझ विआयनीकृत पानी की एक ट्यूब स्थापित करें और "अधिग्रहण डैशबोर्ड" विंडो में "लोड" पर क्लिक करें। चलने से पहले यंत्र से अवशिष्ट परीक्षण कणों को साफ करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए पानी की ट्यूब चलाएं।
    6. सॉर्ट सॉफ़्टवेयर में निर्मित मुआवजा सेटअप का उपयोग करके मुआवजा नियंत्रण (सामग्री स्प्रेडशीट या समकक्ष से मुआवजे की मोती का उपयोग करके) (अतिरिक्त विवरण के लिए सॉफ्टवेयर मैनुअल के पृष्ठ 131 - 137 देखें)।
      1. "प्रयोग नई प्रयोग" पर क्लिक करके एक नया प्रयोग बनाएं। "साधन स्थिति" विंडो के "पैरामीटर" टैब में, अप्रयुक्त पैरामीटर हटाएं, यदि कोई हो। पर क्लिक करें "प्रयोग मुआवजाआयन सेटअप मुआवजा नियंत्रण बनाएँ। "
      2. "ब्राउज़र" विंडो में, "+" चिह्न पर क्लिक करके "मुआवजा नियंत्रण" नमूना का विस्तार करें डेटा रिकॉर्ड किए बिना मुआवजा नियंत्रण ट्यूबों को चलाने के लिए, और यदि आवश्यक हो, डिटेक्टर वोल्ट्स ("उपकरण स्थिति" विंडो के "पैरामीटर" टैब में) को समायोजित करें ताकि प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए सकारात्मक-दाग वाले आबादी 10,000 और 100,000 चैनल के बीच हो और उनके प्राथमिक पता लगाने के चैनल में प्रतिभाशाली।
      3. प्रत्येक ट्यूब के लिए प्रत्येक पैरामीटर के लिए आवश्यक वोल्ट्स लिखें। एकल बायाँ-क्लिक करके "मुआवजा नियंत्रण" नमूना के तहत "अस्थिर नियंत्रण" ट्यूब को हाइलाइट करें नमूना चरण पर अस्थिर नियंत्रण ट्यूब लोड करें और "अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में "लोड करें" क्लिक करें।
      4. सभी मापदंडों के लिए डिटेक्टर वोल्टेज फ़ील्ड में व्यक्तिगत मुआवजा नियंत्रण चलाकर मैन्युअल रूप से निर्धारित वोल्टेज दर्ज करें, औरफिर "अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में "रिकॉर्ड" पर क्लिक करें। किसी भी डिटेक्टर सेटिंग्स को बदलने के बिना डेटा रिकॉर्डिंग, शेष शेष मुआवजा नियंत्रण चलाएं। आगे बढ़ने से पहले साधन से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को साफ करने के लिए 5 मिनट के लिए बाँझ, विआयनीकृत पानी की एक ट्यूब स्थापित करें।
  2. एचआरएस-सेल गेटिंग:
    1. 3,000-4,000 इवेंट / एस (चरण 4.1 देखें) के अधिग्रहण के प्रवाह दर को समायोजित करते समय प्रारंभिक गेट के लिए कम से कम 100,000 घटनाएं प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें।
      नोट: सेल एकाग्रता बहुत अधिक है, तो कोशिकाओं को पतला करने के लिए अतिरिक्त सॉर्टिंग माध्यम जोड़ना आवश्यक हो सकता है। अधिग्रहण बंद करो
    2. गेट एचआरएस कोशिकाओं चित्रा 1 में उल्लिखित चरणों का उपयोग करते हुए
      नोट: अधिकांश सीएचएल मामलों में, 0.01% और 0.1% कोशिकाओं के बीच एचआरएस कोशिकाएं होंगी।
  3. बी- और टी-सेल गटिंग:
    1. सीडी 20 और सीडी 5 के गेटिंग द्वारा दैहिक नियंत्रण (बी और टी कोशिकाओं) को पहचानें, फिर से करेंCtively (सीडी 45 / एसएसएच द्वारा गिटिंग लिम्फोसाइट्स), सीडी 20 बनाम सीडी 5 द्वारा ( चित्र 1 देखें)।
    2. पूर्व-ठंडा दो-तरफा या चार-रास्ता संग्रह रैक में संग्रहण ट्यूबों को संग्रहित करने के लिए लक्ष्य। संग्रह माध्यम के साथ कम से कम आधे रास्ते या तो प्रवाह ट्यूब या 15-एमएल अपकेंद्रित्र-स्टाइल ट्यूब भरें।
    3. विक्रेता निर्देशों के अनुसार सॉर्ट सेटअप में उचित संग्रह ट्यूबों के लिए एचआरएस और नियंत्रण आबादी निरुपित करें। सेल अधिग्रहण को पुनरारंभ करें और सॉर्ट प्रारंभ करें
    4. सभी एचआरएस कोशिकाओं को एकत्र करें और 1 मिलियन बी और टी कोशिकाओं तक। एक पूर्व-ठंडा चार-तरफा (या दो-तरफा) संग्रह रैक में संग्रह ट्यूबों को संग्रहण धाराओं को लक्षित करें।

