Introduction
Fagositoz tanıma ve yutulur malzemenin içselleştirme ve bozulmasına yol açar, reseptörleri yüzey malzemesinin bağlanmasını başlar başlıca bir hücre fonksiyonudur. Böyle kalıp Dictyostelium discoideum ve amip gibi tek hücreli ökaryotlar bakteriler üzerinde beslemek için fagositoz kullanırken, yüksek organizmalar profesyonel hücreleri ile gelişmiştir. Makrofajlar ya da dendritik hücreler, çeşitli doku ve organlarda patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve antijen sunumu ve sitokin üretimi 1-4 ile adaptif bağışıklık sistemini aktive etmek için çok önemlidir. Belirli koşullar altında, fagositoz profesyonel olmayan fagositik hücreler, örneğin, endotel ve epitel hücreleri tarafından gerçekleştirilebilir. Bu işlem gelişimi sırasında ve normal doku devirinde ve yeniden modelleme için erişkin homeostazın muhafaza etmek önemlidir. Böyle testiste veya retina Sertoli hücreleri Son olarak, özel fagositlerpigment epitel hücreleri son derece güçlü fagositler 5 vardır.
Bir fagozomun oluşumu burada mikroorganizmalar veya hücresel döküntü bozunması fagositik hücrenin yüzeyi üzerinde fagositik reseptörlerinin kümelenme ile başlar oluşur. sistemlerinde, Fc alıcıları (FcR) ya da tamamlayıcı reseptör (CR) ve opsonik reseptörlerin kümeleme, aşağıdaki akıntı yönündeki sinyal olaylarını de karakterize edilmiştir. Ancak, Toll benzeri reseptörler (TLR), lektinler, mannoz reseptörleri ve çöpçü reseptörleri de dahil olmak üzere pek çok sivil opsonik reseptörleri de vardır. Bu reseptörler, mannoz veya fukoz kalıntılarının, fosfatidilserin ve lipopolisakkaritler 1,6-9 parçacık yüzeyi üzerinde determinantlar tanır.
Patojen veya hücre enkaz tanıma ve daha sonra yoğun ve geçici aktin yeniden yol fagositik reseptör çeşitli türleri, kümeleme bağlayıcı içerir. hücre içi compartmen paralel fokal ekzositozdats membran geriliminin serbest bırakılmasından katkıda bulunur ve büyük partiküllerin etkin fagositoz önemlidir. aktin polimerizasyonu ve membran deformasyon yol açan sinyal olayları tek bir fagositik reseptör tetikleyen deneysel modellerde disseke edildi. FcR aracılı fagositoz sırasında küçük GTPases (rac, Cdc42) tarafından düzenlenir yoğun bir aktin polimerizasyon bulunmaktadır. Bunların efektörlere arasında, Wiskott-Aldrich sendromu proteini (WASP) aktin filamanlarını 1,2,4,10 çekirdeklerin Aktin-ilişkili protein kompleksi 2/3 (ARP2 / 3) aktivasyonuna yol açar. Fosfatidilinositol-4, 5-bifosfat (PI (4,5) P2) Yerel üretim pseudopod oluşumunu sürücüler ilk aktin polimerizasyonu için çok önemlidir. PI (3,4,5) P3 olan dönüşüm pseudopod uzatma ve fagosom kapak 11 için gereklidir. Çeşitli yollar PI (4,5) P 2 kayboluşu katkıda bulunur. fosfatidilinositol fosfat kina öncelikle dekolmanıfagosom tutukladı PI (4,5) P2 sentezi gelen ses (PIPKIs). İkinci olarak, fosforile edilebilir ve ben kinazlar (PI3K) PI3K sınıf tarafından tüketilen ve PI (3,4,5) P3 12 dönüştürülür. Fosfatazlar ve fosfolipaz için bir rolü, memeli hücrelerinde ve Dictyostelium 13,14 fagositoz sırasında PI (4,5) P2, hidroliz