Summary
Este artigo descreve um protocolo simples e reprodutível para manipular condições de oxigénio dissolvido em um ambiente de laboratório para estudos de comportamento animal. Este protocolo pode ser utilizado tanto em ambientes de ensino e laboratórios de investigação para avaliar a resposta do organismo de macroinvertebrados, peixes, anfíbios ou a alterações na concentração de oxigênio dissolvido.
Abstract
A capacidade de manipular o oxigênio dissolvido (OD) em um ambiente de laboratório tem aplicação significativa para investigar uma série de questões de comportamento ecológico e organismos. O protocolo aqui descrito proporciona um método simples, reprodutível e controlado para manipular DO para estudar a resposta comportamental em organismos aquáticos que resultam de hipoxia e condições anóxicas. Durante a execução de desgaseificação de água com nitrogênio é comumente usado em configurações de laboratório, nenhum método explícito para aplicação ecológica (aquático) existe na literatura, e este protocolo é o primeiro a descrever um protocolo para desgaseificar água para observar a resposta do organismo. Esta técnica e protocolo foram desenvolvidos para aplicação directa de macroinvertebrados aquáticos; No entanto, pequenos peixes, anfíbios e outros vertebrados aquáticos poderia ser facilmente substituído. Ele permite a fácil manipulação dos níveis de OD variando entre 2 mg / L até 11 mg / L, com estabilidade de até um período de observação de animais-5 min.Além de um período de 5 min de observação temperaturas da água começou a subir, e aos 10 min FAZER níveis tornou-se demasiado instável para manter. O protocolo é escalável para o organismo estudo, reprodutível e confiável, permitindo uma rápida implementação em laboratórios de ensino introdutório e aplicações de pesquisa de alto nível. Os resultados esperados desta técnica deve relacionar dissolvido mudanças de oxigênio para as respostas comportamentais de organismos.
Introduction
oxigênio dissolvido (OD) é um parâmetro físico-químico chave importante na mediação de uma série de processos biológicos e ecológicos nos ecossistemas aquáticos. Exposições a sub-letal hipóxia aguda e crónica reduzir as taxas de crescimento em certos insetos aquáticos e reduzir a sobrevivência dos insetos expostos 1. Este protocolo foi desenvolvido para fornecer um método controlado para manipular os níveis de OD em água corrente para observar os efeitos sobre o comportamento animal. Desde a sobrevivência todos os organismos aquáticos aeróbios 'depende da concentração de oxigênio para viver e se reproduzir, alterações na concentração de OD são muitas vezes reflete em mudanças de comportamento por organismos. Invertebrados aquáticos móveis mais e peixes foram observados para responder a baixas concentrações de oxigênio (hipóxia), buscando locais com maior DO 2,3. Para os organismos aquáticos menos móveis, adaptações comportamentais para aumentar a ingestão de OD pode ser a única opção viável. A ordem de macroinvertebrados aquáticos de Plecoptera (stonefly) foi anotado para realizar movimentos "push-up" para aumentar o fluxo de água e absorção de oxigênio, através de suas brânquias externas 4 - 6. Estes comportamentos adaptativos foram observados em ambientes naturais e em experiências de laboratório.
manipulação laboratorial de OD na água abre oportunidades significativas para estudos de comportamento animal, mas existem lacunas significativas na implantação metodológica. Por exemplo, um estudo utilizou grandes aquários para avaliar o tempo fisiológico resposta do baixo Largemouth (Micropterus salmoides) para ambientes hipóxicos seguinte gaseamento com nitrogênio, mas pouca detalhe é dado para a metodologia 7. Outro estudo realizado na zebra peixes (Danio rerio) descreveu o uso de gás de azoto e uma pedra porosa para entregar gás para água e reduzir a DO da água 8. Para aplicações baseadas em química, métodos de desgaseificação de solventes utilizam especializadaAparelho 9-11 para remover o oxigénio a partir de solventes, mas não seria adequado para estudos de comportamento animal. Embora esses estudos empregar métodos para remover oxigênio da água, nenhum método descritivo puderam ser identificados que permitem a avaliação do comportamento animal em resposta a mudanças FAZER.
