Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

Summary

Her beskriver vi en kombinert flyt-cytometrisk celle sortering og lavinngang, neste generasjons bibliotekskonstruksjonsprotokoll utviklet for å produsere høykvalitets, hel-eksome data fra Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) celler av klassisk Hodgkin lymfom (CHL).

Abstract

Hodgkin Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom er sparsomt fordelt innenfor en bakgrunn av inflammatoriske lymfocytter og omfatter typisk mindre enn 1% av tumormassen. Materiale som er avledet fra bulktumor inneholder tumorinnhold ved en konsentrasjon som er utilstrekkelig for karakterisering. Derfor beskrives fluorescensaktivert cellesortering ved bruk av åtte antistoffer, så vel som side- og fremover-scatter, som en fremgangsmåte for hurtig separering og konsentrering med høy renhet tusenvis av HRS-celler fra svulsten for etterfølgende studie. På samme tid, fordi standardprotokoller for exome-sekvensering vanligvis krever 100-1000 ng av input-DNA, som ofte er for høyt, selv med flyt sortering, gir vi også en optimalisert, lavinnspilt bibliotekskonstruksjonsprotokoll som er i stand til å produsere høy kvalitet Data fra så lite som 10 ng av inngangsd DNA. Denne kombinasjonen er i stand til å produsere neste generasjons biblioteker egnet for hybridiseringsopptak av hel-eXome agn eller mer fokuserte målrettede paneler, som ønsket. Exome sekvensering av HRS-cellene, sammenlignet med sunne intratumor T- eller B-celler, kan identifisere somatiske endringer, inkludert mutasjoner, innføringer og slettelser, og kopieringstallendringer. Disse funnene belyser molekylærbiologien til HRS-celler og kan avsløre veier for målrettede legemiddelbehandlinger.

Introduction

Fremskritt i kreft genomikk som følge av neste generasjons sekvensering har ført til betydelige gjennombrudd i identifisering av terapeutiske mål og i prognostisering for mange hematologiske og ikke-hematologiske neoplasmer. Nye individuelle behandlingsstrategier basert på spesifikke genomiske endringer blir raskt introdusert i mange svulstetyper (gjennomgått i referanser ^{1 , 2} ). Til tross for signifikant fremgang i lymfom genomikk, hadde genomet av de neoplastiske HRS-cellene i klassisk Hodgkin lymfom (CHL) blitt undersøkt. Undersøkelsene har blitt bremset av mangel på neoplastiske HRS-celler i et reaktivt mikromiljø, noe som gjør det vanskelig å isolere rensede HRS-cellepopulasjoner ³ .

Metoden for isolering av levedyktige HRS-celler fra primære svulster ble utviklet av Fromm et al. ^{4 ,}Ref "> 5 ^{, 6.} Metoden bruker en åtte-antistoff-cocktail, bestående av CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 og CD64 for å utvetydig identifisere HRS-celler fra en CHL-svulstsuspensjon. Er i stand til å isolere minst 1000 levedyktige HRS-celler fra friske eller frosne cellesuspensjoner fra tumorbiopsier som består av minst 10 ⁷ celler (ca. 10 mg vev). Renheten er større enn 90% ved strømningscytometrisk analyse og anslås å være Minst 80% ved eksome genomisk analyse av ti sammenhengende tilfeller.

Vi har raffinert en strømningscytometrisk celleisolasjonsteknikk som i stor grad har lettet prosessen, noe som muliggjør rask isolasjon av tusenvis av levedyktige HRS-celler fra primære CHL-svulster ⁷ . Vi har benyttet teknikken til å produsere det som antas å være den første hel-eksome-sekvensen av tumorcellene i primære tilfeller av Hodgkin lymfom. Våre studier demonstrerer thE gjennomførbarhet av høy gjennomstrømming, genomgående studier av individuelle CHL-tilfeller og har allerede ført til identifisering av nye genomiske endringer med potensial til å forklare aspekter ved CHL-patogenese.

Vi videreutviklet en rørledning for å utnytte det ekstraherte DNA for høye gjennomstrømning genomiske studier. For å oppnå pålitelige resultater fra så få som 1000 sorterte HRS-celler (det minste oppnådd fra sekvensielle tilfeller) videreutviklet vi en modifisert neste generasjons DNA-bibliotekskonstruksjonsprosedyre ⁸ som tillot oss å øke adapterligasjonsvirkningsgraden og å generere DNA-fragmentbiblioteker Uten overdreven amplifisering. Denne metoden tillater analyse av rutinemessige kliniske prøver og påvisning av gjentatte mutasjoner og kromosomale endringer ⁷ .