5. डीएनए निकालना

  1. गोली को एकत्रित किए गए कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में 10 मिनट के लिए 3,000 xg में सेंटीफ्यूजेशन करके और कोशिकाओं को धोने के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार पुन:
  2. गोली एक बार फिर 3,000 xg पर 10 मिनट और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें; परेशान न करने के लिए सावधान रहेंछोटे गोली
  3. 150 μL लसीस बफर (या किट के लिए उचित मात्रा में इस्तेमाल किया जाता है) को धोया कोशिकाओं में जोड़ें और ऊपर और नीचे पिपेट करके मिश्रण करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो कोई भी इस बिंदु पर -70 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate स्टोर कर सकता है
  4. ट्यूब के भीतर फिल्टर कॉलम को रखकर एक स्तंभ असेंबली बनाएं और चरण 5.5 से कॉलम में lysate जोड़ें। 3 मिनट के लिए 13,000 xg पर विधानसभा को स्पिन करें
  5. विधानसभा से मिंकोलॉलम निकालें और संग्रह ट्यूब में तरल को त्यागें। संग्रह ट्यूब में minicolumn बदलें
  6. प्रत्येक विधानसभा में 650 μL स्तंभ धोने के समाधान जोड़ें। 1 मिनट के लिए 13,000 x ग्रा में अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब से तरल को त्यागें। इस चरण को कुल 4 धोने के लिए दोहराएं।
  7. संग्रह ट्यूब से तरल को त्यागें और minicolumn विधानसभा reassemble। बाइंडिंग मैट्रिक्स सूखने के लिए 13,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  8. मिंकोलॉलमेंट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर कर दें और 25 एमएल 10 एमएम ट्राइस-सीएल में जोड़ें, जोबाद के सोनिकेशन चरण के लिए पसंद किया जाता है, या न्युकैसे-फ्री पानी को 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं और 1 मिनट के लिए 13,000 xg पर विधानसभा को अपकेंद्रित करें। एक बार फिर 50 μL के लिए 25 μL के साथ दोहराएं।
  9. फ्लिपोरिमीट्री का इस्तेमाल करते हुए डीएनए अल्युशन को ऊपर और नीचे pipetting करके मात्रा में बढ़ाएं।