ve F-aktin çıkarılması ima edilmiştir. Fosfolipaz C (PLC) δ diasilgliserol ve inositol-1,4,5- tris fosfat PI (4,5), p, 2 hidrolize olur. PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 fosfataz OCRL (Lowe oculocerebrorenal sendromu), aynı zamanda fagosom oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. F-aktin ve depolimerizasyon hassas yerel oluşumu sıkıca uzayda ve zamanda düzenlenir ve biz hücre içi bölmelerin o işe göstermiştir böylece fagositik fincan dibinde yerel aktin depolymerization katkıda yerel OCRL fosfataz teslim etmek önemlidir fagosom kapatılması ve membran açılmasıyla meydana için gerekli mekanizma ve moleküler oyuncular kötü çünkü görselleştirme ve fagosom kapatılması siteyi takip zorluklar tanımlı kalır. Yakın zamana kadar, fagositoz zor fagosom kapatma sitenin zamanında görselleştirme yaparak, onların sırt yüzünde ya da iki tarafta parçacıkları içselleştirmek sabit veya canlı hücreler gözlendi. Buna ek olarak, sabitleme yöntemleri membranların ve önyargı yalancı ayak uzatma ve kapatma sonuçları geri çekilmesini neden olabilir. Buna karşılık, biz kurmak ve burada açıklamak var tahlil bize pseudopod uzantısı ve toplam iç yansıma mikroskobu (TIRFM) 16 dayalı canlı hücrelerde 13 fagositoz kapatılması adımını, görüntülemenizi sağlar. Bu optik bir teknik şeffaf arasındaki ara yüzeyde ince bir bölgede florofor uyandırmak üzere bir çabuk kaybolan dalga harcayacaktırkapak (lamel) ve bir sıvı (hücre kültür ortamı). uyarım derinliği kalınlığı plazma zarına yakın bir moleküler olayların canlandırılmasına olanak tanıyan bir katı yüzey yaklaşık 100 nm'dir. TIRFM yüksek sinyal-zemin oranı sağlar ve bağlı hücrelerin aydınlatma toplanan out-of-focus floresan ve sitotoksisite sınırlar. TIRFM yararlanan biz lamelleri IgG opsonize kırmızı kan hücrelerinin (IgG SRBC'ler) ile kaplanmış sonra poli-lizin ile aktive edildiği "fagosom kapatma tahlil" geliştirdi. ilgi geçici floresan etiketli proteinler ifade makrofajlar daha sonra IgG SRBClere yutmak için izin verilir. Hücreler kovalent olmayan cam yüzeyine bağlanmış olan hedef partikülleri ayırmak birlikte, psödopod uçları görülen ve TIRF modunda kaydedilebilir. TIRF satın almalar vis sağlayan, yukarıdaki aşama 3 mikron değişen sonra, Epifloresans modunda satın almalar ile birleştirilirfagositik fincan baz ualization. Bu işlem sırasında, aktin ya da Dynamin inhibe gibi farmakolojik ilaçların ilavesi, moleküler seviyede işlemini incelemek için de mümkündür. Burada detaylı bir şekilde tarif protokol RAW264.7 mürin makrofaj hücre çizgisinde ve opsonize edilmiş parçacıklar için olduğu ancak, herhangi bir diğer fagositik bir hücre ve boncuk gibi başka hedeflere sahip uyarlanabilir. Bu yöntem zaman ve çeşitli fagositik sürecinde pseudopod uzantısı ve fagosom kapatılması rol oynayan moleküler oyuncuların uzayda düzenlemenin daha iyi karakterizasyonu sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: LifeAct mCherry kullanılan plazmid 17 sonra üretilen Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, bir tür hediyedir.