Protocol

1. Vevbehandling og frysing

1. Samle lymfeknudevev i fosfatbufret saltvann (PBS) eller Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) og behandle innen 24 h samling. Overfør utskåret lymfeknudevev ⁹ til en petriskål som inneholder 10 ml RPMI med 2% føtalt kalveserum (FCS) og finhakket det med en fersk skalpelsblad. Bruk baksiden av en 10 ml sprøytekolv for ytterligere å male / dissociere vevet.
2. Overfør væsken til et 50 ml konisk rør gjennom en 100 μm cellefilter. Skyll petriskålen og filteret med ytterligere 10 ml RPMI 2% FCS.
3. Få en celle telling med enten en automatisert celle teller eller et hemocytometer.
   MERK: Generelt forventes minst 2 x 107 celler fra ca. 5 mm ³ CHL lymfeknudevev. En levedyktighet på over 80% forventes, men det kan variere etter prøve.
4. Spinn ned cellene ved 400 xg i 10 minutter og aspiraTe supernatanten. Plasser røret som inneholder cellepellet på is.
5. Pre-chill frysemiddel på is. Resuspender cellene i kaldt frysemedium ved en konsentrasjon på 2 x 107 / ml og resuspender den ved pipettering. Ikke vortex. Inkuber suspensjonen på is i 10 minutter.
6. Aliquot prøven 1 mL / cryo hetteglass (forkjølt på is). Overfør hetteglassene til en -80 ° C fryser i 1-2 dager og overfør dem igjen til flytende nitrogen.

2. Forbereder cellesuspensjoner for cellesortering

MERK: Hver masse antistoff må riktig titeres ved bruk av 10 millioner celler i et 300 μg fargevolum. Perifert blod kan brukes til alle antistoffer bortsett fra CD30, for hvilke KMH2 cellelinjen spikret i perifert blod kan brukes til titrering ¹⁰ . Vi starter vanligvis med produsentens anbefalte volum av antistoff og utfører to tofoldige fortynninger og en tofoldig økning (fire datapunkter)For hver masse antistofftitrering. For eksempel, hvis produsenten anbefaler et 10 μl volum, utfører vi titrering med 2, 5, 10 og 20 μl volumer.

1. Sett et vannbad til 37 ° C. Forbland den titerte mengden antistoffer i et mørkt glassflaske og tilsett PBS + 2% BSA for et totalt cocktailvolum på 100 ul.
   MERK: Selv om vi anbefaler å titere antistoffene, kan følgende volumer brukes som utgangspunkt: CD64, 20 μL; CD95, 5 ul; CD30, 20 μl; CD5, 10 ul; CD20, 10 ul; CD15, 20 μl; CD40, 5 ul; Og CD45, 10 ul.
2. Overfør hetteglasset fra flytende nitrogen i en isbøtte som inneholder tøris for å forhindre tining. Forvarm 50 ml opptining medium inneholdende RPMI / 20% FCS / DNase (100 μg / ml) i et 50 ml konisk rør i et 37 ° C vannbad.
3. Overfør 45 ml opptining medium til et friskt rør og hold det ved 37 ° C. Tørk opp cellene raskt ved å holde et kryogent hetteglass i en 37 ° C vannfløyteH til bare en veldig liten frossen del gjenstår.
4. Hell injektionsflasken innholdet i røret som inneholder 45 ml opptining medium. Skyll det tomme kryogene hetteglasset 2 ganger med 1 ml opptining og bland skyllene.
5. Inkubér cellene ved romtemperatur i 15 minutter for å tillate DNase-fordøyelse og celleutjevning. Spinn ned cellene ved 500 xg i 10 minutter og aspirer supernatanten.
6. Resuspender cellene i ca 200 μL av opptining medium holdt tilbake (5 ml) og la det likevekt til romtemperatur i 2-3 minutter. Utvinning av> 70% frosne levedyktige celler forventes.
   MERK: For en større renhet av sorterte HRS-celler som kan bli rosettet av vedlagte T-celler, kan en cocktail av umerkede antistoffer bli tilsatt ved dette trinnet (se den valgfrie protokollen).
7. Tilsett 100 μl av en antistoff-cocktail og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur (RT), beskyttet mot lys. Tilsett 3 ml sorteringsmedium, spinn ned cellene ved 500 xgI 10 minutter, og aspirere supernatanten.
8. Resuspender cellene i 1 ml sorteringsmedium og overfør dem til en 5 ml strømningsrør topp sil.
9. Skyll både 50 ml konisk rør og cellefilter med ytterligere 1 ml sorteringsmedium og plasser celler på is.

3. (Valgfri protokol) T-celleblokkering

MERK: HRS-celler er rosettet av T-celler i vevseksjoner og cellesuspensjon, og disse T-cellene kan potensielt forurense den sorterte HRS-fraksjonen. Disse interaksjonene medieres av CD54 og CD58 på HRS-cellen som er bindende til LFA-1 og CD2 på T-cellene ^{4 , 11} . Disse interaksjonene kan blokkeres med umerkede antistoffer mot disse adhesjonsmolekylene.

1. Aliquot 100.000 til 500.000 celler i 100 μl RPMI.
2. Inkuber cellesuspensjonen med umerkede antistoffer mot CD2, CD54, CD58 og LFA-1 (10 μl hver) på is i 1 time. TCellesuspensjonen kan nå merkes med fluorescerende antistoffer.

4. HRS-, B- og T-celleisolasjon ved hjelp av cellesortering

MERK: Selv om vi brukte et spesielt forskningsordningsinstrument ved hjelp av 5 lasere (se Materiale regneark), bør alle sorter med evnen til å detektere fluorokromene som brukes i antistoffpanelet, være tilstrekkelig. Utførelsen av trinnene nedenfor krever en kjennskap til programvare ^12- funksjon og grunnleggende kunnskap om cellesorteringsoperasjoner. Vennligst se den elektroniske programvarehåndboken for detaljerte instruksjoner.