6. पुस्तकालय निर्माण

  1. शुरुआत से पहले तैयारी:
    1. पानी के स्तर पर sonicator 12 सेट, तीव्रता 5, साइकिल / 200 फट, और 7 अस्थायी।
    2. फ्लोराइमेट्री द्वारा निर्धारित प्रायोगिक डिजाइन पर उपलब्ध डीएनए मात्रा के आधार पर, पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयोग करने के लिए डीएनए की मात्रा निर्धारित करते हैं।
      नोट: ध्यान रखें कि यदि बहुत कम डीएनए का प्रयोग किया जाता है और पुस्तकालय गुणवत्ता में समझौता किया गया है, तो ऐसी सामग्री के लिए थोड़ा सा आवेदन हो सकता है जो सत्यापन उद्देश्यों के लिए पीछे छोड़ दिया जाता है। घटिया इनपुट मात्रा के लिए, अधिक से अधिक इनपुट द्रव्यमान, उच्च कंपपरिणामस्वरूप अनुक्रमण लाइब्रेरी की आशंका इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ दिशानिर्देश इस प्रकार हैं: 10 एनजी को अच्छे परिणाम मिलना चाहिए, और 50 एनजी को किसी न किसी अधिकतम माना जा सकता है।
    3. एडेप्टर पर निर्णय लें: तालिका 1 में मूल्यों पर शिथिल आधार पर दाढ़ अनुपात डालें।
    4. निम्नलिखित फ़ैशन में उपयोग करने के लिए एडेप्टर की मात्रा की गणना करें:
      नोट: डीएनए इनपुट के moles की संख्या, n
      मैं। एन = 1.54e-12 -12 * इनपुट द्रव्यमान (एनजी) / (मतलब टुकड़ा आकार)
      ii। जब मतलब टुकड़ा आकार 200 बीपी है, यह करने के लिए सरल:
      N = 7.7e-15 * इनपुट द्रव्यमान (एनजी)
      एडेप्टर के मोजे की संख्या शामिल करने के लिए, ए
      मैं। ए = एन * आर
      एडेप्टर बंधन चरण में उपयोग करने के लिए एडेप्टर स्टॉक का वॉल्यूम, v
      मैं। V ( μL में ) = a / [ 10 -12 * एडाप्टर स्टॉकएकाग्रता (माइक्रोन में )]
      नोट: अगर एडेप्टर एकाग्रता कम है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एडाप्टर की आवश्यक राशि शामिल है, एडेप्टर समाधान का उपयोग पानी के बदले अंत-मरम्मत अभिकर्मकों को पतला करने के लिए किया जा सकता है।
      उदाहरण: वांछित ध्रुवीय एडाप्टर के लिए, 200 बीपी के एक औसत टुकड़ा आकार के 100 डीएनए इनपुट डीएनए के लिए: 15: 1 का सम्मिलन अनुपात और 2 μM के एक एडाप्टर स्टॉक एकाग्रता, उपयोग करने के लिए एडाप्टर की अनुशंसित मात्रा 5.8 μL है।
    5. नमूनों को अनुक्रमित बारकोड असाइन करें।
      नोट: लाइब्रेरी जो एक संकरित प्रतिक्रिया या एक सेक्वेन्सर के फ्लो सेल पर एक लेन में जमा हो जाएगी, में कोई अनावश्यक सूचकांक नहीं होना चाहिए।
  2. पुस्तकालय निर्माण - डीएनए कर्तन:
    1. एक sonication ट्यूब के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए डीएनए की पूरी राशि जोड़ें यदि इनपुट डीएनए युक्त नमूना की मात्रा 50 μL से कम है, तो बफर ईबी को 50 μL कुल मात्रा में जोड़ें और मिश्रण करें।
    2. 3 के लिए सोनाइट0 एस
    3. ट्यूब को निकालें और मिनी-सेंट्रीफ्यूज में एक त्वरित स्पिन करें जो कि सूक्ष्मयुग्म की दीवारों के ऊपरी हिस्से से किसी स्प्रे को इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त है।
    4. कुल मिलाकर 210 एसओएक्शन के लिए कुल सात 30-एस सोयक्शन सत्रों के लिए चरण 6.2.2-6.2.3 को दोहराएं।
      नोट : कम से कम सत्र में 210 एस को विभाजित करने के लिए प्रयोग करने के लिए स्वतंत्र महसूस करें।
  3. लाइब्रेरी निर्माण - समाप्ति की मरम्मत, ए-टेलिंग और एडॉप्टर लघाई:
    नोट: लायब्रेरी पीसीआर प्रवर्धन कदम से पहले किसी भी आकार का चयन करने से बचें।
    1. नमूना डीएनए के सोनिकिंग के बाद निर्माता की निर्देशों का पालन करें, 1 9 मरम्मत और ए-टेलिंग के लिए।
    2. ए-टेलिंग के बाद, प्रतिक्रिया में एडॉप्टर के मोजे की उचित संख्या (चरण 6.1.3 में गणना) का उपयोग करें। एडेप्टर, ए-टेल डीएनए टुकड़े, एंजाइम, और बफर का मिश्रण करें और लगभग 16 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. लिबअनुदार निर्माण - पुस्तकालय प्रवर्धन:
    1. एडेप्टर ligation प्रतिक्रिया की एक मनका सफाई करें। पीसीआर उत्पाद को मोती जोड़ने के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट की प्रतीक्षा करें। इसे चुंबकीय स्टैंड के खिलाफ रखें और तरल पदार्थ को हटा दें, 200 μL में 80% इथेनॉल में दो बार धो लें, लंबे समय तक मोती को सूखने के लिए पर्याप्त सूखने के लिए अधिक सूखने के बिना अधिकतर तरल निकालें, और 25 μL pipetting द्वारा मोतियों के डीएनए बंद elute नुकीले-मुक्त पानी, जैसा कि सुझाव दिया गया है, मोती पर, जबकि ट्यूब एक चुंबकीय स्टैंड के खिलाफ है।
      नोट: पॉलीथीन ग्लाइकोल में मोतियों को संरक्षित करने के साथ प्रयोग करना संभव हो सकता है
      (पीईजी) उन्हें हटाने के बजाय प्रवर्धन के बाद तक, लेकिन यह परीक्षण नहीं किया गया है।
    2. पीसीआर मास्टर मिक्स के 50 μL प्रति ग्रीन डाई के 1: 1000 कमजोर पड़ने के 0.6 μL को शामिल करें। वैकल्पिक रूप से, उपकरणों के लिए उचित मात्रा में एक वास्तविक समय पीसीआर-संगत अंतरकोण करने वाला डाई का उपयोग करें।
    3. पीसीआर प्रतिक्रिया 98 डिग्री सेल्सियस पर कार्यक्रम के लिएप्रारंभिक विकृति के लिए 45 एस, बाद में विकृतियों के एक चक्र, एनीलिंग, और विस्तार के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस, 30 डिग्री के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 30 डिग्री के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, या वैकल्पिक प्रोग्राम का उपयोग करते हुए उपयुक्त प्रोग्राम का चयन करें पोलीमरेज़ एंजाइम
      1. प्रत्येक चक्र के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिदीप्ति डेटा लेने के लिए मशीन सेट करें। एक अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए, एक अनिश्चित अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ के बाद। पूरक तालिका में अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए एडाप्टर-लिगेटेड लाइब्रेरी के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्राइमरों हैं: ओलिगो 1, एएटीजीटीएसीजीजीसीसीएसीसीसीएसीएजीएए और ओलिगो 2, सीएजीसीएगैएजीएसीजीजीटीएसीएजीएजी
    4. एक्सपीसीआर सॉफ्टवेयर के साथ वास्तविक समय में प्रतिदीप्ति तीव्रता मानों को देखते हुए ऊपर वर्णित पीसीआर शर्तों का उपयोग करते हुए लाइब्रेरी को बढ़ाएं, घातीय वृद्धि चरण के अंत से पहले रोक।
    5. प्रवर्धन के बाद, एक मानक मनका सफाई करते हैं (देखें कदम 6.4.1) प्रवर्धन प्रतिक्रिया recov की मात्रा 0.8x का उपयोग करईरेड, आमतौर पर 0.8 x 50 = मोती के 40 μL। पीसीआर उत्पाद के लिए मोती जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट की प्रतीक्षा करें।
    6. इसे चुंबकीय स्टैंड के खिलाफ रखें और तरल पदार्थ को हटा दें, 200 μL में 80% इथेनॉल में दो बार धो लें, लंबे समय तक मोती सूखने के लिए पर्याप्त सूखने के बिना अधिकतर तरल पदार्थ निकाल दें, और सूखे मोतियों के लिए नुकलेज़-मुक्त पानी को जोड़कर सुशोभित करें।
    7. फ्लोराइमेट्री का परिणामस्वरूप डीएनए को बढ़ाएं। आकार के लिए पुस्तकालय टुकड़े कल्पना; अधिक जानकारी के लिए डेटा क्यूसी उम्मीदों पर अनुभाग देखें।

