Introduction
Phagozytose ist eine wichtige Zellfunktionen, die mit der Erkennungs beginnt und die Bindung von Material an Oberflächenrezeptoren, die dann führt zur Internalisierung und Degradation des aufgenommenen Materials. Während einzelliger Eukaryonten, wie die Form Dictyostelium discoideum und Amöben für Fütterung auf Bakterien Phagozytose verwenden, haben höhere Organismen mit professionellen Zellen entwickelt. Makrophagen oder dendritischen Zellen sind die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger in verschiedenen Geweben und Organen und sind entscheidend für die adaptive Immunsystem durch Antigenpräsentation und Zytokin - Produktion 1-4 zu aktivieren. Unter bestimmten Umständen können die Phagozytose von nicht-professionellen Phagozyten durchgeführt werden, zum Beispiel Endothel- und Epithelzellen. Dieser Prozess ist wichtig für die normale Gewebeumsatz und Umbau Homöostase während der Entwicklung und im Erwachsenenalter zu halten. Schließlich spezialisierte Fresszellen wie Sertoli-Zellen in den Hoden oder retinalenPigment - Epithelzellen sind extrem potente Phagozyten 5.
Die Bildung eines phagosome wo Abbau von Mikroorganismen oder Zellabfall auftritt beginnt mit der Clusterung von phagozytischen Rezeptoren auf der Oberfläche der phagozytischen Zelle. Downstream Signalereignisse folgende Häufung von opsonischen Rezeptoren wie Fc-Rezeptoren (FcR) oder Komplement-Rezeptoren (CRs) wurden gut charakterisiert. Allerdings gibt es auch zahlreiche nicht-opsonischen Rezeptoren, einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), Lektine, Mannose-Rezeptoren und Scavenger-Rezeptoren. Diese Rezeptoren erkennen Determinanten auf der Partikeloberfläche , wie beispielsweise Mannose oder Fucose - Reste, Phosphatidylserin und Lipopolysaccharide 1,6-9.
Pathogen oder Zelltrümmer Anerkennung beinhaltet die Bindung an und Clustering von mehreren Arten von phagozytischen Rezeptor, der dann zu intensiv und vorübergehende Aktin-Umbildung führen. Parallel dazu Brenn Exozytose von intrazellulären ABTEILUNGts trägt zur Freisetzung von Membranspannung und ist für eine effiziente Phagozytose von großen Teilchen wichtig. Die Signalereignisse zu Aktin-Polymerisation und Membranverformung führen, wurden in experimentellen Modellen seziert, die einen einzelnen phagozytischen Rezeptor ausgelöst. Während FcR-vermittelte Phagozytose, gibt es intensive Aktin-Polymerisation, die von kleinen GTPasen (Rac, Cdc42) geregelt wird. Unter ihren nachgeschalteten Effektoren führt das Wiskott-Aldrich - Syndrom - Protein (WASP) zur Aktivierung des Actin-Related Protein 2/3 Komplex (Arp2 / 3) , die Aktinfilamente 1,2,4,10 nukleiert. Die lokale Produktion von Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) ist von entscheidender Bedeutung für die anfängliche Aktin - Polymerisation , die pseudopod Bildung antreibt. Die Umstellung auf PI (3,4,5) P 3 ist für pseudopod Verlängerung und phagosome Verschluss 11 erforderlich. Mehrere Wege beitragen 2 zum Verschwinden von PI (4,5) P. Zum einen Ablösung von Phosphatidylinositol Phosphat Kinases (PIPKIs) von der phagosome Verhaftungen PI (4,5) P2 - Synthese. Zweitens kann es nach Klasse phosphoryliert und verbraucht werden , ich PI3K - Kinasen (PI3K) und in PI (3,4,5) P 3 12 umgewandelt. Eine Rolle für Phosphatasen und Phospholipasen hat auch in PI (4,5) P 2 Hydrolyse und F-Actin - Entfernung während der Phagozytose in Säugerzellen und in Dictyostelium 13,14 angedeutet worden. Die Phospholipase C (PLC) δ hydrolisiert PI (4,5) P 2 in Diacylglycerin und Inositol-1,4,5- Tris - Phosphat. Die PI (4,5) P2 und PI (3,4,5) P 3 Phosphatase OCRL (Lowe-Syndrom Lowe) wurde ebenfalls in phagosome Bildung in Verbindung gebracht. Präzise lokale Bildung von F-Actin und seine