1. Cytometer oppsett:
   1. Slå på datamaskinen og logg inn. Slå på BSC (og BSC uttak), og slå deretter på cytometeret. Vent minst 90 s for den interne CPUen til cytometeret for å starte, og åpne deretter laserkontrollprogramvaren og kontroller at alle lasere er slått på. Start cytometerprogramvaren ¹³ og logg inn.
   2. Innenfor cytometerprogramvaren klikker du på "Cytometer → View Configurations." Når dialogboksen for konfigurasjonsunderprogrammet åpnes, markerer du 130-μm tilpasset konfigurasjon og klikker på "sett konfigurasjon" og "OK". Avslutt konfigurasjonsunderprogrammet.
   3. Følg dialogboksen i cytometerprogramvaren og klikk "bruk CS & T-innstillinger." Sett inn en 130 μm dyse i instrumentet og slå på strømmen ved å klikke på den røde "X" -knappen i strømvinduet. La instrumentet varme opp i minst 30 minutter.
   4. Kjør en ytelseskontroll på instrumentet ved hjelp av den ønskede metoden (en programvaremodul for ytelsessporing følger med sortereren beskrevet her, se programvarehåndboken (s. 117-122) og referansestandard (se Materialene for standarden som brukes i Dette oppsettet).
      1. Klikk på "Cytometer → CST," pass på at "Karakteriser" -feltet er satt til "ChecK-ytelse "på rullegardinmenyen, og klikk" Kjør ". Når du blir bedt om av programvare, legger du et rør av referansepartikler på prøvefasen og klikker" OK ".
      2. Etter at fullføringen er fullført, klikk "Fullfør" og lukk programvaremodulen. Etter at cytometerprogramvaren er ferdig koblet til cytometeret, klikker du på "bruk CS & T-innstillinger" i dialogboksen som vises.
   5. Bestem den riktige slippforsinkelsen ved hjelp av den automatiske slippforsinkingsfunksjonen til cytometerprogramvaren (se s. 154 - 161 i programvarehåndboken).
      1. Åpne eksperimentet "Drop Delay" i vinduet "Browser" i cytometerprogramvaren, installer et rør av kalibreringspartikler på prøvefasen, og klikk "Load" i vinduet "Acquisition Dashboard". Slå på automatisk overvåkingsfunksjon ved å klikke på "Sweet Spot" -knappen i "Stream" -vinduet. La denne funksjonen være på alle tider for alle påfølgendeG trinn.
      2. Slå av spenningsplatens spenning ved å klikke på "Spenning" -knappen i sidestrømvinduet, og slå deretter på testsortering ved å klikke på "Test Sorter" -knappen rett ved siden av "Spenning" -knappen.
      3. Juster alle sidestrøm innstillinger til null unntatt for venstre side strøm. Juster innstillingen for venstre side strøm slik at to strømspots er synlige i sidestrømvinduet. Klikk på "Optisk filter" -knappen og kontroller at venstre sidestrømspunkt faller innenfor den venstre boksen som vises i det svarte området i sidestrømvinduet.
      4. Juster innstillingen for venstre sidestrøm om nødvendig. Slå av testsortering ved å klikke på "Test Sorter" -knappen igjen. I "Browser" -vinduet utvider du "Global Worksheets" -elementet i "Drop Delay" -eksperimentet ved å klikke på "+".
      5. Dobbeltklikk på "Sorter Layout_001" for å åpne sorteringsoppsettet, bekreft ved visuell inspeksjonIon at den venstre sorteringspopulasjonen har "P1" tildelt den, og klikk "Sorter" i "Sorter layout" -vinduet. I vinduet "Sorter layout" klikker du på "Auto Delay" og deretter "Run."
      6. Når løpet er fullført, klikk "Avslutt". Monter et rør av sterilt deionisert vann på prøvefasen og klikk på "Load" i vinduet "Acquisition Dashboard". Kjør røret med vann i minst 5 minutter for å fjerne resterende testpartikler fra instrumentet før du fortsetter.
   6. Kjør kompensasjons kontroller (bruk kompensasjonsperler fra materialet regneark eller tilsvarende) ved hjelp av et innebygd kompensasjonsoppsett i sorteringsprogramvaren (se s. 131 - 137 i programvarehåndboken for ytterligere detaljer).
      1. Opprett et nytt eksperiment ved å klikke på "Eksperiment nytt eksperiment". I "Parametere" -fanen i "Instrumentstatus" -vinduet må du slette ubrukte parametre, hvis noen. Klikk på "Eksperimentkompensasjon"Ion Setup Opprett kompensasjonskontroller. "
      2. I vinduet "Nettleser", utvider du "Kompensasjonskontroll" -prøven ved å klikke på "+" -tegnet. Kjør kompensasjons kontrollrør uten å registrere dataene, og juster om nødvendig detektorspenningene (i "Parametre" -fanen i "Instrumentstatus" -vinduet) slik at positivt fargede perlepopulasjoner for hver fluorokrom er mellom kanal 10.000 og 100.000 og er Den lyseste i sin primære deteksjonskanal.
      3. Skriv ned spenningene som trengs for hver parameter for hvert rør. Marker "Unstained Control" -røret under "Compensation Controls" -prøven ved å enkelt klikke på den. Legg det ufarvede kontrollrøret på prøvefasen og klikk på "Load" i vinduet "Acquisition Control".
      4. Skriv inn de bestemte spenningene manuelt ved å kjøre individuelle kompensasjonskontroller i detektorspenningsfeltene for alle parametere, ogKlikk deretter "Record" i vinduet "Acquisition Control". Kjør alle gjenværende kompensasjonskontroller, registrer dataene uten å endre noen detektorinnstillinger. Installer et rør sterilt deionisert vann i 5 minutter for å fjerne alt gjenværende materiale fra instrumentet før du fortsetter.
2. HRS-celle gating:
   1. Oppkjøp og registrer minst 100 000 hendelser for første gating mens du justerer strømningshastigheten for å skaffe 3000-4000 hendelser / s (se trinn 4.1).
      MERK: Det kan være nødvendig å legge til ekstra sorteringsmedium for å fortynne cellene hvis cellekonsentrasjonen er for høy. Stopp oppkjøpet.
   2. Gate HRS-celler ved hjelp av trinnene som er skissert i figur 1
      MERK: I de fleste CHL-tilfeller vil mellom 0,01% og 0,1% av cellene være HRS-celler.
3. B- og T-celle gating:
   1. Identifiser somatiske kontroller (B og T-celler) ved gating av CD20 og CD5 respCtively (gating lymfocytter av CD45 / SSH), etterfulgt av CD20 versus CD5 (se figur 1 ).
   2. Målinnsamling streamer til oppsamlingsrør i en forkjølt toveis eller fireveis innsamlingshylle. Fyll enten strømningsrør eller 15 ml centrifuge-stilrør minst halvveis med oppsamlingsmedium.
   3. Tilordne HRS og kontrollpopulasjoner til riktig oppsamlingsrør i sorteringsoppsettet som følger leverandørinstruksjonene. Start cellenoppkjøpet på nytt og start sorteringen.
   4. Samle alle HRS-celler og opptil 1 million B- og T-celler. Mål kollektive strømmer til oppsamlingsrør i en forhånds-kjølt fireveis (eller toveis) samlingshylle.

