Summary
Denne artikel beskriver en enkel og reproducerbar protokol til at manipulere opløst iltforholdene i et laboratorium indstilling for dyreadfærd studier. Denne protokol kan bruges i både undervisning og forskning laboratoriet indstillinger til evaluering organismal respons af smådyr, fisk eller padder på ændringer i koncentrationen af opløst ilt.
Abstract
Evnen til at manipulere opløst oxygen (DO) i laboratoriet har betydelig anvendelse for at undersøge en række økologiske og organismal adfærd spørgsmål. Den her beskrevne protokol giver en enkel, reproducerbar, og kontrolleret metode til at manipulere DO at studere adfærdsmæssige respons i akvatiske organismer hidrørende fra hypoxiske og iltfrie forhold. Under udførelsen af afgasning af vand med kvælstof er almindeligt anvendt i laboratoriet indstillinger, findes der ingen eksplicitte metode til økologisk (vand) anvendelse i litteraturen, og denne protokol er den første til at beskrive en protokol til degasify vand at observere organismal respons. Denne teknik og protokol blev udviklet til direkte ansøgning om vandlevende hvirvelløse dyr; dog små fisk, padder og andre akvatiske hvirveldyr let kunne erstattes. Det giver mulighed for nem manipulation af DO-niveauer i området fra 2 mg / l til 11 mg / l med stabilitet i op til 5 min dyr-observationsperiode.Beyond en 5 min observationsperiode begyndte vandtemperaturer at stige, og på 10 min DO niveauer blev for ustabil til at vedligeholde. Protokollen er skalerbar til studiet organisme, reproducerbar og pålidelig, giver mulighed for en hurtig gennemførelse i indledende undervisning laboratorier og højt niveau forskningsansøgninger. De forventede resultater af denne teknik bør relaterer opløst ilt ændringer adfærdsmæssige reaktioner af organismer.
Introduction
Opløst ilt (DO) er en vigtig fysisk-parameter vigtige i at mediere en række biologiske og økologiske processer i akvatiske økosystemer. Engagementer med akut og kronisk subletal hypoxi reducere vækstrater i visse vandinsekter og reducere overlevelsen af insekter udsat en. Denne protokol blev udviklet til at give en kontrolleret metode til at manipulere DO niveauer i stream vand at observere virkningerne på dyrs adfærd. Eftersom alle aerobe vandlevende organismer overlevelse afhænger af koncentrationen ilt for at leve og formere sig, indregnes ændringer i koncentrationen af DO afspejles ofte i adfærdsmæssige ændringer ved organismer. Flere mobile hvirvelløse vanddyr og fisk er observeret til at reagere på lave iltkoncentrationer (hypoxiske) ved at søge lokaliteter med højere DO 2,3. For mindre mobile vandlevende organismer, at adfærdsmæssige tilpasninger øge indtagelsen af DO kan være den eneste holdbare løsning. Den akvatiske makroinvertebrater rækkefølge Plecoptera (Stonefly) er blevet noteret for at udføre "Push-up" bevægelser for at øge strømmen af vand, og optagelsen af ilt, på tværs af deres eksterne gæller 4 - 6. Disse adaptive adfærd er blevet observeret i naturlige miljøer og i laboratorieforsøg.
Laboratorium manipulation af DO i vand åbner betydelige muligheder for dyrs adfærd studier, men store huller i metodiske implementering eksisterer. For eksempel er en undersøgelse brugte store akvarier til at evaluere den fysiologiske responstid på largemouth bas (Micropterus salmoides) til hypoxiske miljøer efter gasning med nitrogen, men ringe detalje er givet for den metode 7. En anden undersøgelse udført på zebrafisk (Danio rerio) beskrevet anvendelse af nitrogengas og en porøs sten til at levere gas til vand og reducere DO af vandet 8. For kemi-baserede applikationer, metoder til afgasning af opløsningsmidler udnytte specialiseredeApparatet 9 - 11 til fjerne oxygen fra opløsningsmidler, men ville ikke være egnet til dyrs adfærd studier. Mens disse undersøgelser anvender metoder til at fjerne oxygen fra vand, kunne der ikke beskrivende metode identificeres som ville give mulighed for evaluering af dyrenes adfærd som reaktion på DO ændringer.