1. Hücre ve transfeksiyonu
Not: RAW264.7 makrofaj komple ortam içinde, alt konfluent (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol, kadar büyütülür, 2 mM L-glutamin ve% 10 FCS ( 100 mm plaka fetal inek serumu)). Bunlar elektroporasyon ile floresan etiketli proteinleri kodlayan plazmid ile transfekte edilir. Rutin olarak, yaklaşık 5-6 Ekim 6 hücreleri, sırasıyla, her transfeksiyon ya da ko-transfeksiyon için plazmid, 20 ug veya 10 ug ile transfekte edilir, x. Elektroporasyon veya lipofeksiyon göre transfeksiyon için diğer araçlar alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabilir unutmayın.
- Hücre kaldırıcı hücreleri kazıyın ve pipetleme ve birkaç kez aşağı kültür ortamında 10 ml bunları tekrar süspansiyon.
- santrifüjHücre süspansiyonu 300 xg, sallanan açılı rotor oda sıcaklığında 5 dakika.
- tam orta Onceden 10 mi, 37 ° C de gentamisin 10 ug / ml ile takviye edilmiştir.
- Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve elektroporasyon kitinden "yıkama tamponu A" 3 ml pelletini.
- hücre süspansiyonu 300 xg, sallanan açılı rotor oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj.
- Bu süre içinde, oda sıcaklığında, DNA karışımı hazırlamak: 120 ul 2x tampon B, ilgilenilen proteinin, QSP 240 ul H2O kodlayan plazmit DNA 20 ug
- santrifüj sonrasında, tüm süpernatant atın.
- DNA karışımı hücre pelletini ve 4 mm elektroporasyon küvetler içine aktarın.
- 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 250 V, 900 iF de electroporate.
- Hemen gentamisin ile tamamlanmış olan önceden ısıtılmış (37 ° C) 'de hücreler komple ortam tekrar süspansiyon ve plaka100 mm tabak m.
- Gece boyunca 37 ° C,% 5 CO2 de transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin.
- Ertesi sabah, (fenol kırmızısı olmaksızın RPMI 1640, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol, 2 mM L-glutamin) serumsuz mikroskopi ortamı 10 ml tam orta yerine.
Kırmızı kan hücrelerinin 2. Opsonizasyon
Not: makrofajlar parçacık hedef bir model olarak, koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler) kullanılır. Genellikle, 35 mm cam alt tabak başına yaklaşık 7 x 10 6 SRBC'ler kullanılır.
- 1x PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) /0.1% BSA (sığır serum albümini) ve santrifüj (600 x g'de, 4 dakika), 100 ul SRBClere yıkayın.
- Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve 1 x 100 ul PBS /% 0.1 BSA ve santrifüj (600 x g'de, 4 dk) SRBClere tekrar süspansiyon.
- santrifüj sonrasında, süpernatantı atmak ve tavşan IgG anti-SRBClere 1x PBS /% 0.1 BSA SRBClere tekrar süspansiyonkonsantrasyonun alt-aglütinasyon. SRBClere antikor / 5 ul ihtiva eden çözeltinin 500 ul kullanın.
Not: antikorların alt aglütinasyon konsantrasyonu ağ oluşumu olduğu tespit aglütinasyon uyarmadı düşük konsantrasyona karşılık gelir. Genel olarak, alt aglütinasyon konsantrasyonu 8.2 ug / ml'dir.- Bir hemaglütinasyon testi ile SRBClere opsonize için gerekli IgG anti-SRBClere konsantrasyonunu belirlemek. Bir mikro-1 / 25,600 - seri olarak 1/50 ile (13.1 mg / ml stok) IgG SRBC'ler seyreltin. Her kuyuda 2 x 10 6 SRBClere ekleyin. Birkaç saat oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.
- yavaş dönüşü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 1x PBS içinde iki yıkama / yukarıda tarif edildiği gibi% 0.1 BSA sonra önceden ısıtılmış serum barındırmayan ortam içinde mikroskopi IgG opsonize SRBClere (IgG SRBC'ler) (2 mi / çanak) yeniden süspanse edin.
Lameller 3. Poli-lizin Kaplama
- Bu aradaOda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.01 poli-L-lizin, 2 ml 35 mm cam alt yemekler tedavi.