Este método descrito a seguir é uma tentativa de descrever completamente um protocolo para a manipulação de OD de água utilizando gás nitrogênio. Além disso, este método foi desenvolvido no sentido de observar as relações entre o comportamento stonefly (flexões) e fazer isso era empregado em um laboratório de biologia de nível de calouro. Uma das principais vantagens deste método é que ele pode facilmente ser realizada dentro de um laboratório com vidros e materiais acessíveis para a maioria das instituições de ensino secundário e superior comum. O protocolo também é facilmente adaptável, permitindo a indivíduos para escalar o procedimento para cumprir os objectivos estabelecidos para aplicações de pesquisa ou de ensino.
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Protocol
Nota: Este experimento não usar vertebrados e, portanto, não necessitam de aprovação pelo Instituto de Juniata College for Animal Care e do Comitê Use. No entanto, para os indivíduos adaptando este método para uso com vertebrados, aprovação IACUC deve ser procurado.
Coleta de Amostras 1. Campo
- Determinar e avaliar os sites de campo potenciais para a capacidade de coletar, armazenar e stoneflies transporte rapidamente para minimizar o tempo em trânsito com um tempo máximo recomendado em trânsito de 1 hora.
- Operações de amostragem kick-net no local campo selecionado seguindo os procedimentos pontapé-net padrão vezes o suficiente para recolher pelo menos 35 stoneflies 12.
- Colete 50 L de água corrente e as rochas com um diâmetro máximo de 2 cm a partir de fluxos.
- Coloque aquários num frigorífico ajustado para a temperatura do local de corrente. Distribuir rochas coletadas no local do fluxo em aquários e encher com 4 L de água corrente por aquário. coloque 20-30 Stoneflies recolhidos por aquário e colocar uma pedra borbulhante anexado a um bubbler aquário em cada tanque e ligue bubblers para adicionar continuamente o ar ambiente para a água.
- Permitir que as stoneflies para se adaptar ao novo ambiente nos aquários para um período de 48 horas.
Figura 1. Configurar a manipulação de oxigénio dissolvido. (A) 1) Montagem de tubo de cobre para espigão macho 2) Localização do selo rolha para examinar para assegurar o bem vedação frasco. (B) 1) 2 L frasco de braço lateral cheio com 1,9 L de água 2) do tubo de gás e um borbulhador de ar (azul) para uso em borbulhamento de azoto e quarto borbulhamento de ar, respectivamente, 3) tanque de azoto e os valores calibrados 4) 2 L balão cheia com 0,4 L de água com tubo de vácuo submersa 5) dissolvido medidor de oxigênio. por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura.
2. Experimental Set up
- No topo de uma bancada, ligar um tubo de vácuo de paredes padrão para o braço lateral de um frasco de braço lateral de 2 L como é mostrado (1 na Figura 1B).
- Encha o frasco com 1,9 L de água corrente a partir de 3 L recipientes de plástico de retenção de água corrente coletado em frigorífico ajustado a 12 ° C.
- Colocar o balão e tubos em uma bandeja grande o suficiente para conter um banho de gelo em torno do frasco de braço lateral sem obscurecer a visão do interior balão e encher a bandeja com gelo.
- Perfurar dois buracos de 3 mm de diâmetro em uma rolha de borracha para permitir a passagem de 1) um tubo de cobre para distribuir o gás para o recipiente e 2) a sonda de um medidor de OD para o frasco de braço lateral de 2 L (1 na Figura 1B) .
- Adicione uma incisão lateral a partir da borda da tampa de um dos furos para permitir que o assento de fio de a sonda de OD na rolha.
- Conectar um acoplador macho com uma mangueira de 3 milímetrosfarpa a um pedaço com 2 mm de diâmetro de tubo de cobre (1 na Figura 1A). Assegure-se que este tubo é suficientemente longo para alcançar a menos de 10 cm do fundo do frasco, para se alcançar através da rolha.
- Colocar o tubo com acoplador embora o segundo buraco na tampa até que o comprimento da parte inferior da rolha é suficiente para alcançar a menos de 10 cm do fundo do frasco.
- Conectar um comprimento de 0,75 m, tubo de parede fina de polietileno de gás com um diâmetro de 3 mm para o engate no tubo.
- Deslize tanto a sonda de OD e tubo de cobre para o balão e selar a garrafa com a rolha.
- Entrada para uma vedação perfeita entre a tampa e a garrafa, bem como um ajuste confortável entre o tubo e o fio de sonda no interior da rolha.