5. DNA-ekstraksjon

1. Pellet samlet celler ved sentrifugering i 1,5 ml koniske rør ved 3000 xg i 10 minutter og resuspenderes en gang med 1 ml PBS for å vaske cellene.
2. Pelleten en gang til ved 3000 xg i 10 minutter og fjern supernatanten; Vær veldig forsiktig så du ikke forstyrrerDen lille pellet.
3. Tilsett 150 μl lysisbuffer (eller et passende volum for settet som brukes) til de vasket cellene og bland ved pipettering opp og ned.
   MERK: Man kan lagre cellelysat ved -70 ° C på dette tidspunktet, om nødvendig.
4. Konstruer en kolonnekonstruksjon ved å plassere filterkolonnen inne i røret og tilsett lysatet fra trinn 5.5 til kolonnen. Spinn forsamlingen ved 13 000 xg i 3 min.
5. Fjern minikolonnen fra aggregatet og kast væsken i oppsamlingsrøret. Bytt minikolonne i oppsamlingsrøret.
6. Tilsett 650 μL kolonne vaskeoppløsning til hver enhet. Sentrifuger i 1 min ved 13.000 x g. Kast væsken fra oppsamlingsrøret. Gjenta dette trinnet for totalt 4 vasker.
7. Kast væsken fra oppsamlingsrøret og sett sammen minikolonneenheten. Sentrifuger i 2 minutter ved 13.000 xg for å tørke bindingsmatrisen.
8. Overfør minikolonnen til et nytt 1,5 ml rør og tilsett 25 μl 10 mM Tris-Cl, somEr foretrukket for påfølgende sonikeringstrinn, eller Nuclease-Free Water oppvarmet til 65 ° C. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur og sentrifuger enheten ved 13 000 xg i 1 min. Gjenta igjen med 25 μL for totalt 50 μL.
9. Bland DNA-elueringen ved pipettering opp og ned og kvantifiser ved bruk av fluorimetri ¹⁴ .