Denne metode er beskrevet i det følgende er et forsøg på at fuldt beskrive en protokol for manipulation af DO af vand ved anvendelse af nitrogengas. Endvidere blev denne metode udviklet i retning af at observere relationer mellem Stonefly adfærd (pushups) og DO, der blev ansat i en freshman-niveau biologi laboratorium. En af de vigtigste fordele ved denne metode er, at det nemt kan udføres inden for et laboratorium med fælles glasvarer og materialer tilgængelige for de fleste sekundære og højere uddannelsesinstitutioner. Protokollen er også let at tilpasse, der giver mulighed for den enkelte at skalere procedure for at opfylde de mål, der er fastsat for forskning eller undervisning applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Dette eksperiment ikke bruge hvirveldyr og derfor ikke kræver godkendelse af Juniata akademiets Institute for Animal Care og brug Udvalg. Men for personer tilpasse denne metode til brug med hvirveldyr, bør søges IACUC godkendelse.
1. Field Prøvetagning
- Bestem og evaluere potentielle marken sites for evnen til at indsamle, lagre og transport slørvinger hurtigt for at minimere tid i transit med en anbefalet maksimal tid i transit af 1 time.
- Udfør kick-net prøveudtagning på det valgte felt webstedet følge standard kick-net procedurer nok gange til at indsamle mindst 35 slørvinger 12.
- Saml 50 L af strøm vand og sten med en maksimal diameter på 2 cm fra vandløb.
- Placer akvarier i køleskab indstillet til temperaturen af strømmen site. Fordel sten indsamlet på åen websted i akvarier og fyldes med 4 liter stream vand pr akvarium. Placer 20-30 Indsamlede slørvinger pr akvarium og placere en boblende sten fastgjort til et akvarium bobleflasken i hver tank, og tænd bubblers til løbende tilføje rumluft til vandet.
- Lad slørvinger at tilpasse sig det nye miljø i akvarier for en 48 timers periode.
Figur 1. Opsætning for opløst ilt manipulation. (A) 1) Montering af kobberrør til mandlige slange modhager 2) Placering af prop sæl at undersøge for at sikre godt forsegling kolbe. (B) 1) 2 V sidearm kolbe fyldt med 1,9 l vand 2) gasrør og luft bubbler (blå) til anvendelse i nitrogenbobling og rumluft boblende henholdsvis 3) Nitrogen tank og udmålte værdier 4) 2 L kolbe fyldt med 0,4 l vand med vakuumrør nedsænket 5) Opløst ilt meter. klik her for atse en større version af dette tal.
2. Eksperimentel Set up
- På en bænk top, tilslutte en standard walled vakuumrør til sidearmen af en 2 L sidearm kolbe som vises (1 i figur 1 B).
- kolben Fyld med 1,9 l stream vand fra 3 L plastic beholdere indsamlet stream vand i køleskabet indstillet til 12 ° C.
- Placer kolben og slange på en bakke stor nok til at holde et isbad omkring side-arm kolbe uden at skjule visningen af kolben interiør og fylde bakken med is.
- Bore to 3 mm diameter huller i en gummiprop for at tillade passage af 1) en kobberrør at levere gassen til beholderen og 2) proben for en DO apparat i 2 L sidearm-kolbe (1 i figur 1 B) .
- Foretag en lateral incision fra kanten af proppen til et af hullerne for at tillade placering af tråden af DO-sonden i proppen.
- Tilslut en kobling med en 3 mm slange mandligebarb til et stykke 2 mm kobber rørdiameter (1 i figur 1A). Sikre, at dette rør er lang nok til at nå til inden for 10 cm af bunden af kolben og opnå gennem proppen.
- Placer røret med kobleren selvom det andet hul i proppen, indtil længden fra bunden af proppen er nok til at nå til inden for 10 cm af bunden af kolben.
- Tilslut en 0,75 m længde, tyndvægget polyethylen gasrør med en diameter på 3 mm til koblingen på røret.
- Skub både DO-sonde og kobberrør ned i kolben, og kolben med prop forsegle.
- Check for en sikker tætning mellem proppen og kolben, samt en pasform mellem røret og proben wire inden proppen.
- Fyld en 1 L kolbe med 0,4 l ledningsvand og placere ved siden af bakken med isbad, og termokande.