7. एक्सएम हाइब्रिडाइज़ेशन

  1. अलग एडेप्टर बार कोड वाले चार पुस्तकालयों को मिलाएं।
    नोट: फ्लोराइमेट्री और जेल के आकार से मास मृदुता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, और फिर पुस्तकालयों को पूलित पुस्तकालय के कुल 1000-एनजी द्रव्यमान के लिए समिवोलर मात्रा में मिलाया जाता है। अलग-अलग पूल में उन्हें अलग करने के बजाय सभी ट्यूमर-सामान्य जोड़े को एक साथ रखना बेहतर है।
  2. Exome कैप्चर प्रोटोकॉल लागू करें अप क्लास = "xref"> 15 और करो 8 पीसीआर चक्र को पकड़ने की सफाई के बाद। कैप्चर लक्ष्य के अन्य विकल्प संभव हो सकते हैं

8. बहुसंकेतन अनुक्रमण

  1. सामग्री स्प्रैडशीट 16 में संदर्भित अनुक्रमण मंच पर एक एकल लेन में चार मल्टीप्लेक्ज़ेड लाइब्रेरी वाले एक एकल हाइब्रिडिज़ेशन कैप्चर को अनुक्रमित करें।
    नोट: उन्नत उपयोगकर्ताओं के लिए वैकल्पिक कॉन्फ़िगरेशन संभव है, जो अपने लक्षित कवरेज की गहराई को और योजना बनाने और अनुकूलित करने की इच्छा रखते हैं।

9. विश्लेषण (वैकल्पिक पाइपलाइन के साथ बदली जा सकता है अगर वांछित)

  1. स्नैप्स और छोटे इंडल्स:
    1. मानव संदर्भ जीनोम, यूसीएससी एचजी 1 9 को कच्चे डेटा का नक्शा करें, बोरो-व्हीलर एलिगेनर (बीडब्ल्यूए) 17 या पसंद का एक वैकल्पिक एल्गोरिदम का प्रयोग करें। फ़िल्टर या निशान 20 से नीचे एक मैपिंग गुणवत्ता स्कोर और पीसीओ डुप्लिकेट्स समतोल 18 या पिकार्ड के साथ पढ़ता हैरिफ "> 1 9
    2. स्टेरलका 20 या पसंद के एक भिन्न कॉलर का उपयोग करते हुए टी-सेल दैहिक नियंत्रणों की तुलना में एचआरएस नमूनों में दैहिक न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और छोटे इंडल्स का पता लगाएं। स्ट्रेल्का आउटपुट को एनोटेट करने के लिए snpEff 21 लागू करें। अगर वांछित, इंटीग्रेटेड जेनोम व्यूअर (आईजीवी) 22 , 23 का उपयोग करते हुए कलाकृतियों के लिए वेरिएंट लोकी का व्यवस्थित रूप से निरीक्षण करें।
  2. कॉपी संख्या की प्रतिलिपियां:
    1. निम्न प्रकार में सामान्य के उन लोगों के खिलाफ ट्यूमर में इंट्रा-लाइब्रेरी के हर एक्समो लक्ष्य अंतराल " i " के लिए लॉग-ट्रांसफार्म किए गए अनुपात " ltr " की गणना करें।
      समीकरण
      नोट: सी एक कैप्चर अंतराल के लिए मानचित्रण पढ़ता है, एल कुल संख्या है, एल कुल पुस्तकालय आकार है, टी ट्यूमर को दर्शाता है, और n सामान्य दर्शाता है।
    2. आगे के विश्लेषण के लिए अपर्याप्त कवरेज ( सी टी + सी एन <100 पढ़ता) के साथ अंतराल फ़िल्टर करें। डीएनसीपीपी v.1.0 24 का उपयोग करके पैन-अंतराल विभाजन का संचालन आरओ में जैवसंहारक से
      नोट: उन खंडों पर विचार करें जहां प्रति लीटर का पूर्ण मूल्य 0.5 से नीचे है, जो कॉपी-तटस्थ है। शेष वर्गों को कॉपी संख्या लाभ के रूप में नामित किया जा सकता है, यदि माध्य ltr का संकेत सकारात्मक है (दूसरे शब्दों में, सामान्यकरण के बाद सामान्य नमूने की तुलना में ट्यूमर के नमूनों में काफी अधिक पढ़ा जाता है), या संख्या हानि की प्रतिलिपि, यदि संकेत माध्य ltr का नकारात्मक है