Depolymerisation fest in Raum und Zeit geregelt wird, und wir haben gezeigt, dass die Rekrutierung von intrazellulären Kompartimenten gezeigt ist wichtig, lokal die OCRL Phosphatase zu liefern, was zu einer lokalen Aktin Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse beitragen Der Mechanismus und die molekularen Spieler für phagosome Schließung und Membran scission erforderlich bleiben schlecht wegen der Schwierigkeiten, definiert bei der Visualisierung und Überwachung der Website von phagosome Schließung. Bis vor kurzem wurde die Phagozytose auf festen oder lebenden Zellen beobachtet, die Teilchen auf ihrer Rückenfläche internalisieren oder auf ihren Seiten, so dass die rechtzeitige Visualisierung des Standortes von phagosome Schließung schwierig. Darüber hinaus Befestigungsmethoden könnten Rückzug von Membranen und Vorspannung bewirken, dass die Ergebnisse auf Pseudopodien Erweiterung und Schließung. Dagegen ist der Test, den wir eingerichtet haben und beschreiben hier können wir pseudopod Erweiterung und die Schließung Schritt der Phagozytose in lebenden Zellen 13, bezogen auf die gesamte interne Reflexion Mikroskopie (TIRFM) 16 sichtbar zu machen. Diese optische Technik verwendet eine abklingende Welle Fluorophore in einem dünnen Bereich zwischen einer transparenten an der Grenzfläche anzuregen, soDeckel (Deckglas) und eine Flüssigkeit (Zellkulturmedium). Die Dicke der Anregungstiefe beträgt etwa 100 nm von der festen Oberfläche, so dass die Visualisierung von molekularen Ereignissen nahe an der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, und begrenzt die out-of-focus-Fluoreszenz und die Cytotoxizität aufgrund Beleuchtung der Zellen. Ausnutzend TIRFM, entwickelten wir das "phagosome Verschluss assay" in dem Deckgläschen mit Poly-Lysin aktiviert werden und dann beschichtet mit IgG-opsonisiertes roten Blutzellen (IgG-SRBCs). Makrophagen transient fluoreszierend markierten Proteine von Interesse exprimieren, werden dann die IgG-SRBCs zu versenken erlaubt. Während Zellen, die die Zielpartikel lösen, die nicht-kovalent an die Glasoberfläche sind, können die Spitzen der Pseudopodien beobachtet und in den TIRF-Modus aufgezeichnet werden. TIRF Akquisitionen mit Akquisitionen im Epifluoreszenz-Modus kombiniert, nach der Stufe 3 um oben verlagert, was die vis erlaubtualization der Basis des phagozytischen Tasse. Zugabe von pharmakologischen Wirkstoffen wie diejenigen, Actin oder dynamin während des Prozesses Hemmen ist auch möglich, das Verfahren weiter auf molekularer Ebene zu sezieren. Das Protokoll im Detail hier beschrieben ist, für eine RAW264.7 murine Makrophagenzelllinie und opsonierten Partikel, aber praktisch kann es auf andere phagozytische Zelle und mit anderen Zielen, wie beispielsweise Kügelchen angepasst werden. Diese Methode wird eine bessere Charakterisierung der Regelung in Zeit und Raum der molekularen Spieler in pseudopod Erweiterung und phagosome Schließung während verschiedener phagozytischen Prozessen beteiligt zu ermöglichen.
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Protocol
Hinweis: Das verwendete Plasmid LifeAct-mCherry ist ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17.
1. Zellen und Transfektion
Anmerkung: RAW264.7 Makrophagen sind sub Konfluenz in komplettem Medium gezüchtet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10% FCS ( Kalbsfetusserum)) in einer 100-mm-Platte. Sie werden mit Plasmiden transfiziert durch Elektroporation fluoreszent markierte Proteine kodieren. Routinemßig etwa 5 - 6 x 10 6 Zellen mit 20 ug oder 10 ug Plasmid für jede Transfektion oder Co-Transfektion bzw. transfiziert sind. Man beachte, dass andere Mittel zur Transfektion beruhen auf Elektroporation oder Lipofektion als alternative Ansätze verwendet werden.