- Sænk polyethylenrøret kommer fra store termokande i vandet af 1 liters kolbe. Fastgørrør med tape, således at det vil forblive nedsænket gennem eksperimentet.
- Tilslut diameter gasledningen 3 mm fra termokande til et akvarium værelse-air bubbler. Begynd at boble vandet i 2 L kolbe ved at tilslutte akvariet bobleflasken, som indfører rumluften og ilt til vandet.
- Overvåg DO koncentration og temperatur af vandet med DO meter i 5 minutter, eller indtil ligevægt i DO er etableret i kammeret, således at en lille ændring i DO forekommer.
3. Afprøvning stabilitets af Experimental Set Up
- Test hver opsætning til DO stabilitet før tilsætning af slørvinger.
- Tilføj tre eller fire sten til 2 L kolbe, således at slørvinger har substrat befordrende for pushups.
- Begynd en retssag manipulation af DO ved at frakoble gas røret fra bobleflasken og fastgøre den til kvælstof gasledningen.
- Begynd boblende nitrogen på 20 kubikfod per time (CFH) for ca. 40sek til 1 min.
- Når DO er faldet til under 0,5 mg / l af målkoncentration, reducere strømmen til 15 CFH og tillade koncentrationen til at falde til målet.
- Cease nitrogenstrøm straks efter målkoncentration er nået.
- Brug akvariet room-luft bubbler at returnere koncentrationen til målet koncentrationen, hvis DO falder under målet.
- Hvis DO er ustabil under afprøvningen af en set-up derefter kontrollere vandmængden er stadig på 1,9 L og ingen vand har boblet ud, vandtemperaturen er stabil og ikke forandring, og tætninger på alle fittings synes at være stramt og forseglet.
- Når tre forsøg er blevet udført, og forsøgslederen har tillid til evnen til at kontrollere DO, vedhæfte gasledningen til absorptionskolben og boble til ligevægt igen.
- Boblen til ligevægt ved at fastgøre diameteren gasledningen 3 mm til akvariet bobleflasken og starte tilsætningen af rumluft til vandet indtil koncentrationen afoxygen i vandet ikke øger eller ændrer i 3 min.
- Når på ligevægt, stop boblende og kolben bryde forseglingen.
4. Stonefly Push-up Experiment
- Divider det samlede antal slørvinger med antallet af observatører til at bestemme antallet af forsøg for at udføre.
- Bestemme forskellige DO niveauer mellem 2 og 10 mg / l for at evaluere adfærdsmæssig reaktion af slørvinger (antal pushups).
- Opsæt en kolbe pr forsøg og tilføje et lige antal slørvinger, som der er observatører til kolben (4 slørvinger i denne design), placere sonden og røret tilbage i kolben, så kolben med gummiproppen forsegle.
Bemærk: En indledende DO koncentration på 10 mg / l blev valgt som den første observationspunkt da det var DO-koncentrationen af strømmen fra hvor slørvinger blev indsamlet. - Når vandet er ved 10 mg / l ved at boble følgende trin 2,10-2,11, optage udgangs vandtemperatur og tilladeslørvinger at knytte til rock substrat i kolben.
- Tildel kun én observatør til at se en enkelt Stonefly at sikre nøjagtig optælling af push-up opførsel, som er op og ned kropsbevægelser udvist af Stonefly.
- Tælle og registrere antallet af push-ups observeret i løbet af en 3 min observationsperioden.
- Manipulere DO til næste eksperimentelle DO niveau og gentag 3 min observationsperiode for de yderligere eksperimentelle niveauer.
Bemærk: Inden for denne eksperimentelle design blev tre forskellige DO niveauer evalueret.
5. Statistisk analyse
- For at udføre statistisk analyse brug gennemsnitlige antal push-ups på tværs af de fire slørvinger på tværs af en gruppe for en given DO retssag.
- Brug den gratis R statistiske computing software 12 til at udføre en variansanalyse (ANOVA) af antallet af push-ups og DO-koncentrationer ved hjælp af rækkefølgen af de enkelte eksperimentelle forsøg (DO-niveau) og temperatur som covariates. Analyseret DO som diskrete niveauer af en enkelt faktor.
- Brug en Anderson-Darling normalitet test på residualerne for at tjekke for normalitet 13.