- 1x 2 ml PBS yemeklerin iki kez yıkayın.
Cam alt yemekleri üzerine SRBClere 4. Kovalent olmayan Fixation
- 35 mm cam alt çanak başına SRBC'ler süspansiyon 2 ml dökün.
- 35 mm cam alt yemekleri üzerine 2 dakika boyunca 500 xg'de bir sallanan rotor santrifüj.
- Süpernatantı ve 1 x PBS /% 10 BSA, 2 ml ile bir kez yıkanır.
- tabak başına 1 x PBS /% 10 BSA, 2 ml 30 dakika boyunca parçacıkları inkübe edin.
- 1x 2 ml PBS yemeklerin üç kez yıkayın.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C), serumsuz mikroskopi orta 2 ml 1 x PBS değiştirin.
5. Fagositoz TIRFM tarafından görüntülendi
- Mikroskop
Not: TIRFM bir yağ batırma objektifi (K 100 X, NA1.49), CO2 ile bir ısıtma odası ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve iki şarkıBir 1.5x lens ile birleştiğinde le foton algılama kameraları EMCCD (Elektron Çarpma Charge Coupled Device).- TIRF mikroskop oturumu önceki gün, mikroskop sahne homojen bir ısıtma sağlamak için 37 ° C'de ısıtma odasına açın.
- Kritik Açı tayini
Not: ImageJ Renk Profiler yazılım TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır.- mikroskop altında serum içermeyen mikroskobu ortamıyla opsonize SRBC içeren bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin.
- Hücreleri Pençe ve eklemeden önce orta onları tekrar süspansiyon - çanak (100 500 ul).
- mikroskop kontrol etmek ve 491 nm ve / veya floresan etiketli proteinleri ifade eden hücreleri belirlemek için bir 561 nm lazer ile uyarma yapmak için "canlı Toplama" yazılımı kullanın.
- floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücreyi tespit.
- alanın ortasına yerleştirin ve 500 im kazanmakFarklı açılarda bir uyarma dalga boyunda yaşları 0.01º (Şekil 2A) bir artış ile, 5º'lik kadar 0º itibaren. açıları otomatik mikroskop sistemi tarafından değiştirilir.
- olay ışık tamamen cam / orta arayüzü yansıyan sağlayan kritik açısını belirlemek ve kaybolan dalga üretir. ImageJ Renk Profiler yazılımı kullanarak, "Dosya" tıklayarak "Aç" görüntü sırası açın ve dosyayı seçin.
- Düzgün bir floresan (Şekil 2B sarı 1) ile hücrede, dikdörtgen aracı ile, faiz (ROI) bir bölge seçin.
- "Z ekseni profili" arsa (menü ve "Plot Z ekseni Profili" açılır "Resim" sekmesinde "Stacks" Şekil 2B tıklayarak x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile ROI ölçülen floresan yoğunluğu ortalama kırmızı 2).
Not: Kritik açı ma giden açısıdırfloresan keskin bir düşüşe önce ximum floresan. - Örnek 2.00 (Şekil 2C) gibi bir TIRF sinyali elde etmek mikroskopi oturumu sırasında kritik açıya üstün x ekseni üzerindeki açısının herhangi bir değer kullanın.
- Devralmalar
- Canlı Toplama yazılımı kullanarak, modül "Protokol Editor" (Şekil 3A) ile iktisap parametrelerini ayarlamak.
- TIRF bölgedeki ilgi proteinlerin floresan sinyal elde etmek "Çok Kanallar" edinimi oluşan bir "döngü" ile bir protokol oluşturun. (Örneğin 2.00) TIRF açısı, (Örnek 50 ms için) kalma süresi ve (örneğin,% 50) lazer yoğunluğu (Şekil 3B 1) girin.