6. Bibliotekskonstruksjon

1. Forberedelse før du begynner:
   1. Sett opp sonikatoren ved vannnivå 12, Intensitet 5, Cycles / burst 200 og Temp 7.
   2. Basert på den tilgjengelige DNA-kvantiteten bestemt ved fluorimetri og på eksperimentell design, bestemmer mengden av DNA som skal brukes til bibliotekskonstruksjon.
      MERK: Husk at hvis det brukes for lite DNA og bibliotekskvaliteten er kompromittert, kan det være liten søknad om materiale som er etterlatt for valideringsformål. For substandard input mengder, jo større inngangsmassen, jo høyere kompLeksitet av det resulterende sekvenseringsbiblioteket. Noen retningslinjer for denne protokollen er som følger: 10 ng skal gi gode resultater, og 50 ng kan betraktes som et grovt maksimum.
   3. Bestem på adapteren: Sett inn molforholdet løst på verdiene i Tabell 1 .
   4. Beregn mengden adapter som skal brukes på følgende måte:
      MERK: Antall mol DNA-inngang, n
      Jeg. N = 1,54e-12 ^-12 * inngangsmasse (i ng) / (gjennomsnittlig fragmentstørrelse)
      ii. Når den gjennomsnittlige fragmentstørrelsen er 200 bp, forenkles dette til:
      N = 7,7e-15 * inngangsmasse (i ng)
      Antall mol adapter for å inkludere, a
      Jeg. A = n * r
      Volum av adapter lager for bruk i adapter ligation trinn, v
      Jeg. V (i μL ) = a / [ 10 ^-12 * adapter lagerKonsentrasjon (i μM )]
      MERK: Hvis adapterkonsentrasjonen er lav, for å sikre at den nødvendige mengden adapter er inkludert, kan adapterløsningen brukes til å fortynne sluttreparasjonsreagensene i stedet for vann.
      Eksempel: For 100 ng inngangsd DNA med en gjennomsnittlig fragmentstørrelse på 200 bp, for en ønsket molaradapter: Sett inn forholdet 15: 1 og en adapterkonsentrasjon på 2 μM, er det anbefalte volumet av adapter som skal brukes 5,8 μL.
   5. Tildel indekserte strekkoder til prøvene.
      MERK: Biblioteker som vil bli samlet i en hybridiseringsreaksjon eller en bane på en sequencer-strømningscelle, må ikke inneholde noen redundante indekser.
2. Bibliotekskonstruksjon - DNA-skjæring:
   1. Legg til hele mengden DNA som skal brukes til et sonikeringsrør. Hvis volumet av prøven som inneholder input-DNA alene er mindre enn 50 μl, legger du Buffer EB opp til et 50 μl totalt volum og blander.
   2. Sonicate for 30 s.
   3. Fjern røret og utfør en hurtig-spinn i en mini-sentrifuge akkurat nok til å samle noen spray fra den øvre delen av veggene på mikrotubeen.
   4. Gjenta trinn 6.2.2-6.2.3 for totalt syv 30 s sonikasjon økter for totalt 210 s av sonication.
      MERK : Prøv å eksperimentere med å dele 210 s til færre økter.
3. Bibliotekskonstruksjon - Sluttreparasjon, A-tailing og adapterligasjon:
   MERK: Unngå å gjøre noen størrelsesvalg før bibliotekets PCR-forsterkningstrinn.
   1. Følg produsentens instruksjoner ¹⁹ for sluttreparasjon og A-tailing etter sonikering av prøven DNA.
   2. Etter A-tailing, bruk riktig antall mol adapter (beregnet i trinn 6.1.3) i reaksjonen. Kombiner adapteren, A-tailed DNA-fragmenter, enzym og buffer og inkuber natten over ved 20 ° C i ca. 16 timer.
4. libRary konstruksjon - Bibliotek forsterkning:
   1. Utfør en perleopprydding av adapterligasjonsreaksjonen. Etter å ha tilsatt perler til PCR-produktet, vent 5 min ved romtemperatur. Plasser den mot et magnetisk stativ og fjern væskene, vask det to ganger i 200 μl 80% etanol, tørk perlene lenge nok til å fjerne det meste av væsken uten å tørke over og eluere DNA'et av perlene ved å pipettere 25 μl av Nukleasefritt vann, som foreslått, på perlene mens røret forblir mot et magnetisk stativ.
      MERK: Det kan være mulig å eksperimentere med bevaring av perlene i polyetylenglykol
      (PEG) til etter amplifikasjonen i stedet for å kaste dem, men dette har ikke blitt testet.
   2. Inkluder 0,6 μl av en 1: 1 000 fortynning av grønt fargestoff per 50 μl PCR-masterblanding. Alternativt, bruk et sanntids-PCR-kompatibelt intercolating-fargestoff i valg i riktig volum for utstyret.
   3. Program PCR-reaksjonen ved 98 ° C for45 s for den første denatureringen etterfulgt av en syklus av denaturering, annealing og forlengelse ved 98 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, eller velg det passende programmet dersom det anvendes et alternativ Polymerase enzym.
      1. Sett maskinen til å ta fluorescensdata ved 72 ° C for hver syklus. Program en endelig forlengelse ved 72 ° C i 1 min etterfulgt av et hold ved 4 ° C i ubestemt tid. PCR-primere for amplifisering av det adapter-ligerte bibliotek ved bruk av reagenser i tilleggstabellen er: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA og Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Forsterk biblioteket ved hjelp av PCR-betingelsene beskrevet ovenfor, mens du observerer fluorescensintensitetsverdiene i sanntid med qPCR-programvaren, stopper like før slutten av eksponentiell vekstfase.
   5. Etter amplifikasjon, gjør en standard perleopprydding (se trinn 6.4.1) ved å bruke 0,8x volumet av amplifikasjonsreaksjonsrekvensenKalt, vanligvis 0,8 x 50 = 40 μl perler. Legg perlene til PCR-produktet og vent 5 minutter ved romtemperatur.
   6. Plasser den mot et magnetisk stativ og fjern væsken, vask to ganger i 200 μl 80% etanol, tørk perlene lenge nok til å fjerne det meste av væsken uten å tørke over og eluere ved å tilsette nukleasefritt vann til tørrperlene.
   7. Kvantifiser det resulterende DNA ved bruk av fluorimetri. Visualiser bibliotekets fragmenter for størrelse; Se delen om Data QC-forventninger for flere detaljer.