- Udfør en lineær regression på data ved at plotte det gennemsnitlige antal push-ups mod DO koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks forsøg med den beskrevne opsætning blev udført af 24 freshmen bachelorstuderende i en undervisning laboratorium indstilling til at kvantificere antallet af armbøjninger slørvinger udføre som reaktion på forskellige DO koncentration i vand. Det gennemsnitlige antal push-ups udføres inden en DO-niveau og inden for hvert forsøg blev samlet at plotte push-ups mod DO-niveau i figur 2. En ANOVA blev udført oprindeligt udnytte DO-koncentration, rækkefølge af forsøg, temperatur, samt samspillet mellem alle variabler. Resultaterne tyder på, at kun gøre koncentration væsentligt påvirket antallet af push-ups udført af slørvinger (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) og ingen anden variabel eller interaktion var en signifikant prædiktor for pushups. Alle data, der anvendes i denne analyse blev bekræftet for normalitet ved hjælp af en Anderson-Darling testen.
indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 2. Gennemsnitlig antal push-ups udført af slørvinger grupperet efter retssagen plottet mod koncentrationen af opløst ilt. Det viser en signifikant negativ sammenhæng (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) mellem push-ups og koncentration af opløst ilt (hældning -6,063). Røde tal indikerer vand (i ° C) i en forsøgsperiode. Temperaturerne var stabile på tværs af 3 min prøveperioder, men varieret hele eksperimentet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Kode Fil:. R-kode for de statistiske analyser Klik her for at downloade dennefil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
Denne procedure giver en enkel og effektiv måde at manipulere DO i et laboratorium indstilling til at udføre adfærdsmæssige undersøgelser på vandorganismer. Vi fandt der at være flere kritiske trin / elementer til at være opmærksom på, når du udfører dette eksperiment, der er direkte relateret til resultaterne. Inden for en prøveperiode, er det afgørende at opretholde trykkammeret for at undgå ændringer i partialtrykket af gasser over vandet, og efterfølgende DO udsving. Efter trinene i "teste stabiliteten af forsøgsopstillingen" underafdeling af protokollen er kritisk. Inspektion forseglingen af proppen med kolben, hvilket sikrer fuldstændig nedsænkning af vakuumet slangen i 1 L kolbe af vand (for at forhindre tilbagestrømning af rumluft), og siddepladser gasledningen og DO wire tætning med proppen kan hjælpe med at opretholde en stabil kammer miljø. Derudover maksimerer mængden af vand i kammeret er nødvendig for at forbedre stabiliteten af DO indenen retssag, som vi har fundet, at alt for lidt volumen resulterer i uregelmæssig og ustabil DO manipulationer.
er bydende nødvendigt for god kontrol med interne DO niveauer Fastholdelse vandtemperaturen i kammeret. Mens vi var i stand til at opretholde kulde-vandtemperaturer inden for de enkelte eksperimenter gruppe, nogle minimale variation i temperatur tværs af forskellige forsøg var tydelig (figur 2). Da vores samlede sortiment af temperaturer var lav (11.8-13.5˚C) og inden for det typiske område for slørvinger, var det ikke vise sig at være en betydelig indikator i vores model for Stonefly pushups. Imidlertid er vandtemperaturen kendt for at bevirke iltmætningen potentiale vand 14,15, og undlade at foretage kammer vandtemperaturen ville have direkte virkninger for DO-niveauer. Med en god tætning, passende volumen vand, og stabil vandtemperatur, intern kammertryk og DO er let at vedligeholde hele forsøget og kontrol med DO mellem forsøg er sbord og reproducerbar.
Begrænsninger og Ændringer
To potentielle begrænsninger af dette forsøg er størrelsen af kammeret og længden af observationsperioden. Volumenet af vand (~ 2 I) og lille åbning i nakken af kammeret begrænser størrelsen organismens kunne anvendes. På denne skala, ville protokollen giver mulighed for nem udskiftning af slørvinger for andre smådyr, padder og mindre fisk, men ville ikke være gældende for større organismer (dvs. rovfisk, blÃ|ksprutterne). Dog ville det være muligt at skalere dette eksperiment op ved hjælp af større glasvarer, og tilpasse den overordnede protokol til at opfylde forskellige læring / forskningsmål med større organismer. Derudover bør der tages nogen underlag kræves i kammeret for større organismer i betragtning, når de vælger glasvarer på grund af lille hals størrelse på 2 L kolbe. I vores eksperiment blev lille flod-sten indsamlet med slørvinger og forudsat rigelig kammer s ubstrate for slørvinger at udføre pushups.