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Representative Results

लाइब्रेरी प्रवर्धन और 0.8 एक्स बीड सफाई के बाद एक बायोएनिलाइज़र प्लॉट लिया जाना चाहिए। किसी को इच्छित श्रेणी ( चित्रा 2 ए ) में टुकड़े के आकारों के "सामान्य समान" वितरण देखना चाहिए। इस आकृति से विचलन, जैसे वक्र में एक दृश्य "कंधे", एक उच्च या कम आणविक वजन कलाकृतियों की उपस्थिति दर्शाते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 बी -2 डी दृश्य कलाकृतियों वाले पुस्तकालयों के उदाहरणों को दिखाता है, जिन्हें आदर्श रूप से अनुक्रमित नहीं किया जाना चाहिए। यदि कोई लाइब्रेरी महत्वपूर्ण रूप से समझौता कर रही है, तो डीएनए उपलब्ध होने और / या नए सिरे से शुरू करने के लिए पुस्तकालय निर्माण दोहराने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

एक एडाप्टर डिमर कभी-कभी पहले 0.8 एक्स बीड क्लीनअप के माध्यम से ले जा सकता है। यदि ऐसा होता है, तो यह 125-130 बीपी के आसपास केंद्रित एक तेज शिखर के रूप में दिखाई देगा (देखें चित्रई 2 सी)। इस मामले में, एक अतिरिक्त 0.8x बीड क्लीनअप को दोहराने और डिमर के सफल हटाने को सुनिश्चित करने के लिए बायोएनिलाइज़र को दोहराने के लिए सलाह दी जाती है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विनिर्देशों का उपयोग करना और सामग्री स्प्रैडशीट में लिखे गए सीक्वेंसर में लेन-देन में चार नमूनों के स्तर पर अनुक्रमण को मल्टीप्लेक्सिंग करना, लक्ष्य में 50-100x की कवरेज की एक औसत गहराई (पीसीआर डुप्लिकेट के बायोइनफॉरमैटिक्स हटाने के बाद पढ़ता है) प्राप्त है ( चित्रा 3 ए देखें)। इसके अतिरिक्त, लाइब्रेरीज़ जिन्हें ओवरमाप्लीफाइड नहीं किया गया था और जो कि पर्याप्त कवरेज वाले लाइब्रेरी के कारण साफ कॉपी संख्या वाले भूखंडों का उत्पादन करना चाहिए। प्रारंभिक कार्य के दौरान, इस लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल को इनपुट द्रव्यमान के परिमाण के तीन आदेशों पर परीक्षण किया गया था, और चर परिणाम (डिस्कशन अनुभाग देखें) की खोज की गई थी। 1 एनजी से उत्पन्न लाइब्रेरी का उपयोग करते हुए नंबर प्लाट की प्रतिलिपि बनाएँ, इनपुट डीएनए की एक उप-इष्टतम राशि, नकली नकल संख्या में लाभ और घाटे ( चित्रा 3 बी , नीचे) के परिणामस्वरूप ।