- Encher um balão de 1 L com 0,4 L de água da torneira e colocar ao lado da bandeja com o banho de gelo e frasco de vácuo.
- Submergir o tubo de polietileno proveniente do balão de vácuo grande para a água do balão de 1 L. Fixe otubo com fita adesiva de tal modo que ele irá permanecer submerso por meio da experiência.
- Ligue a linha de gás de 3 mm de diâmetro do balão de vácuo a um bubbler sala de ar do aquário. Comece a bolha da água no balão de 2 L ligando o bubbler aquário, que introduz ar ambiente e oxigênio para a água.
- Monitorar a concentração de OD e temperatura da água com o medidor de OD durante 5 min ou até que o equilíbrio de OD é estabelecida dentro da câmara de tal modo que pouca mudança no DO está a ocorrer.
3. Teste a estabilidade da montagem experimental
- Teste cada configuração para a estabilidade DO antes da adição de stoneflies.
- Adicione três ou quatro pedras para o balão de 2 L de modo que stoneflies tem substrato propício para flexões.
- Comece uma manipulação experimental de DO, desligando o tubo do gás proveniente do borbulhador e anexá-lo para a linha de gás nitrogênio.
- Comece borbulhando azoto a 20 pés cúbicos por hora (CFH) por aproximadamente 40s a 1 min.
- Uma vez que a DO caiu para menos de 0,5 mg / L de concentração do alvo, reduzir o fluxo para 15 CFH e permitir que a concentração diminuir para o alvo.
- Cessar o fluxo de nitrogênio imediatamente uma vez que a concentração alvo é atingido.
- Use o bubbler sala de ar do aquário para retornar a concentração para a concentração de destino se a DO diminui abaixo da meta.
- Se a DO é instável durante o teste de um set-up, em seguida, verificar o volume de água ainda está em 1,9 L e nenhuma água foi originado fora, a temperatura da água é estável e não mudando, e os selos em todos os acessórios parecem ser apertado e selado.
- Depois de três ensaios foram realizados e o analista tem confiança na capacidade para controlar DO, anexar a linha de gás para o bubbler e bolha ao equilíbrio novamente.
- Bolha até ao equilíbrio, anexando a linha de gás de 3 mm de diâmetro para o borbulhador de aquário e iniciando a adição de ar ambiente para a água até que a concentração dede oxigénio na água não aumentar ou alterar durante 3 min.
- Uma vez em equilíbrio, parar borbulhando e abre o frasco.
4. Stonefly Experiment Push-up
- Dividir o número total de stoneflies ao número de observadores para determinar o número de ensaios a realizar.
- Determinar diferentes níveis de OD entre 2 e 10 mg / L para avaliar a resposta comportamental de stoneflies (número de flexões).
- Configure um frasco por tentativa e adicionar um número igual de stoneflies como há observadores para o frasco (4 stoneflies dentro deste design), coloque a sonda e o tubo de volta para o balão, em seguida, feche o frasco com a tampa de borracha.
Nota: Uma concentração de DO inicial de 10 mg / L foi escolhido como o primeiro ponto de observação, uma vez que era a concentração de OD da corrente a partir de onde os stoneflies foram amostrados. - Uma vez que a água é de 10 mg / L por borbulhamento seguintes etapas 2,10-2,11, registar a temperatura da água inicial e permitir ostoneflies para anexar ao substrato rocha no frasco.
- Atribuir apenas um observador para assistir a um único stonefly para garantir uma contagem precisa do comportamento do push-up, que é o movimento do corpo para cima e para baixo exibida pela stonefly.
- Contar e registrar o número de flexões observados ao longo de um período de observação 3 min.
- Manipular FAZER para o próximo nível de OD experimental e repetir período de observação de 3 minutos para os níveis experimentais adicionais.
Nota: Dentro deste desenho experimental, três níveis de OD diferentes foram avaliados.
5. Análise Estatística
- Para executar número médio utilização análise estatística de flexões nas quatro stoneflies através de um grupo para um determinado julgamento DO.
- Use o software estatístico R computação livre de 12 para executar uma análise de variância (ANOVA) sobre o número de flexões e as concentrações fazer usando a ordem de cada ensaio experimental (DO nível) e temperatura que covariates. Analisados fazer como níveis discretos de um único fator.