Interne kammer betingelser over korte tid observationsperioder blev opretholdt med minimale udsving, dog stadig usikkerhed om længere observation perioder. Ved hjælp af 3 min observationsperiode skitseret i protokollen, kammer vandtemperatur og DO niveauer blev fastholdt på konstante værdier. Vi var i stand til at opretholde DO og vandtemperatur op til en 5 min observationsperiode, men ved en 10 min lang observationsperiode, vandtemperaturer i kammeret begyndte at stige. I den nuværende protokol, er det ikke muligt at forlænge observationsperioden over 5 min. tilpasninger af nuværende protokol (såsom at bruge et klima kontrolleret rum), vil dog kunne tillade øget langsigtet stabilitet vandtemperaturer. Desuden vil en mere robust og detaljeret analyse af observation tid versus omgivende vand (temperatur, DO, delvis tryk) hjælpe med at afgøre begrænsende faktorer.
indhold "> Denne protokol har evnen til at blive ændret (som nævnt ovenfor) for at opfylde en række forskellige behov og mål. En ekstra ændring af det eksisterende protokol ville være en ændring af boblende systemet. Mens vi udnyttet udelukkende et lille kobberrør at boble i vandet, vi har bemærket, at tilføjelsen af de store kvælstof gasbobler ofte fortrængt de slørvinger fra deres hold på floden sten og sendte dem flyder rundt i kammeret. vi har forsøgt at bruge en boblende sten til mere jævn spredning af kvælstof gas , men fandt, at kammeret vand ikke blev rystet nok til jævnt dispergere nitrogengas, hvilket resulterer i en søjle af hypoxiske betingelser i kammeret. Yderligere raffinering af nitrogengas leveringssystem kan give nyttig indsigt, og fjern den potentielle forvirre af forskubbe slørvinger fra substrat mellem DO forsøg. Betydning og fremtidige applikationer
Dette eksperiment var den første af sin art i, kan nævnes en detaljeret protokol udvikling til at manipulere DO niveauer for dyreadfærd observation i et laboratorium indstilling. Mens andre offentliggjorte arbejde foreslået anvendelsen af nitrogengas til at manipulere DO-niveauer 7,8,16, er utilstrækkelig metodologiske detaljer gives for at tillade replikation. Interessen for denne protokol udvikling stammede fra vores ønske om at manipulere DO niveauer og observere dyrenes adfærd til brug i en college-niveau indledende økologi laboratorium på Juniata College. Inden klassen af 24 studerende, denne protokol viste sig reproducerbar tværs forsøg med forskellige DO niveauer og på tværs af grupper af studerende. Desuden denne protokol giver en yderst tilgængelig og omkostningseffektiv måde at manipulere DO niveauer til laboratorie eksperimenter.
Mens denne protokol blev udviklet specielt til brug med slørvinger i en undervisning laboratorium, kunne det let tilpasses til andre mål. Mere specifikt kan denne protokol nemt bruges med andre små vandlevendesmådyr, fisk og endda padder afhængigt af arten af interesse. For eksempel medlemmer af Amphipodia ordre, som øger deres lokomotiv aktivitet som reaktion på hypoxi 17 kunne anvendes, eller guldfisk (Carassius auratus), der udviser en "gulping" adfærd ved vandoverfladen under hypoxiske betingelser 16. Derudover kunne forskellige livsstadier af akvatiske organismer også anvendes sammen med denne protokol til at hjælpe fremme vores forståelse af organismal ilt krav i hele udviklingen. Denne protokol kan også anvendes til at studere biokemiske reaktioner på hypoksi ved at eksperimentere med padder som mudpuppies (Necturus maculosus) 18. Endvidere kan denne protokol skaleres op eller ned i størrelse til at opfylde behovene i større eller mindre organismer og undervisning eller forskning applikationer. Mens vi føler, at protokollen og den konkrete anvendelse i sig selv er af bred økologisk interesse, den største styrke i denne protocol er, at det giver en stor fundament udvikling på tværs taksonomiske grupper og eksperimentelle målsætninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D.
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,.
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D.
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
