Introduction
Fagocytos är en stor cellfunktion som börjar med igenkänning och bindning av material till ytreceptorer, som sedan leder till internalisering och nedbrytning av intagna materialet. Medan encelliga eukaryoter såsom form Dictyostelium discoideum och amöbor använder fagocytos för livnär sig på bakterier, har högre organismer utvecklats med professionella celler. Makrofager eller dendritiska celler är den första försvarslinjen mot patogener i olika vävnader och organ, och är avgörande för att aktivera det adaptiva immunsystemet genom antigenpresentation och cytokinproduktion 1-4. Under vissa omständigheter kan utföras fagocytos av icke-professionella fagocytiska celler, t ex endotelceller och epitelceller. Denna process är viktigt att upprätthålla homeostas under utvecklingen och i vuxen ålder för normal vävnadsomsättning och ombyggnad. Slutligen, specialiserade fagocyter såsom Sertoliceller i testiklarna eller retinalpigmentepitelceller är extremt potenta fagocyter 5.
Bildandet av en phagosome där nedbrytning av mikroorganismer eller cellrester sker börjar med kluster av fagocytiska receptorer på ytan av den fagocytiska cellen. Nedströms signaleringshändelser efter klustring av opsoniska receptorer såsom Fc-receptorer (FcR) eller kompletterar receptorer (CRS) har karakteriserats väl. Men det finns också många icke-opsoniska receptorer inklusive Toll-liknande receptorer (TLRs), lektiner, mannosreceptorer och renhållare receptorer. Dessa receptorer känner igen determinanter på partikelytan såsom mannos eller fukosrester, fosfatidylserin, och lipopolysackarider 1,6-9.
Patogen eller celldebris erkännande innebär bindning till och klustring av flera typer av fagocytisk receptor, som sedan leder till intensiv och övergående aktin ombyggnad. Parallellt, fokal exocytos av intracellulärt compartments bidrar till frisättning av membranspänningen och är viktig för effektiv fagocytos av stora partiklar. Signalerings händelser som leder till aktin polymerisation och membran deformation dissekerades i experimentella modeller som utlöste en enda fagocytisk receptor. Under FcR-medierad fagocytos, det finns en stark aktin polymerisation som regleras av små GTPaser (Rac, Cdc42). Bland deras nedströms effektorer, den Wiskott-Aldrichs syndrom protein (WASP) leder till aktivering av Actin-Related Protein 2/3 komplex (Arp2 / 3) som nucleates aktinfilament 1,2,4,10. Lokal produktion av fosfatidylinositol-4, 5-bisfosfat (PI (4,5) P2) är avgörande för inledande aktin polymerisation som driver pseudopod bildning. Dess omvandling till PI (3,4,5) P3 krävs för pseudopod förlängning och phagosome stängning 11. Flera vägar bidrar till försvinnandet av PI (4,5) P2. För det första lösgörande av fosfatidylinositol fosfat kinaSES (PIPKIs) från phagosome anhållanden PI (4,5) P2-syntes. För det andra kan det fosforyleras och konsumeras av klass I PI3K kinaser (PI3K) och omvandlas i PI (3,4,5) P3 12. En roll för fosfataser och fosfolipaser har också antytts i PI (4,5) P2 hydrolys och F-aktin avlägsnas under fagocytos i däggdjursceller och i Dictyostelium 13,14. Fosfolipas C (PLC) δ hydrolyserar PI (4,5) P2 till diacylglycerol och inositol-1,4,5- tris fosfat. PI (4,5) P2 och PI (3,4,5) P3 fosfatas OCRL (oculocerebrorenal syndrom av Lowe) har också implicerats i phagosome bildning. Exakt lokal bildning av F-aktin och dess depolymerisation är hårt reglerad i tid och rum och vi har visat att rekrytering av intracellulära fack är viktigt att leverera lokalt OCRL fosfatas, vilket bidrar till lokala aktin depolymerisation vid basen av den fagocytiska cup Spelarna mekanism och molekylära krävs för phagosome stängning och membran klyvning förblir dåligt definierade på grund av svårigheterna att visualisera och övervaka platsen för phagosome stängning. Tills nyligen var fagocytos observeras på fasta eller levande celler som internaliserar partiklar på sin rygg ansiktet eller på deras sidor, vilket gör tid