7. Exome Hybridization

1. Kombiner fire biblioteker med tydelige adapter strekkoder.
   MERK: Masse ved fluorimetri og størrelse med gel brukes til å beregne molariteten, og deretter kombineres biblioteker i ekvimolære mengder for totalt 1 000 ng masse poolet bibliotek. Det er best å holde alle tumor-normale par sammen i stedet for å skille dem i separate bassenger.
2. Bruk exome capture capture protokollen Opp klasse = "xref"> 15 og gjør 8 PCR sykluser etter oppsamling opprydding. Andre valg av fangstmål kan være mulig.

8. Multiplexed sekvensering

1. Sequence en enkelt hybridisering fange inneholdende fire multiplexed biblioteker i en enkelt lane på sekvenseringsplattformen referert i materialet regneark ¹⁶ .
   MERK: Alternative konfigurasjoner er mulige for avanserte brukere som ønsker å planlegge og optimalisere måldisplayet.

9. Analyse (Kan erstattes med Alternativ rørledning (er) hvis ønskelig)

1. Snps og små indeler:
   1. Kart rå data til det humane referansegenomet, UCSC hg19, ved hjelp av Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ eller en alternativ algoritme. Filter eller markerer med en kartleggingskvalitetspoeng under 20 og PCR-duplikater ved hjelp av Samtools ¹⁸ eller PicardRef "> 19.
   2. Detektere somatiske nukleotidvarianter og små indeler i HRS-prøver sammenlignet med T-cellets somatiske kontroller ved bruk av Strelka ²⁰ eller en variantoppringer av valg. Påfør snpEff ^{21 for} å annotere Strelka-utgangen. Ønsker du systematisk å inspisere variantlokal for artefakter ved hjelp av Integrated Genome Viewer (IGV) ^{22 , 23} .
2. Kopier nummer endringer:
   1. Beregn det log-transformerte forholdet " ltr " for hvert exome målintervall " i " av intra-bibliotek normaliserte lese-teller i svulsten mot normalverdien på følgende måte:
      
      MERK: c er antallet leser kartlegging til et gitt fangstintervall, l er den totale bibliotekstørrelsen, t betegner svulst og n betegner normal.
   2. Filter ut intervaller med utilstrekkelig dekning ( C _t + C _n <100 leser) for videre analyse. Utfør pan-intervall segmentering ved hjelp av DNAcopy v.1.0 ²⁴ fra Bioconductor i R.
      MERK: Vurder segmenter der absoluttverdien av gjennomsnittlig ltr er under 0,5 for å være kopi-nøytral. Resterende segmenter kan betegnes som kopieringsgevinster, dersom tegnet på den gjennomsnittlige ltr er positivt (med andre ord, det er signifikant mer leser i svulsteksamplen enn i normalprøven etter normalisering) eller kopieringstalltap hvis tegnet Av den gjennomsnittlige ltr er negativ.

Representative Results

En bioanalyzer plot bør tas etter bibliotek forsterkning og 0,8x perle opprydding. Man bør se en "normalaktig" fordeling av fragmentstørrelser i det ønskede området ( figur 2a ). Avvik fra denne formen, som en synlig "skulder" i kurven, indikerer nærværet av en artefakt med høy eller lav molekylvekt. For eksempel viser figur 2b -2d eksempler på biblioteker som inneholder synlige artefakter som ideelt sett ikke skal sekvenseres. Hvis et bibliotek er betydelig kompromittert, kan det være verdt å gjenta bibliotekets konstruksjon dersom DNA er tilgjengelig og / eller celle sortering for å starte frisk.

En adapter dimer kan noen ganger overføre gjennom den første 0,8x perlen opprydding. Hvis dette skjer, vil det være synlig som en skarp topp sentrert rundt 125 - 130 bp (se FigurE 2c). I dette tilfellet anbefales det å gjenta en ekstra 0,8x perleopprydding og å gjenta bioanalysatoren for å sikre en vellykket fjerning av dimeren.

Ved bruk av spesifikasjonene beskrevet i denne protokollen og multiplexering av sekvenseringen på nivået av fire prøver pr. Bane i sekvensen som er oppført i materialet regneark, leses en middeldybde på 50-100x over målet (etter at bioinformatikk fjerning av PCR duplikat leser) Kan oppnås (se figur 3a ). I tillegg bør biblioteker som ikke er foramplisert, og som resulterte i biblioteker med tilstrekkelig dekning, produsere rene kopi nummerplott. Under tidlig arbeid ble denne byggeprotokollen for bibliotek testet over tre størrelsesordener av inngangsmasse, og variable resultater ble oppdaget (se avsnittet Diskusjon). Kopier antall tomter generert ved hjelp av et bibliotek generert fra 1 ng, en suboptimal mengde inngangsd DNA, Resulterte i falske kopi nummer gevinster og tap ( figur 3b , bunn).