- "Çok Kanallar" aracı ile Epifloresans sinyal edinimi elde etmek için TIRF bölgenin üstüne hedefi 3 mikron "Z hareket" tanıtmak. t altında bir açı girinO kritik açı (örneğin 1.00 gibi), fuar süresi (50 msn) ve lazer yoğunluğu (% 50) (Şekil 3B, 2 ve 3).
- Sonraki TIRF bölge (Şekil 3B 4) dönmek için, aşağıda amaç 3 mikron "z hareket" ekleyin. (Işık Yayan Diyot) (Şekil 3B 5) LED parlak ışıkta hücrenin bir "anlık" ekleyin.
- parçacık etrafında plazma zarı uzatarak SRBC fagositoz başlatır floresan takılı protein ifadesi orta seviyede ilgi bir hücreyi bulun.
- alanın ortasına yerleştirin.
- 1000 kare - 500 edinilmesini akışı başlar. "Döngü sayısı" sekmesinde, "750 kare" (Şekil 3B 1) girin.
Not: ImageJ Renk Profiler yazılım TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır. - tıklayarak Resim J yazılımında dizi görüntüleri açın"Aç" "Dosya" ve dosyayı seçerek.
- sekme "Image" butonuna tıklayarak kanalları ayırmak, "Hyperstacks" menüsü ve "Yığın hyperstack" fonksiyonu açılır. çıktı penceresini tamamlayın: Sipariş: xyctz; Kanal (C): kanal sayısı (örn: "2", iki fluorochromes varsa); Dilimler (z): z ekseninde dilim sayısı (örn: "1" z ekseninde hiçbir hareket yoksa); Çerçeveler (t): kanal sayısı başına bölünmüş görüntü sayısı; Ekran modu: Gri Tonlama.
Not: İki ayrı görüntü dizileri iki farklı kanallar karşılık, oluşturulur.
- Canlı Toplama yazılımı kullanarak, modül "Protokol Editor" (Şekil 3A) ile iktisap parametrelerini ayarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda tarif edilen deneysel sistem şematik olarak Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir floresan etiketi kaynaşık yararlı proteinleri eksprese eden transfekte RAW264.7 makrofaj kovalent olmayan bir şekilde tespit edildi IgG opsonize koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler) ile temas içine yerleştirilmektedir lamel. makrofajlar onu yutmak için lamel SRBC ayırabilirsiniz. kullanılan TIRF mikroskop 3 mikron yukarıda Z vardiyadan sonra Epifloresans modunda psödopod ve sinyallerin ipuçları karşılık TIRF alan sinyallerin eş zamanlı kazanılması mümkün.
Şekil 2'de bu plazma membranı altında 100 nm bölgeye temiz bir TIRF sinyal sağlar tarif edildiği gibi Şekil 3., Toplam iç yansıma flüoresans kritik açısını belirlemek için gereklidir acquisiti gelişimini temsil etmektedir"Protokol Editor" olarak adlandırılan bir modül aracılığıyla parametrelere Canlı Toplama yazılıma dahil. Bu modül kullanıcılar oluşturabilir ve onlar süreci yürütecek mikroskop, gönderilmeden önce iş akışlarını yönetmek için izin verir. satın alma sonunda, kullanıcı TIFF akışı toplar.
Şekil 4, örneğin, LifeAct mCherry Dr. Guillaume Montagnac Institut Curie, Paris, bir tür hediye, sonra üretilen plazmid (transfekte RAW264.7 makrofaj bir "fagosom kapak tahlilinde" temsili bir canlı hücre TIRFM filmi 17) aktin polimerizasyonu takip etmek. Makrofajlar geçici ifade plazmid lamel bağlı IgG SRBClere yutmak için izin verildi. psödopod uçları bir SRBC etrafında cam lamel apposed gibi, bir F-aktin halka TIRF alanında kapalı kadar giderek daralmış (üst panel) tespit edildi. Buna paralel olarak, bulanık F-aktinfagositik fincan dibinde depolymerization karşılık (alt panel) Yukarıdaki sahne 3 mikron değişen sonra Epifloresans tarafından tespit sinyalin. iletilen ışık (sağda panel) ile teyit edildiği gibi ediniminin 3 dakika sonra SRBC tamamen içselleştirilmiş edildi.