- Use um teste de normalidade de Anderson-Darling na resíduos para verificar a normalidade 13.
- Executar uma regressão linear nos dados locando a média do número de flexões contra concentrações de OD.
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Representative Results
Seis estudos da configuração descrita foram realizados por 24 calouros estudantes de graduação em um ambiente de laboratório de ensino para quantificar o número de flexões stoneflies executar em resposta a concentração de OD diferente na água. O número médio de flexões realizada dentro de um nível de OD e dentro de cada ensaio foi reunida para traçar flexões contra o nível de OD na Figura 2. Uma análise de variância foi realizada inicialmente utilizando concentração de OD, a ordem sequencial de ensaios, temperatura, bem como as interações entre todas as variáveis. Os resultados sugerem que só fazem concentração influenciou significativamente o número de flexões executadas por stoneflies (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) e nenhuma outra interação variável ou foi um preditor significativo de flexões. Todos os dados utilizados nesta análise foi confirmada a normalidade utilizando um teste de Anderson-Darling.
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Figura 2. O número médio de flexões executadas por stoneflies agrupados por tentativa função da concentração de oxigênio dissolvido. Isso mostra uma relação negativa significativa (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) entre flexões e concentração de oxigênio dissolvido (inclinação de -6,063). Os números vermelhos indicam a temperatura da água (em ° C) para um teste. As temperaturas mantiveram-se estáveis ao longo de 3 períodos min julgamento, mas variado em todo o experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar arquivo de código:. Code R para as análises estatísticas Por favor clique aqui para baixar esteArquivo.
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Discussion
As etapas críticas
Este procedimento proporciona um modo simples e eficaz para manipular OD num ambiente de laboratório para realizar estudos comportamentais em organismos aquáticos. Descobrimos que haja vários críticos passos / itens para estar ciente de quando realizar este experimento que directamente relacionada com os resultados. Dentro de um teste, é crítica para manter a pressão da câmara a fim de evitar alterações na pressão parcial de gases acima da água, e subsequente FAZER flutuações. Seguindo os passos descritos no "testar a estabilidade da instalação experimental" subseção do protocolo é crítica. Inspeccionando o selo da tampa com o balão, assegurando submersão completa do tubo de vácuo para o balão de 1 L de água (para impedir o refluxo de ar ambiente), e assentando a linha de gás e DO vedação fio com a rolha pode ajudar a manter uma estabilidade ambiente de câmara. Além disso, a maximização do volume de água na câmara é necessário para melhorar a estabilidade de fazer dentroum julgamento que temos encontrado que o volume muito pouco resultado em errática e instável FAZER manipulações.
Manter a temperatura da água na câmara é imperativo para um bom controle dos níveis internos DO. Enquanto nós fomos capazes de manter a temperatura de água fria dentro experiências individuais do grupo, alguma variação mínima na temperatura em diferentes estudos foi evidente (Figura 2). Desde a nossa gama global de temperaturas foi baixa (11.8-13.5˚C) e dentro do intervalo típico para stoneflies, ela não provou ser um preditor significativo em nosso modelo de flexões stonefly. No entanto, a temperatura da água é conhecido por afetar o potencial saturação de oxigênio da água 14,15, e não para manter a temperatura da água câmara teria um impacto directo nos níveis de DO. Com uma boa vedação, o volume adequado de água, ea temperatura da água estável, pressão da câmara interna e fazem é facilmente mantida durante todo o experimento e controle de OD entre os ensaios é smesa e reprodutível.
Limitações e Modificações
Duas limitações potenciais desta experiência são o tamanho da câmara, e o comprimento do período de observação. O volume de água (~ 2 L) e pequena abertura no gargalo da câmara limita o tamanho do organismo capaz de ser usado. Nessa escala, o protocolo seria permitir a fácil substituição de stoneflies para outros macroinvertebrados, anfíbios e peixes menores, mas não seria aplicável para organismos maiores (ou seja, peixes predadores, polvos). No entanto, seria possível escalar esta experiência ao usar maior vidraria, e adaptar o protocolo geral para atender aos objetivos de aprendizagem / pesquisa diferentes com organismos maiores. Além disso, qualquer substrato necessária na câmara por organismos maiores devem ser tidas em conta na escolha de material de vidro devido ao pequeno tamanho do pescoço do frasco de 2 L. Em nosso experimento pequeno rio-pedras foram coletadas com stoneflies e amplo câmara de s ubstrate para os stoneflies para executar flexões.