Om lag 70% av tilfellene av CHL bærer B2M- og A20-mutasjoner og / eller deletjoner ⁷ . B2M-mutasjoner omfatter overveiende et translasjonelt startsted, et første exon-stoppested og et første exon-stoppested. A20 mutasjoner er en blanding av kopi nummer tap og indeler. Mutasjonene ser ut til å være klonale og kan brukes til å estimere relative tumorinnhold. Hvis T-celler brukes som somatiske kontroller, vil HRS-sekvensering vise signifikante kopieringsgevinster i stillingene som svarer til T-cellereceptor alfa / delta (14q11-12) og beta-stillinger (7q32-35), samt signifikante tap i B-celle reseptor tungkjede (14q32) og kappa lettkjedestillinger (2p11) (se figur 4 ). Samlet sekvensering viser et område fra 100 til 400 somatiske mutasjoner per tilfelle. Kopier nummervariasjon er høyt vArible fra tilfelle til sak, med enkelte tilfeller som viser mange segmentgevinster og tap og andre tilfeller som bare viser noen få endringer.

Figur 1: Multiparameter Gating for Flow-sortering av levedyktige HRS-, B- og T-celler. Befolkningsnavn er vist på tomter og angir overordnet befolkning i en gate. ( A ) viser alle celler: På FSC-H versus FSC-A-histogrammet tegner du en SINGLETS-gate som inneholder populasjoner med proporsjonal FSC-H og FSC-A-økninger. Ekskluder dubletter som har høy FSC-A og lavere FSC-H. Hodgkin-celler er svært store; Utvide porten for å inkludere høye FSC-H og FSC-A hendelser. ( B ) Utelat rusk, døde celler og ulysede RBC som normalt har lavere FSC-A og små økninger i SSC-H uten å kutte ut levedyktige populasjoner (VIABLE gate). ( C ) Gate MONONUCLEAR celler påFSC-A versus SSC-H for å utelukke granulocytter med høy SSC-H; Merk at porten kun brukes til å identifisere T- og B-celler. ( D ) Gate T CELLS positivt identifisert av CD5 (grønn) uten CD20 og B CELLS (blå), som har CD20-uttrykk uten CD5. ( E ) Tegn en større gate på CD45 / SSH-plottet, inkludert 10-20% av lymfoidceller og alle granulocytiske celler. ( F ) Gate CD30-positive hendelser med svak til negativ CD64 / FITC autofluorscence. ( G ) Blant CD30 positive hendelser, gate CD40- og CD95-positive hendelser (CD30 / 40/95 HRS gate, rød). ( HL ) Vær oppmerksom på de bekreftende immunofenotypiske egenskapene på HRS-celler; HRS-celler uttrykker vanligvis ikke CD20 (plott H og L). Ekspresjonen av CD5 er korrelert med CD45 på grunn av T-celle-rosetting (I); De fleste tilfeller vil vise uttrykk for CD15 og vil være lyse for CD71 ( J ). CD40- og CD95-uttrykk er generelt over nivået av B- og T-celler, resp Ektivt ( K ). Denne undersøkelsen ble opprinnelig publisert i Blood ⁷ . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Størrelsesfordelingsplott av prøver etter adapterligering og forsterkning. Ideelt sett bør biblioteker med synlige artefakter gjentas og ikke sekvenseres. ( A ) Velformet bibliotek; Ingen synlige gjenstander. ( B ) Asymmetri i kurven avslører et problem. (C) Signifikant adapter dimer (topp ved 128) og en artefakt med høy molekylvekt (> 400 bp). Dimeren kan rengjøres med en ekstra 0,8x perleopprydding. ( D ) Signifikant artefakt med høy molekylvekt.S / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Bioinformatic Kvalitetskontrollmålinger for biblioteker av høyere kvalitet laget av 10 ng Input DNA Sammenlignet med lavere kvalitet biblioteker laget av 1 ng Input DNA. Størrelsen og fordelingen av den unike lesedybden av dekning forventninger. ( A ) En middeldybde av dekning på minst 50 forventes ved bruk av 10-100 ng inngangsd DNA. ( B ) Hver av de to panelene avbilder kopieringsnummervariasjonsanalyseresultater som sammenligner data mellom 2 sekvenserte biblioteker. Exoniske sondesegmenter (x-akse) versus kopi-nummerendring på en log _2- skala (y-akse) er plottet for et enkelt representativt kromosom (chr 6). Sammenligning av data fra et 10 ng lavt inngangsbibliotek fra intratumoralT-celle DNA til et 100 ng normalt inngangsbibliotek fra intratumoral T-celle DNA fra samme sak viste ingen signifikante falske positive resultater; Det vil si, lavinngangs- og normalinngangsbiblioteker er kopi-nøytrale (øverste). Tallrike falske positive segmentaleksemplarendringer ble kalt når data fra et 1 ng lavt inngangsbibliotek fra intratumoralt T-celle DNA ble sammenlignet med et 100 ng normalt inngangsbibliotek fra intratumoralt T-celle DNA fra samme sak (bunn). Denne undersøkelsen ble opprinnelig publisert i Blood ⁷ . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Gjentatte kopiantal gevinster og tap, med tumorceller (primære HRS og cellelinjer) sammenlignet med sunne intratumor-T-celler fra primære cases. Hvis T-celler blir brukt som den somatiske kontrollen mot B-celleavledede HRS- og cellelinjepopulasjoner, kan det ses tilbakefallende T-cellereceptorer alpha / delta og beta. På samme måte er gjentakende tap detekterbare i immunoglobulin tung og kappa kjeder. Denne undersøkelsen ble opprinnelig publisert i Blood ⁷ . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-inngangsmasse (n)	1-10 ng	25 ng	100 ng
Adapter: Sett inn molforhold (r)	65: 1	25: 1	15: 1

Tabell 1: DNA InSett masse og korresponderende adapter: Sett inn molarforhold. Verdiene i denne tabellen kan brukes som en veiledning for å beregne mengden av adapteroligo som skal tilføyes under adapterligasjonstrinnet for bibliotekskonstruksjon.