Bu nedenle, bu yöntem, uygun bir şekilde psödopod çok uçları ve fagositik bardak dibinde oluşan moleküler olaylar gerçekleşebilir moleküler olayları ayırt etmek için kullanılabilir.
Şekil TIRFM tarafından Analiz "fagozomun Kapatma Assay" 1. şematik gösterimi. fagosom kapak deney geçici bir ya da iki floresan etiketli-proteini eksprese eden makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilir. Makrofajlar kovalent olmayan poli-lizin COA sabit IgG opsonize SRBClere üzerine yatırılırted lamelleri. Görüntüler fagositik fincan tabanını tespit etmek fagosom kapanması ve Epifloresans modunda siteyi tespit etmek için TIRF modunda kaydedilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: TIRFM Kritik Açı belirlenmesi. (A) "Canlı edinimi" kullanarak, floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücre (kırmızı bölge 1) alanın ortasında yer alıyor. TIRF Stack seçenekte, görüntüler farklı açılar 0.01 ° (kırmızı bölge 2) bir artış ile, 5 ° 'ye kadar 0 ° den başlayan, bir uyarma dalga boyunda elde edildi. (B) görüntü dizisi ImageJ kullanarak açılır Renkli Profiler yazılımı ve Ar ortalama floresan yoğunluğuÇevrede egion (YG) "Yığınlar" ve "Plötz ekseni profili" (kırmızı bölge 1) kullanılarak x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile çizilir. (C) arsa üzerinde floresan zirve x pozisyonu tekabül kritik açı: 1.98 ° (siyah noktalı çizgi). Bu açıdan sonra herhangi bir değer kullanılabilir. Bir örnek olarak, 2.00 ° (kırmızı çizgi) seçilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Canlı Toplama Modülü kullanılarak Şekil 3. İş Akışı Süreci: "Protokol Düzenleyici". (A) "Protokol Editor" penceresinde, bir iş akışı tuval oluşturulur. (B) Bu protokol mikroskop karar sayısını tekrar edeceği eylemlerin "döngü" oluşurKullanıcı tarafından. Örnek olarak: 750 (1). Bir döngü dahil: TIRF modunda ilgi floresan proteinleri lazer uyarma ile "Çoklu kanal" satın alma. Örnek olarak: Lazer 491 nm yoğunluğu% 50 -TIRF açısı 2.00 (2); amacın "Z hareket" 3 mikron (3); Epifloresans modunda "Çok Kanallar" satın alma (4); Geri TIRF bölgesi (5) ve iletilen ışık (6) bir "Snapshot" hedefiyle "Z hareket". Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. F-aktin geçici plazmid LifeAct mCherry (Dr. Guillaume Mo bir tür hediye ifade RAW264.7 makrofajlar kullanılarak gerçekleştirildi fagozomun Kapatma. Fagozomun kapatma testinin yerinde bir Noktası olarak Birikmiş edilirntagnac, 17 sonra üretilen Institut Curie, Paris). plazmid sinyali TIRF alanı (üstte) ve Epifloresans modu (alt) satın alındı. kırmızı ok ucu TIRF bölgesinde aktin birikimini gösterir. 3 dakika iletilen ışık görüntü, içselleştirilmiş SRBC belirten sunulmuştur. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1:. O geçici plazmid ifade RAW264.7 makrofajlar kullanılarak gerçekleştirildi fagositik Kupası fagozomun kapatma testinin Base Cleared ise F-aktin, psödopod ve İpuçları ve fagozomun Kapanış Sitesinde Birikmiş edilir. TIRFM kullanılarak plazmid TIRF alanı (üstte) görüntüleme ve Epifloresans modunda (alt) alternatif yapıldıly 37 ° C'de 3 dakika boyunca her 50 milisaniye. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