सीएलएल के लगभग 70% मामलों में बी 2 एम और ए 20 म्यूटेशन और / या विलोपन 7 शामिल हैं । बी 2 एम के उत्परिवर्तनों में मुख्य रूप से एक अनुवादिक प्रारंभिक साइट, एक पहले एक्सॉन स्टॉप साइट, और एक पहले एक्सॉन स्टॉप साइट शामिल है। ए 20 म्यूटेशन कॉपी संख्या के नुकसान और इंडल्स का मिश्रण है। उत्परिवर्तन क्लोन होने लगता है और सापेक्ष ट्यूमर सामग्री का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यदि टी कोशिकाओं को दैहिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, तो एचआरएस अनुक्रमण में टी-सेल रिसेप्टर अल्फा / डेल्टा (14 -111-12) और बीटा पदों (7q32 -35) से संबंधित स्थितियों में उल्लेखनीय प्रति संख्या लाभ, साथ ही साथ में महत्वपूर्ण हानि दिखाई देगा बी सेल रिसेप्टर भारी श्रृंखला (14q32) और कप्पा लाइट चेन पदों (2p11) ( चित्रा 4 देखें)। कुल मिलाकर अनुक्रमण प्रत्येक मामले में 100 से 400 दैहिक उत्परिवर्तनों की सीमा को दर्शाता है। प्रतिलिपि संख्या भिन्नता अत्यधिक है vमामला से मामला दर्ज किया जा सकता है, कुछ मामलों में कई कमानी लाभ और नुकसान और अन्य मामलों में केवल कुछ ही बदलाव दिखाए जाते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: व्यवहार्य एचआरएस, बी, और टी कोशिकाओं के फ्लो-सॉर्टिंग के लिए मल्टिप्ारामीटर गैटिंग। जनसंख्या के नाम भूखंडों पर दिखाए जाते हैं और किसी भी द्वार की माता-पिता आबादी का संकेत देते हैं। ( ए ) सभी कक्षों को दिखाता है: एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए हिस्टोग्राम पर एक सिंगलटेट गेट बनाएं, जिसमें आनुपातिक एफएससी-एच और एफएससी-ए बढ़ने के साथ जनसंख्या शामिल है। दोहराएं छोड़ दें जिनमें उच्च एफएससी-ए और निम्न एफएससी-एच है। हॉजकिन कोशिका बहुत बड़ी हैं; उच्च एफएससी-एच और एफएससी-ए इवेंट्स को शामिल करने के लिए फाटक का विस्तार ( बी ) मलबे, मृत कोशिकाओं और अनारक्षित आरबीसी को छोड़ दें, जो आमतौर पर कम से कम एफएससी-ए और एसएससी-एच में मामूली वृद्धि से व्यवहार्य आबादी (व्यावहारिक गेट) काट नहीं लेते हैं। ( सी ) गेट मॉनोन्यूक्लेअर कोशिकाओं परउच्च एसएससी-एच के साथ ग्रैनुलोसाइट्स को बाहर करने के लिए एफएससी-ए बनाम एसएससी-एच; ध्यान दें कि गेट केवल टी और बी कोशिकाओं की पहचान के लिए उपयोग किया जाता है। ( डी ) गेट टी सेलस सीडी 520 और बी सेलल्स (नीला) के बिना सीडी 5 (हरा) द्वारा सकारात्मक रूप से पहचाना गया है, जिसमें सीडी 5 के बिना सीडी 20 अभिव्यक्ति है। ( ई ) CD45 / SSH प्लॉट पर एक बड़ा द्वार बनाएं, जिसमें 10-20% लिम्फोइड कोशिकाएं और सभी ग्रैन्यूलोसाइटिक कोशिकाएं शामिल हैं। ( एफ ) गेट सीडी 30-पॉजिटिव इवेंट डिम से नकारात्मक सीडी 64 / एफआईटीसी ऑटोफ्लोरेसेंस। ( जी ) सीडी 30 सकारात्मक घटनाओं में, गेट सीडी40- और सीडी 9 5-सकारात्मक घटनाएं (सीडी 30/40/95 एचआरएस फाटक, लाल)। एचआर ( एचएल ) एचआरएस कोशिकाओं पर पुष्टि की इम्यूनोफेनोटाइपिक फीचर देखें; एचआरएस कोशिकाओं में आम तौर पर सीडी 20 (भूखंड एच और एल) व्यक्त नहीं होते हैं। टी-सेल रोसेटिंग (आई) के कारण सीडी 5 की अभिव्यक्ति CD45 के साथ सहसंबंधित है; ज्यादातर मामलों में सीडी 15 की अभिव्यक्ति दिखाई देगी और सीडी 71 ( जे ) के लिए उज्ज्वल होगी। CD40 और CD95 अभिव्यक्ति सामान्यतः बी और टी कोशिकाओं के स्तर से ऊपर होती है, resp Ectively ( कश्मीर ) यह शोध मूलतः रक्त 7 में प्रकाशित हुआ था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: एडेप्टर Ligation और प्रवर्धन के बाद नमूनों का आकार वितरण प्लॉट। आदर्श रूप से, दृश्य कलाकृतियों के साथ पुस्तकालयों को दोहराया जाना चाहिए और अनुक्रमित नहीं होना चाहिए। ( ए ) अच्छी तरह से बनाई गई पुस्तकालय; कोई दृश्यमान कलाकृतियों ( बी ) वक्र में विषमता एक समस्या का पता चलता है (सी) महत्वपूर्ण एडेप्टर डिमर (128 में पीक) और एक उच्च आणविक वजन कलाकृति (> 400 बीपी)। एक अतिरिक्त 0.8x बीड क्लीनअप के साथ डिमर को साफ किया जा सकता है। ( डी ) महत्वपूर्ण उच्च आणविक वजन कलाकृतियों।S / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: इनपुट डीएनए के 1 एनजी से की गई निम्न-गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों की तुलना में 10 डीएनए इनपुट डीएनए से बनाए गए उच्च-गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों के लिए जैव सूचनात्मक गुणवत्ता नियंत्रण मापन। कवरेज उम्मीदों की अनूठी पठन गहराई का परिमाण और वितरण। ( ए ) 10-100 एनजी इनपुट डीएनए का उपयोग करते समय कम से कम 50 की कवरेज की एक औसत गहराई की उम्मीद है। ( बी ) 2 पैनलों में से प्रत्येक 2 अनुक्रमित पुस्तकालयों के बीच डेटा की तुलना करते हुए कॉपी संख्या भिन्नता विश्लेषण परिणाम दर्शाता है। एक्सोनिक प्रोब सेगमेंट्स (एक्स-एक्स) बनाम लॉग संख्या 2 पैमाने (y- अक्ष) पर कॉपी संख्या में परिवर्तन एक एकल प्रतिनिधि क्रोमोसोम (सीआरआर 6) के लिए प्लॉट किया जाता है। Intratumoral से 10 एनजी कम इनपुट लाइब्रेरी से डेटा की तुलना करनाटी-सेल डीएनए से 100 एनजी सामान्य-इनपुट लाइब्रेरी में एक ही मामले से intratumoral टी-सेल डीएनए से कोई महत्वपूर्ण गलत-सकारात्मक परिणाम नहीं दिखाया गया; वह है, कम इनपुट और सामान्य-इनपुट लाइब्रेरी प्रति-तटस्थ (शीर्ष) हैं कई गलत-सकारात्मक खंडीय प्रति संख्या में परिवर्तनों को तब बुलाया गया जब इंट्रेटामोरल टी-सेल डीएनए से 1 एनजी कम इनपुट लाइब्रेरी का डेटा समान मामले (नीचे) से intratumoral टी-सेल डीएनए से 100 एनजी सामान्य-इनपुट लाइब्रेरी से तुलना किया गया था। यह शोध मूलतः रक्त 7 में प्रकाशित हुआ था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: ट्यूमर कोशिकाओं (प्राथमिक एचआरएस और सेल लाइनों) के साथ आवर्ती प्रति संख्या में लाभ और हानि, प्राथमिक कैस से स्वस्थ इंट्रार्मोर टी कोशिकाओं के मुकाबले तुलना की गईतों। यदि टी कोशिकाओं को बी सेल-व्युत्पन्न एचआरएस और सेल लाइन आबादी के खिलाफ दैहिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, तो पुनरावर्ती लाभ टी-सेल रिसेप्टर्स अल्फा / डेल्टा और बीटा में देखा जा सकता है। इसी तरह, आवर्ती हानियों को इम्युनोग्लोबुलिन भारी और कपा चेन में पहचाना जाता है। यह शोध मूलतः रक्त 7 में प्रकाशित हुआ था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