visualisering av platsen för phagosome stängning svårt. Dessutom kan fästmetoder orsaka indragning av membran och partiskhet resultaten på pseudopodia förlängning och stängning. Däremot analysen som vi har satt upp och beskriver här tillåter oss att visualisera pseudopod förlängning och avslutande steget i fagocytos i levande celler 13, baserat på total inre reflektion mikroskopi (TIRFM) 16. Denna optiska tekniken använder en försvinnande våg för att excitera fluoroforer i en tunn yta vid gränsytan mellan en transparent sålock (täck) och en vätska (cellodlingsmedium). Tjockleken hos den exciteringsdjupet är cirka 100 nm från den fasta ytan, vilket möjliggör visualisering av molekylära händelser som ligger nära plasmamembranet. TIRFM tillåter en hög signal-till-bakgrundsförhållandet och begränsar out-of-fokus fluorescens samlas och cytotoxicitet på grund av belysning av celler. Med utnyttjande av TIRFM, utvecklade vi "phagosome stängning analys", i vilken täck aktiveras med poly-lysin och sedan belagda med IgG-opsoniserad röda blodkroppar (IgG-SRBC). Makrofager som uttrycker transient fluorescerande taggade proteiner av intresse tillåts sedan att uppsluka IgG-SRBC. Medan celler skilja av målpartiklar som är icke-kovalent bundet till glasytan, kan observeras spetsarna på pseudopods och registreras i TIRF-läge. TIRF förvärv kombinerat med förvärv i epifluorescence läge, efter att flytta steg 3 pm ovan, som gör det möjligt att visualization av basen av den fagocytiska koppen. Tillsättning av farmakologiska läkemedel såsom de inhiberande aktin eller dynamin under processen är också möjligt att ytterligare dissekera processen på molekylär nivå. Det protokoll som beskrivits i detalj här är för en RAW264.7 murin makrofagcellinje och opsoniserade partiklar, men i stort sett, kan den anpassas till varje annan fagocytisk cell och med andra mål såsom pärlor. Denna metod kommer att möjliggöra bättre karakterisering av förordningen i tid och rum av de molekylära aktörerna i pseudopod förlängning och phagosome stängning under olika fagocytiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs! Plasmid som används Lifeact-mCherry är en vänlig gåva från Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereras efter 17.
1. Celler och transfektion
Notera: RAW264.7 makrofager odlas till sub konfluens i komplett medium (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 50 ^ M β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin och 10% FCS ( fetalt kalvserum)) i en 100 mm platta. De transfekteras med plasmider som kodar för fluorescerande märkta proteiner genom elektroporering. Rutinmässigt ca 5-6 x 10 6 celler transfekteras med 20 | j, g eller 10 | ig av plasmid för varje transfektion eller samtransfektion respektive. Observera att andra medel för transfektion bygger på elektroporering eller lipofektion kan användas som alternativa metoder.
- Skrapa cellerna med en celllyftare och återsuspendera dem i 10 ml odlingsmedium genom pipettering upp och ned flera gånger.
- Centrifugeracellsuspensionen 300 xg, 5 min vid RT i svängvinkelrotor.
- Förvärmningszonen 10 ml komplett medium kompletterat med 10 | ig / ml av gentamicin vid 37 ° C.
- Efter centrifugering, kasta supernatanten och suspendera pelleten i 3 ml "tvättbuffert A" från den elektro satsen.
- Centrifugera cellsuspensionen 300 xg, 5 minuter vid rumstemperatur i svängvinkelrotor.
- Under tiden förbereda DNA mix vid rumstemperatur: 120 | j, l 2x buffert B, 20 ^ g av plasmid-DNA som kodar för proteinet av intresse, qsp 240 | j, l H2O
- Efter centrifugering, kasta hela supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i DNA mix och överför till 4 mm elektroporation kyvetter.
- Inkubera vid RT i 3 min.
- Electroporate på 250 V, 900 | iF.
- Omedelbart resuspendera cellerna i förvärmda (37 ° C) komplett medium kompletterat med gentamicin och plattan im i en 100 mm skål.
- Inkubera de transfekterade cellerna över natt vid 37 ° C, 5% CO2.