- Abkratzen der Zellen mit einem Zellheber und resuspendieren sie in 10 ml Kulturmedium durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
- zentrifugieren Sie dieZellsuspension 300 · g, 5 min bei RT in Schwenkwinkel Rotor.
- Vorwärmtemperatur 10 ml komplettem Medium mit 10 & mgr; g / ml Gentamicin bei 37 ° C ergänzt.
- Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und das Pellet in 3 ml "Waschpuffer A" aus der Elektroporation Kit.
- Zentrifugieren der Zellsuspension 300 · g, 5 min bei Raumtemperatur in Schwenkwinkel Rotor.
- In der Zwischenzeit die DNA - Mischung bei Raumtemperatur hergestellt: 120 ul 2x Puffer B, 20 ug Plasmid - DNA , codierend für das Protein von Interesse, qsp 240 & mgr; l H 2 O.
- Nach der Zentrifugation verwerfen die gesamte Überstand.
- Zellpellet in der DNA-Mischung und Transfer in 4 mm Elektroporationsküvetten.
- 3 min bei RT inkubieren.
- Elektroporation bei 250 V, 900 uF.
- Resuspendieren sofort die Zellen in der vorgewärmten (37 ° C) komplettes Medium mit Gentamicin ergänzt und die Platte derm in einer 100 mm-Schale.
- Inkubieren der transfizierten Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Am nächsten Morgen, ersetzen Sie das komplette Medium mit 10 ml Serum-freien Mikroskopie Medium (RPMI 1640 ohne Phenolrot, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin).
2. Opsonisierung von roten Blutkörperchen
Hinweis: Als Modell der Partikel Ziel für Makrophagen, rote Blutkörperchen vom Schaf (SRBCs) verwendet werden. Normalerweise etwa 7 x 10 6 SRBCs pro 35 mm Glasbodenschale verwendet.
- Waschen Sie die SRBCs mit 100 ul 1x PBS (phosphate buffered saline) /0.1% BSA (Rinderserumalbumin) und Zentrifuge (600 · g, 4 min).
- Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Resuspendieren der SRBCs in 100 ul 1x PBS / 0,1% BSA und Zentrifuge (600 × g, 4 min).
- Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und resuspendieren SRBCs in 1x PBS / 0,1% BSA mit Kaninchen-IgG-anti-SRBCsbei Unter agglutinierende Konzentration. Verwenden Sie 500 ul einer Lösung, die Antikörper / 5 ul SRBCs.
Anmerkung: Die Teil agglutinierende Konzentration von Antikörpern gegen die niedrigste Konzentration entspricht, die keine Agglutination als Bildung eines Netzwerks erkannt induzierte. Im Allgemeinen ist die Unter agglutinierende Konzentration beträgt 8,2 & mgr; g / ml.- Bestimmen Sie die Konzentration von IgG-Anti-SRBCs erforderlich, um die SRBCs durch einen Hämagglutinations-Test opsonisieren. Serienmäßig wird die IgG verdünnen anti-SRBCs (Lager bei 13,1 mg / ml) zwischen 1/50 - 1 / 25.600 in einer Mikrotiterplatte. Fügen Sie 2 x 10 6 SRBCs in jeder Vertiefung. Die Platte im Dunkeln bei RT für mehrere Stunden.
- bei RT inkubieren 30 Minuten mit langsamer Rotation.
- Nach zweimaligem Waschen in 1x PBS / 0,1% BSA wie oben beschrieben, Resuspendieren der IgG-opsonisiertes SRBCs (IgG-SRBCs) in vorgewärmten serumfreien Mikroskopie Medium (2 ml / Schale).
3. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser
- In der Zwischenzeitbehandeln, 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml 0,01% Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Teller zweimal mit 2 ml 1x PBS.
4. Nicht-kovalente Fixierung von SRBCs auf Glasboden Geschirr
- Gießen 2 ml SRBCs Suspension pro 35 mm Glasbodenschale.