condições câmara interna ao longo de períodos de observação de tempo curto foram mantidas com flutuações mínimas, no entanto, as incertezas permanecem sobre períodos de observação mais longos. Utilizando o período de observação 3 min delineado no protocolo, a temperatura da água da câmara e DO níveis foram mantidos em valores constantes. Fomos capazes de manter DO e temperatura da água até um período de observação de 5 minutos, mas a um longo período de observação de 10 min, temperatura da água na câmara começou a subir. No protocolo atual, que não é viável para estender o período de observação para além de 5 min. No entanto, adaptações ao protocolo atual (como o uso de uma sala climatizada) poderia permitir uma maior estabilidade a longo prazo da temperatura da água. Além disso, uma análise mais robusta e detalhada do tempo de observação em relação as condições da água do ambiente (temperatura, OD, de pressão parcial) iria ajudar a determinar fatores limitantes.
content "> Este protocolo tem a capacidade de ser modificado (como mencionado acima) para atender a uma série de diferentes necessidades e objectivos. Uma modificação adicional ao protocolo existente seria uma modificação para o sistema de borbulhamento. Enquanto nós utilizamos apenas um pequeno tubo de cobre a borbulhar da água, fizemos notar que a adição de grandes bolhas de gás nitrogênio, muitas vezes desalojado os stoneflies de sua influência sobre as pedras do rio e os enviou flutuando em torno da câmara. Nós tentou usar uma pedra borbulhando por mais mesmo dispersão de gás nitrogênio , mas descobriu que a água da câmara não foi agitado suficiente para dispersar uniformemente o gás de azoto, resultando em uma coluna de condições hipóxicas no interior da câmara. refinamento adicional do sistema de distribuição de gás de azoto pode fornecer informações úteis, e remover o confundem potencial de deslocar stoneflies de substrato entre ensaios dO. Significado e futuras aplicações
Este experimento foi o primeiro de seu tipo nocluir um desenvolvimento detalhado protocolo para manipular os níveis fazer por observação do comportamento animal em um ambiente de laboratório. Enquanto outros trabalhos publicados sugerido o uso de gás de azoto para manipular os níveis de OD 7,8,16, insuficiente detalhe metodológico é dada para permitir a replicação. Interesse neste desenvolvimento de protocolo resultou de nosso desejo de manipular os níveis de DO e observar o comportamento dos animais para uso em laboratório ecologia introdutório de nível universitário em Juniata College. Dentro da classe de 24 alunos, este protocolo mostrou reprodutível entre os ensaios com diferentes níveis de OD e entre grupos de estudantes. Além disso, este protocolo fornece uma maneira altamente acessível e de baixo custo para manipular os níveis fazer por experimentação laboratorial.
Embora este protocolo foi desenvolvido especificamente para uso com stoneflies em um laboratório de ensino, que poderia facilmente ser adaptado para outros objetivos. Mais especificamente, este protocolo pode ser facilmente utilizado com outros pequenos aquáticomacroinvertebrados, peixes, anfíbios e até mesmo, dependendo da espécie de interesse. Por exemplo, os membros da ordem Amphipodia que aumentam sua atividade locomotiva em resposta à hipóxia 17 poderia ser usado, ou peixe dourado (Carassius auratus) que exibem um "engolir" o comportamento na superfície da água durante condições de hipóxia 16. Além disso, vários estágios de vida de organismos aquáticos também pode ser usado com este protocolo para ajudar ainda mais a nossa compreensão da demanda de oxigênio organismais ao longo do desenvolvimento. Este protocolo também pode ser utilizado para estudar as respostas bioquímicas à hipóxia através da experimentação de anfíbios, como mudpuppies (necturus maculosus) 18. Além disso, este protocolo pode ser escalado para cima ou para baixo no tamanho para atender às necessidades de organismos maiores ou menores e aplicativos de ensino ou de pesquisa. Apesar de acharmos que o protocolo ea própria aplicação específica é de grande interesse ecológico, a maior força deste Protocol é que ele fornece um grande desenvolvimento fundação entre os grupos taxonômicos e objetivos experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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