- Nästa morgon, ersätta det kompletta mediet med 10 ml serumfritt mikroskopi-medium (RPMI 1640 utan fenolrött, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 50 iM β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin).
2. opsonisering av röda blodkroppar
Obs: Som en modell av partikel mål för makrofager, är röda blodkroppar (SRBC) som används. Vanligtvis är cirka 7 x 10 6 SRBC per 35 mm glas nedre skålen används.
- Tvätta SRBC med 100 pl av 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) /0.1% BSA (bovint serumalbumin) och centrifugera (600 xg, 4 min).
- Efter centrifugering, kasta supernatanten och suspendera SRBC i 100 pl 1 x PBS / 0,1% BSA och centrifugera (600 xg, 4 min).
- Efter centrifugering, kasta supernatanten och suspendera SRBC i 1x PBS / 0,1% BSA med kanin IgG anti-SRBCpå sub-agglutinerande koncentration. Använd 500 pl lösning innehållande antikropp / 5 pl av SRBC.
Obs: Under agglutinerande koncentration av antikroppar motsvarar den lägsta koncentrationen som inte framkallar agglutination detekteras som bildandet av ett nätverk. I allmänhet är den sub-agglutinerande koncentration 8,2 | ig / ml.- Bestäm koncentrationen av IgG anti-SRBC som krävs för att opsonisera de SRBC av en hemagglutination test. Seriellt späda IgG anti-SRBC (lager på 13,1 mg / ml) mellan 1/50 - 1 / 25,600 i en mikro. Tillsätt 2 x 10 6 SRBC i varje brunn. Inkubera plattan i mörker vid RT under flera timmar.
- Inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter med långsam rotation.
- Efter två tvättar i 1 x PBS / 0,1% BSA, såsom beskrivits ovan, återsuspendera-IgG-opsoniserade SRBC (IgG-SRBC) i förvärmda serumfria mikroskopi-medium (2 ml / skål).
3. Poly-lysin Beläggning av Täck
- Sålänge, Behandla 35 mm glas botten rätter med 2 ml 0,01% poly-L-lysin under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Diska två gånger med 2 ml 1 x PBS.
4. Icke-kovalent Fixering av SRBC på Glass Bottom rätter
- Häll 2 ml SRBC suspension per 35 mm glas nedre skålen.
- Centrifugera med en svängande rotor vid 500 xg under 2 minuter på 35 mm glas botten rätter.
- Avlägsna supernatanten och tvätta en gång med 2 ml av 1 x PBS / 10% BSA.
- Inkubera partiklarna under 30 min med 2 ml av 1 x PBS / 10% BSA per skål.
- Diska tre gånger med 2 ml 1 x PBS.
- Ersätta 1x PBS med 2 ml förvärmd (37 ° C) serumfritt mikroskopi medium.
5. Fagocytos visualiseras genom TIRFM
- Mikroskop
Notera: TIRFM utfördes med användning av ett mikroskop utrustat med en oljeimmersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), en värmekammare med CO2, och två sjungale fotondetekterings kameror EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) i kombination med en 1.5X lins.- Dagen före TIRF mikroskop session slå på värmeskåp vid 37 ° C för att möjliggöra en homogen uppvärmning av mikroskop scenen.
- Kritisk vinkel Bestämning
Obs: ImageJ Color Profiler programvara används för att behandla TIRF bildströmmar.- Placera en 35 mm glas nedre skålen innehållande opsoniserad SRBC med serumfritt mikroskopi medium under mikroskop.
- Skrapa cellerna och resuspendera dem i mediet innan du lägger dem (100-500 l) i skålen.
- Använd programvaran "Live Acquisition" för att styra mikroskopet och utföra excitation med en 491 nm och / eller en 561 nm laser för att identifiera celler som uttrycker fluorescerande taggade proteiner.
- Identifiera en cell som uttrycker fluorescerande märkta proteiner.
- Placera den i mitten av fältet och förvärva 500 imåldrar på en excitationsvåglängd, med olika vinklar med start från 0 ° upp till 5º, med en ökning på 0.01º (Figur 2A). Vinklarna automatiskt ändras av mikroskopsystemet.
- Bestämma den kritiska vinkeln tillåter det infallande ljuset att vara helt reflekteras vid glas / mediet gränssnitt och skapa den evanescenta vågen. Använda ImageJ Color Profiler programvara, öppna bildsekvensen genom att klicka på "File", "Open" och välj filen.