- Zentrifuge mit einem schwingend Rotor bei 500 · g während 2 min auf 35 mm Glasbodenschalen.
- Entfernen Sie den Überstand und wäscht einmal mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA.
- Inkubieren der Teilchen für 30 min mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA pro Schale.
- Waschen Sie die Teller dreimal mit 2 ml 1x PBS.
- Ersetzen 1x PBS mit 2 ml vorgewärmtes (37 ° C) serumfreien Medium Mikroskopie.
5. Phagozytose Visualisierte von TIRFM
- Mikroskop
Hinweis: TIRFM wurde durchgeführt unter Verwendung eines Mikroskops ausgestattet mit einer Öl-Immersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), einer Heizkammer mit CO 2, und zwei singenle Photonenerfassungskameras EMCCD (Elektronenvervielfachungs Charge Coupled Device), gekoppelt mit einer Linse 1,5X.- Am Tag vor der TIRF-Mikroskop-Sitzung, schalten Sie die Heizkammer bei 37 ° C eine homogene Erwärmung des Mikroskoptisch zu ermöglichen.
- Kritische Winkelbestimmung
Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird.- Legen Sie eine 35 mm Glasbodenschale mit opsonisierter SRBC mit Serum-freiem Medium Mikroskopie unter dem Mikroskop.
- Abkratzen der Zellen und Resuspendieren sie in dem Medium vor ihnen Zugabe (100-500 ul) in die Schüssel.
- Verwenden Sie die "Live Acquisition" Software, um das Mikroskop steuern und durchführen Anregung mit einem 491 nm und / oder einem 561-nm-Laser zu identifizieren Zellen fluoreszenz markierte Proteine exprimiert.
- Identifizieren Sie eine Zelle, die die fluoreszenz markierte Proteine exprimiert.
- Legen Sie es in der Mitte des Feldes und erwerben 500 imAlter bei einer Anregungswellenlänge, mit verschiedenen Winkeln von 0 ° bis 5 °, mit einer Zunahme von 0,01 ° (2A) zu starten. Die Winkel werden automatisch durch das Mikroskopsystem verändert.
- Bestimmen den kritischen Winkel so dass das einfallende Licht vollständig an der Glas / Medium-Schnittstelle und Erzeugen der abklingenden Welle reflektiert zu werden. Mit ImageJ Color Profiler Software, öffnen Sie die Bildsequenz, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" und wählen Sie die Datei.
- Wählen Sie eine Region of Interest (ROI), mit dem rechteckigen Werkzeug, in der Zelle mit einer einheitlichen Fluoreszenz (2B gelb 1).
- Zeichnen Sie die "Z - Achse - Profil" mittlere Fluoreszenzintensität in der ROI mit der Funktion der Winkel auf der x - Achse gemessen , indem Sie auf Registerkarte "Bild", "Stapel" in der Drop - Down - Menü und "Plot Z-Achse Profile" (2B rot 2).
Hinweis: Der kritische Winkel ist der Winkel zur ma führendenxim Fluoreszenz vor einer scharfen Abnahme der Fluoreszenz. - Verwenden einen beliebigen Wert des Winkels auf der x-Achse überlegen dem kritischen Winkel während der Mikroskopie Sitzung ein TIRF - Signal als Beispiel 2.00 (2C) zu erhalten.
- Acquisitions
- Verwendung von Live - Acquisition - Software, die Parameter des Erwerbs mit dem Modul "Protocol Editor" (3A) auf.
- Erstellen Sie ein Protokoll mit einer "Schleife" umfassend "Multi Channels" Erwerb Fluoreszenzsignal von Proteinen von Interesse in der TIRF Region zu erwerben. Geben Sie den TIRF Winkel (zum Beispiel 2,00), die Belichtungszeit (beispielsweise 50 msec) und die Laserintensität (beispielsweise 50%) (3B 1).
- Einführung eines "Z move" des Objektivs 3 & mgr; m über dem TIRF Bereich Signalerfassung in Epifluoreszenz mit dem "Multi Channels" Werkzeug zu erhalten. Geben Sie einen Winkel unter ter kritischen Winkel (wie beispielsweise 1,00), die Zeit der Exposition (50 msec) und die Laserintensität (50%) (3B, 2 und 3).