डीएनए इनपुट द्रव्यमान (एन) 1-10 एनजी 25 एनजी 100 एनजी
एडाप्टर: दाल अनुपात डालें (आर) 65: 1 25: 1 15: 1

तालिका 1: डीएनए मेंजन और अनुक्रमित एडाप्टर डालें: मोलार अनुपात डालें पुस्तकालय निर्माण के एडेप्टर बंधन चरण के दौरान जोड़ने के लिए एडेप्टर ओलोगो की मात्रा की गणना करने के लिए इस तालिका में मानों का उपयोग मार्गदर्शिका के रूप में किया जा सकता है।

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Discussion

इस तकनीक को माहिर होने के बाद भविष्य के अनुप्रयोग या निर्देश

यह काम डीएनए के कम से कम 10 एनजी युक्त नमूनों से एक्सोह अनुक्रमण के लिए अनुमति देता है। नैदानिक ​​संदर्भ में, इस सीमा में अपर्याप्त सामग्री के कारण सबसे सुन्दर-सुई आकांक्षा के नमूने शामिल नहीं होते हैं, लेकिन इसमें पर्याप्त कोर बायोप्सी और एक्स्प्शनल बायोप्सी नमूने शामिल हैं। इससे संभावित नमूनों के एक बड़े सेट से डेटा के अधिग्रहण को सक्षम होगा।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

उचित ठंड और पृथक्करण तकनीक प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। पूरे नमूना अलग होना चाहिए, जिसमें फाइब्रोटिक अनुभाग शामिल हैं, जितना संभव हो सके। सेल प्रकार के लिए 130 माइक्रोन नोजल का उपयोग बड़ी एचआरएस कोशिकाओं और डीएनए की उपज को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि कई नोजल आकारों के साथ कठोर नियंत्रित प्रयोग नहीं किए गए थे, महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थीसेल की पैदावार में 100-माइक्रोन की तुलना में बड़ी नोजल का उपयोग किया गया था, और 85-माइक्रोन नोजल सॉर्ट (अप्रकाशित अवलोकन) के बाद स्लाइड पर वस्तुतः कोई कोशिका नहीं मिली थी।

संशोधन और समस्या निवारण

लाइब्रेरी निर्माण के लिए इनपुट डीएनए के कम से कम 100 एनजी जनता के साथ काम करते समय, सभी अनावश्यक प्रसंस्करण और सफाई कदमों को कम करने के लिए ध्यान देना चाहिए, खासकर पीसीआर प्रवर्धन से पहले, चूंकि प्रत्येक खोए हुए अनूठे अणु परिणाम अंतिम पुस्तकालय की जटिलता में कमी । प्रोटोकॉल जानबूझकर 50 μL में एक्स्ट्यूटिंग अर्क की सिफारिश करता है क्योंकि यह मूल्य अनुशंसित उपकरणों के उपयोग के साथ ही दोण और अंत-मरम्मत के साथ संगत है। इस तरह, अंतराल की मरम्मत के चरण के लिए सोनिक चरण के लिए एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण या एक स्तंभ का उपयोग करके या कम मात्रा में मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक नहीं है। इस प्रोटोकॉल में अतिरिक्त संशोधन संभव है; उदाहरण के लिए, नई लाइब्रेरी निर्माण किट एडाप्टर लयोग दक्षता में सुधार कर सकती हैं। एक ही मात्रा और इनपुट डीएनए की गुणवत्ता से अलग किट के साथ बनाई गई पुस्तकालयों पर वास्तविक समय प्रवर्धन का उपयोग करके एडेप्टर-मध्यस्थता पुस्तकालय एम्पलीकरण घटता की तुलना करके समस्या निवारण / अनुकूलन कर सकता है।