- Välja en region av intresse (ROI), med den rektangulära verktyg, i cellen med en likformig fluorescens (figur 2B gul 1).
- Rita "Z-axeln profil" betyder fluorescensintensitet mätt i ROI med funktionen av vinklarna på x-axeln genom att klicka på "Bild" fliken "staplar" i rullgardinsmenyn och "Plot Z-axeln Profile" (Figur 2B röd 2).
Obs: Den kritiska vinkeln är den vinkel som leder till maximum fluorescens innan en kraftig minskning av fluorescens. - Använda vilken värdet av vinkeln på x-axeln överlägsen den kritiska vinkeln under mikroskopi sessionen för att erhålla en TIRF signal såsom exempelvis 2,00 (Figur 2C).
- förvärv
- Använda Live Acquisition programvara, ställa in parametrarna för förvärv med modulen "Protocol Editor" (figur 3A).
- Skapa ett protokoll med en "loop" innefattande "Multi Channels" förvärv att förvärva fluorescenssignal från proteiner av intresse i TIRF regionen. Komma in i TIRF vinkel (t ex 2,00), exponeringstiden (t ex 50 ms) och laserintensitet (t ex 50%) (Figur 3B en).
- Införa ett "Z move" av målet 3 mikrometer över TIRF regionen för att få signal förvärv i epifluorescence med "Multi Channels" verktyg. Ange en vinkel under than kritiska vinkeln (som exempel 1,00), tiden för utläggning (50 msek) och laserintensiteten (50%) (Figur 3B, 2 och 3).
- Lägg sedan till en "z move" av målet 3 um nedan för att återgå i TIRF regionen (Figur 3B 4). Lägg till en "ögonblicksbild" av cellen i starkt ljus LED (lysdiod) (Figur 3B 5).
- Hitta en cell av intresse med en måttlig nivå av fluorescensmärkta proteinuttryck som initierar fagocytos av SRBC genom att förlänga plasmamembran runt partikeln.
- Placera den i mitten av fältet.
- Börja strömma förvärv av 500 - 1000 ramar. I "loop count" fliken, ange "750 ramar" (Figur 3B en).
Obs: ImageJ Color Profiler programvara används för att behandla TIRF bildströmmar. - Öppna sekvensbilder i Image J programvara genom att klicka på"File", "Open" och välja filen.
- Separera kanalerna genom att klicka på fliken "Image", "Hyperstacks" rullgardinsmenyn och "Stack till Hypers" -funktion. Slutföra dök fönstret: Order: xyctz; Kanal (c): antal kanaler (ex: "2" om du har två fluorokromer); Skivor (z): antal skivor i Z-axeln (ex: "1" om det inte finns någon rörelse i z-axeln); Ramar (t): antal bilder fördelade per antal kanaler; Visningsläge: Gråskala.
Obs: Två separata bildsekvenser genereras, motsvarande de två olika kanaler.
- Använda Live Acquisition programvara, ställa in parametrarna för förvärv med modulen "Protocol Editor" (figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella systemet som beskrivs i detta manuskript är schematiskt representerad i figur 1. Transfekterade RAW264.7 makrofager som uttrycker proteiner av intresse smält till en fluorescerande tagg är placerade i kontakt med IgG-opsoniserad röda blodceller (SRBC) som var icke-kovalent fast på täckglas. Makrofagerna kan lösgöra SRBC från täck att uppsluka den. TIRF mikroskop som används tillåter samtidig förvärv av signaler från TIRF området motsvarar spetsarna på pseudopods och signaler i epifluorescence läge efter en Z skift 3 um ovan.
Det är väsentligt att fastställa den kritiska vinkeln för total intern reflektion fluorescens, såsom beskrivs i Figur 2. Detta säkerställer en ren TIRF signal från en 100 nm området under plasmamembranet. Figur 3 representerar utvecklingen av acquisitipå parametrar via en modul som kallas "protokoll Editor" ingår i Live förvärv programvara. Denna modul gör det möjligt för användare att skapa och hantera arbetsflöden innan de skickas till mikroskop, som kommer att utföra arbetet. Vid slutet av förvärvet, samlar användaren en TIFF ström.
Figur 4 visar en representativ live-cell TIRFM filmen en "phagosome stängning analys" i RAW264.7 makrofager transfekterade med plasmiden (t.ex. Lifeact-mCherry, en vänlig gåva från Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereras efter 17) för att följa aktin polymerisation. Makrofager transient uttryckande plasmid tilläts att uppsluka IgG-SRBC bundna till täck. Som spetsarna på pseudopods ades apposed till glaset täckglas runt en SRBC gjordes en F-aktin ringen detekteras i TIRF området (övre panelen) som successivt minskat tills den stängd. Parallellt suddiga F-aktinsignalen som detekteras av epifluorescence efter skifta steg 3 pm ovan (nedre panelen) motsvarade depolymerisation vid basen av den fagocytiska koppen. Efter tre minuter av förvärv, var SRBC helt internaliseras, vilket bekräftas med genomlysning (panelen till höger).
Därför kan denna metod användas för att korrekt särskilja de molekylära händelser som äger rum i de ändar pseudopods och de molekylära händelser som inträffar vid basen av den fagocytiska koppen.
Figur 1. Schematisk representation av "Phagosome Stängning Assay" Analyzed by TIRFM. Den phagosome stängning analysen utförs med hjälp av makrofager transient uttrycker en eller två fluorescens taggade protein. Makrofager deponeras på IgG-opsoniserad SRBC icke-kovalent fixerade på poly-lysin coated täckglas. Bilderna lagras i TIRF läge för att upptäcka platsen för phagosome stängning och i epifluorescence läge för att upptäcka basen av fagocytiska koppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fastställande av den kritiska vinkeln för TIRFM. (A) Använda "Live förvärv", är en cell som uttrycker fluorescerande märkta proteiner placeras i mitten av fältet (region 1 i rött). Med alternativet TIRF Stack ades bilder förvärvades en excitationsvåglängd, med olika vinklar med start från 0 ° upp till 5 °, med en ökning på 0,01 ° (region 2 i rött). (B) Sekvensen av bilder öppnas med hjälp av ImageJ color Profiler programvara och den genomsnittliga fluorescensintensiteten av arEgion av intresse (ROI) plottas med funktion av vinklarna på x-axeln med hjälp av "Stacks" och "Plotz axeln profil" (region 1 i rött). (C) X-position toppen av fluorescens på tomten motsvarar den kritiska vinkeln: 1,98 ° (svart streckad linje). Något värde efter denna vinkel kan användas. Som ett exempel kan 2,00 ° väljas (röd linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. arbetsflöde med Live Acquisition Module: "Protokoll Editor". (A) I "protokollet Editor" fönster, är ett arbetsflöde duk skapas. (B) Detta protokoll består av en "Loop" av åtgärder som mikroskopet kommer att upprepa många gånger beslutatav användaren. Som ett exempel: 750 (1). En slinga ingår: "Multi Channels" förvärv med laser excitation av fluorescerande proteiner av intresse i TIRF läge. Som exempel: Laser 491 nm intensitet 50% -TIRF vinkel 2,00 (2); "Z flytta" av målet 3 pm (3); "Multi Channels" förvärv i epifluorescence läge (4); "Z flytta" av målet tillbaka till TIRF regionen (5) och en "ögonblicksbild" i genomlysning (6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. F-aktin ackumuleras som en punkt på platsen för Phagosome Stängning. Phagosome stängning utfördes med hjälp av RAW264.7 makrofager transient uttrycker plasmiden Lifeact-mCherry (en vänlig gåva från Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereras efter 17). Plasmiden signal förvärvades i TIRF området (överst) och i epifluorescence läge (botten). Den röda pilspets indikerar aktin ansamling i TIRF regionen. Fallande ljus bild på tre minuter visas, vilket indikerar en internaliserad SRBC. Skala bar, 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: F-aktin ackumuleras i Tips i Pseudopods och på platsen för Phagosome Stängning, medan den tas bort från basen av fagocyterande Cup Phagosome stängning utfördes med hjälp av RAW264.7 makrofager transient uttrycker plasmiden.. Plasmid avbildning i TIRF området (överst) och i epifluorescence läge (botten) med användning av TIRFM utfördes alternativly var 50 msek under 3 minuter vid 37 ° C. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