- Als nächstes fügen unten , um ein "z move" des Objektivs 3 & mgr; m, in der TIRF - Bereich (3B 4) zurückzukehren. Fügen Sie einen "Schnappschuss" der Zelle , in helles Licht LED (Light-Emitting Diode) (3B 5).
- Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einem moderaten Niveau von fluoreszenz markierte Protein-Expression, die durch die Verlängerung der Plasmamembran um das Teilchen Phagozytose von SRBC initiiert.
- Legen Sie es in der Mitte des Feldes.
- Starten Sie Streaming-Akquisition von 500 - 1.000 Frames. In der "Schleifenzählung", geben Sie "750 Frames" (3B 1).
Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird. - Öffnen Sie die Sequenz Bilder in Bild J-Software, indem Sie auf"Datei", "Öffnen" und die Datei auswählen.
- Trennen Sie die Kanäle durch einen Klick auf die Registerkarte "Bild", "Hyperstacks" Drop-Down-Menü und auf "Stack zu Hyperstack" -Funktion. Füllen Sie das Fenster erschienen: Bestellen: xyctz; Channel (c): Anzahl der Kanäle (ex: "2", wenn Sie zwei Fluorochrome); Scheiben (z): Anzahl der Schichten in der Z-Achse (ex: "1", wenn es keine Bewegung in der Z-Achse); Frames (t): Anzahl der Bilder pro Anzahl der Kanäle geteilt; Anzeigemodus: Graustufen.
Anmerkung: Zwei getrennte Bildsequenzen erzeugt werden, entsprechend den zwei verschiedenen Kanälen.
- Verwendung von Live - Acquisition - Software, die Parameter des Erwerbs mit dem Modul "Protocol Editor" (3A) auf.
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Representative Results
Das experimentelle System in diesem Manuskript beschrieben ist, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Transfizierte RAW264.7 Makrophagen , die Proteine von Interesse zu einem fluoreszierenden Tag fusioniert exprimiert in Kontakt gebracht werden mit IgG-opsonisiertes roten Schafsblutzellen (SRBCs) , die waren nicht-kovalent fixierten auf dem Deckglas. Die Makrophagen können die SRBC aus dem Deckglas lösen sie zu verschlingen. Das Mikroskop verwendet TIRF ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Signalen aus dem Bereich TIRF zu den Spitzen der Pseudopodien und Signale in dem Epifluoreszenz-Modus entspricht, nach einer Verschiebung Z 3 um oben.
Es ist wesentlich , den kritischen Winkel für innere Totalreflexion Fluoreszenz zu bestimmen , wie in Abbildung 2 beschrieben Dies gewährleistet eine saubere TIRF - Signal von einem 100 nm Bereich unter der Plasmamembran. 3 stellt die Entwicklung der acquisitiauf Parameter durch ein Modul "Protocol Editor", die in der Live-Acquisition-Software genannt. Dieses Modul ermöglicht es Benutzern, Workflows zu erstellen und zu verwalten, bevor sie an das Mikroskop gesendet werden, die den Prozess ausgeführt wird. Am Ende des Erfassungs sammelt der Benutzer eine TIFF-Stream.
Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Live-Zelle TIRFM Film eines "phagosome Verschlusstest" in RAW264.7 Makrophagen , die mit dem Plasmid transfiziert (zB LifeAct-mCherry, ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17) an die Aktin - Polymerisation folgen. Makrophagen transient exprimierenden Plasmid wurden erlaubt IgG-SRBCs auf das Deckglas gebunden zu verschlingen. Da die Spitzen der Pseudopodien zu dem Deckglas um ein SRBC apposed wurden, ein F-Actin-Ring wurde in der TIRF-Bereich (oben), die schrittweise verengt erkannt, bis es geschlossen. Parallel dazu die verschwommen F-ActinSignal durch Epifluoreszenz erkannt, nachdem die Stufe 3 um oben (unten) entsprach Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse verschieben. Nach 3 min des Erwerbs wurde die SRBC völlig verinnerlicht, wie mit Durchlicht (Panel auf der rechten Seite) bestätigt.
Daher kann dieses Verfahren verwendet werden, um richtig die molekularen Ereignisse unterscheiden, die stattfinden an den äußersten Enden der Pseudopodien und die molekularen Ereignisse an der Basis des phagozytischen Tasse auftritt.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der "Phagosomen Closure Assay" Analysierte durch TIRFM. Der phagosome Schließung Assay wird Makrophagen transient unter Verwendung exprimieren ein oder zwei fluoreszierend markiert-Protein. Makrophagen sind auf IgG-opsonisierter SRBCs nicht-kovalent fixiert auf Poly-Lysin coa hinterlegtted Deckgläser. Die Bilder werden in TIRF - Modus aufgenommen wurden die Website von phagosome Schließung und in Epifluoreszenz - Modus zu erfassen , die Basis des phagozytischen Tasse zu erkennen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Bestimmung des kritischen Winkels für TIRFM. (A) Mit "Live Erwerb", eine Zelle fluoreszierend markierten Proteine exprimiert , wird in der Mitte des Feldes (Region 1 in rot) platziert. Mit der TIRF Stapel Option Bilder wurden bei einer Anregungswellenlänge erfasst, mit verschiedenen Winkeln von 0 ° bis 5 beginnend ° mit einer Schrittweite von 0,01 ° (Bereich 2 in rot). (B) Die Sequenz von Bildern geöffnet wird mit ImageJ Color Profiler Software und die mittlere Fluoreszenzintensität von aregion of Interest (ROI) mit Funktion der Winkel auf der x - Achse mit "Stacks" und "Plötz Achsprofil" (Region 1 in rot) dargestellt. (C) Die x - Position der Spitze der Fluoreszenz auf dem Grundstück entspricht der kritische Winkel: 1.98 ° (schwarz gestrichelte Linie). Jeder Wert nach diesem Winkel verwendet werden. Als Beispiel können 2,00 ° (rote Linie) gewählt werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Workflow - Prozess unter Verwendung von Live - Acquisition - Modul: "Protocol Editor". (A) Im "Protokoll - Editor" Fenster, ein Workflow - Leinwand erzeugt wird. (B) Dieses Protokoll umfasst einen "Loop" von Aktionen, die das Mikroskop die Anzahl der Male wiederholen wird entschiedendurch den Benutzer. Als Beispiel: 750 (1). Eine Schleife eingeschlossen: "Multi-Kanäle" Erfassung mit Laseranregung von fluoreszierenden Proteine von Interesse in TIRF-Modus. Als Beispiel: Laser 491 nm Intensität 50% -TIRF Winkel 2.00 (2); "Z move" des Objektivs 3 & mgr; m (3); "Multi Channels" Akquisition im Epifluoreszenz-Modus (4); "Z move" von dem Ziel zurück zu dem TIRF Bereich (5) und einen "Snapshot" im Durchlicht (6). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. F-Actin als ein Punkt an der Stelle der Phagosomen Kumulierte Verschluss. Phagosomen Schließung Assay wurde unter Verwendung von RAW264.7 Makrophagen vorübergehend das Plasmid LifeAct-mCherry (ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Mo ausdrückenntagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17). Das Plasmid-Signal wurde in TIRF-Bereich (oben) und in Epifluoreszenz-Modus (unten) erworben. Die rote Pfeilspitze zeigt die Aktin-Anreicherung in der TIRF-Region. Durchlichtbild bei 3 min vorgestellt, die einen inneren SRBC anzeigt. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: F-Actin in den Spitzen der Pseudopodien und an der Stelle der Phagosomen Closure Kumulierte, während es von der Basis des Phagozytische Cup Phagosomen Verschlusstest wurde durchgeführt , Gelöscht wird unter Verwendung von RAW264.7 Makrophagen exprimiert vorübergehend das Plasmid.. Plasmid-Bildgebung in TIRF-Bereich (oben) und in Epifluoreszenz-Modus (unten) mit der TIRFM wurde Alternative durchgeführtly alle 50 ms während 3 Minuten bei 37 ° C. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
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