तकनीक की सीमाएं

कम से कम 10 एनजी शुद्ध एचआरएस डीएनए (सॉर्टिंग और निष्कर्षण कदमों में होने वाले नुकसान के बाद लगभग 1,000 सॉर्ट किए गए कोशिकाओं) उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों के लिए न्यूनतम राशि प्रतीत होती है। पायलट प्रयोगों में, शुद्ध टी कोशिकाओं के एक नमूने से डीएनए पहले इनपुट समूहों में फैले पुस्तकालयों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इनपुट डीएनए की 100 एनजी (मानक अनुशंसित मात्रा) 10 एनजी और 1 एनजी इनपुट डीएनए के लिए इस कम इनपुट प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न पुस्तकालयों के साथ तुलना की गई थी। 10 एनजी इनपुट डीएनए से उत्पन्न लाइब्रेरी 100-एनजी इनपुट लाइब्रेरी से परिमाण और वितरण के कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थालक्ष्य भर में कवरेज, या पीसीआर दोहराव अंश में हालांकि, 1 एनजी इनपुट डीएनए का उपयोग करने वाली लाइब्रेरी एक महत्वपूर्ण रूप से उच्चतर पीसीआर डुप्लिकेट अंश और एक समान कमी (लगभग 3 गुना) लक्ष्य में पूरे कवरेज में हुई थी। इसके अलावा, 1 एनजी लाइब्रेरी ने कवरेज में एकरूपता से विचलन का प्रदर्शन किया, जिसने 10 एनजी इनपुट लाइब्रेरी के विपरीत 100 एनजी लाइब्रेरी के संबंध में गलत-सकारात्मक प्रतिलिपि संख्या में बदलाव किया, जो समान मूल्यांकन में प्रति-तटस्थ था। इस कारण से, इस पद्धति का उपयोग करते हुए 10 डीएनए से कम इनपुट डीएनए का इस्तेमाल करते हुए सावधानी बरतें।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व

प्रोटोकॉल के बाद प्राथमिक Hodgkin लिंफोमा नमूनों से एचआरएस कोशिकाओं के पूर्ण exome अनुक्रमण की अनुमति देगा। सीएलएल लिम्फ नोड के नमूनों में कम से कम 2 x 10 7 कोशिकाएं इस प्रक्रिया के लिए उपयुक्त हैं। यह पहले अनुसंधान के लिए उपलब्ध नहीं थाएनर्स, जो कि लेजर कैप्चर माइक्रोडायसेक्शन और पूरे जीनोम प्रवर्धन जैसी तकनीकों पर निर्भर थे। यह भविष्यवाणी की जाती है कि प्राथमिक सीएचएल मामलों के जीनोमिक दृष्टिकोण आगे समझने के लिए सीएलएल रोगजनन के लिए मूल्यवान बने रहेंगे। डेटा इस बीमारी इकाई के भीतर महत्वपूर्ण जीनोम-स्तर की विविधता को भी बताता है, संभावित रूप से कम से कम दो परिभाषित सबसेट्स जो नोडलल स्केलेरोसिस और मिश्रित सेल्युलैरिटी सीएचएल के बीच रूपात्मक स्तरीकरण का पालन करते हैं। अंत में, यह माना जाता है कि जीनोम-स्तरीय डेटा मुश्किल से इलाज के लिए लक्षित चिकित्सा के विकास के लिए प्रेरित करेगा / रिहेल्टेड / रेफ्रेक्ट्री सीएलएल मामलों

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रोजेक्ट मेथड का विकास, वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज के पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम आंशिक वित्त पोषण के लिए कम्प्यूटेशनल जीवविज्ञान और चिकित्सा में त्रि-संस्थागत प्रशिक्षण कार्यक्रम को स्वीकार करते हैं। हम उन वैज्ञानिकों का धन्यवाद करना चाहते हैं जिन्होंने हमारे साथ अपना समय और ज्ञान साझा किया, विशेषकर मेरीके अप्सेल; दान बर्गेस; Iwanka Kozarewa; चाड लोक्लायर; और जेन झांग, ज़ियाओबो (शॉन) लिआंग, दांग झू, वी झांग, हुइमिन शांग, तातियाना बैटसन और तुओ झांग सहित वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज जीनोमिक्स कोर सुविधा से हर कोई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

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References

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आनुवांशिकी अंक 124 शास्त्रीय हॉजकीन ​​लिम्फोमा सीएचएल रीड-स्टर्नबर्ग एफएसीएस एक्मो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण लाइब्रेरी प्रवाह सेल-सॉर्टिंग
शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग
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