Discussion

Fremtidige bruksområder eller retninger etter å ha behersket denne teknikken

Dette arbeidet tillater exome-sekvensering fra prøver som inneholder minst 10 ng DNA. I den kliniske sammenhengen utelukker denne grensen de fleste fine nål aspirasjonsprøver på grunn av utilstrekkelig materiale, men det inkluderer tilstrekkelige kjernebiopsier og ekskisjonsbiopsiprøver. Dette vil muliggjøre oppkjøp av data fra et større sett med mulige prøver.

Kritiske trinn i protokollen

Riktig frysing og dissosiasjonsteknikker er kritiske for eksperimentets suksess. Hele prøven skal dissosieres, inkludert fibrotiske seksjoner, så mye som mulig. Bruk av en 130 μm dyse for celletyper synes å være kritisk for å maksimere utbyttet av de store HRS-cellene og DNA. Mens strenge kontrollerte eksperimenter med flere dysestørrelser ikke ble utført, øker signifikantI celleutbytter ble observert ved bruk av den større dysen sammenlignet med 100 μm, og nesten ingen celler ble detektert på glidebrytningen 85 μm dyse sortering (upublisert observasjon).

Modifikasjoner og feilsøking

Ved arbeid med mindre enn 100 ng masser av inngangsd DNA for bibliotekskonstruksjon, bør det tas hensyn til å redusere alle unødvendige prosesserings- og oppryddingstrinn, spesielt før PCR-amplifikasjon, siden hvert tapte unikt molekyl resulterer i en reduksjon i kompleksiteten til det endelige biblioteket . Protokollen anbefaler med vilje eluerende ekstrakter i 50 μL fordi denne verdien er kompatibel med både sonikering og sluttreparasjon ved hjelp av det anbefalte utstyret. På denne måten er det ikke nødvendig å redusere elueringsvolumet ved hjelp av en sentrifugal-fordamper eller en kolonne for sonikeringstrinnet eller for å redusere sonikasjonsvolumet for sluttreparasjonstrinnet. Ytterligere endringer i denne protokollen er mulige; For eksempel kan nye bibliotekskonstruksjonssettene forbedre adaptereleringseffektiviteten. Man kunne feilsøke / optimalisere ved å sammenligne adaptermedierte biblioteksforsterkningskurver ved hjelp av sanntidsforsterkning på biblioteker laget med forskjellige sett fra samme mengde og kvalitet av inngangsd DNA.

Begrensninger av teknikken

Minst 10 ng renset HRS-DNA (ca. 1000 sorterte celler etter tap i sorterings- og utvinningstrinnene) synes å være den minimale mengden for høyverdige resultater. I pilotforsøk ble DNA fra en enkelt prøve av rensede T-celler først brukt til å lage biblioteker som spenner over en rekke inngangsmasser. 100 ng (standard anbefalt mengde) av inngangsd DNA ble sammenlignet med biblioteker generert ved hjelp av denne lavinngangsprotokollen for 10 ng og 1 ng inngangsd DNA. Biblioteket generert fra 10 ng av input-DNA hadde ingen signifikante forskjeller fra 100 ng-inngangsbiblioteket i størrelsesorden og distribusjon avDekning over målet, eller i PCR-dupliseringsfraksjon. Biblioteket generert ved bruk av 1 ng inngangsd DNA resulterte imidlertid i en signifikant høyere PCR-duplikatfraksjon og en tilsvarende reduksjon (omtrent 3 ganger) i gjennomsnittlig dekning over målet. Videre viste 1 ng biblioteket også avvik fra uniformitet i dekning, noe som skapte falsk positive kopi nummer endringer i forhold til 100 ng biblioteket, i motsetning til 10 ng inngangsbiblioteket, som var kopi-nøytral i samme vurdering. Utfør derfor forsiktighet ved å bruke mindre enn 10 ng inngangsd DNA ved hjelp av denne metoden.

Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder

Følgende protokoll vil tillate full eksome sekvensering av HRS celler fra primære Hodgkin lymfom prøver. CHL-lymfekodeprøver som inneholder minst 2 x 107 celler, er egnet for denne prosedyren. Dette var ikke tidligere tilgjengelig for forskningErs, som stolte på teknikker som laser fange mikrodisseksjon og hele genom forsterkning. Det er spådd at genomiske tilnærminger til primære CHL-tilfeller vil fortsette å være verdifulle for videre forståelse av CHL-patogenesen. Data peker også på signifikant genomisk heterogenitet innenfor denne sykdomsenheten, med potensielt minst to definerte delgrupper som løst følger morfologisk stratifisering mellom nodulær sklerose og CHL med blandet cellularitet. Endelig er det antatt at genomivådata vil føre til utvikling av målrettet terapi for vanskelige å behandle tilbaketrukket / ildfaste CHL-tilfeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA