Summary
Adipose-derived stamceller (ASCs) är enkelt isolerade och skördas från fettet av normala råttor. ASC lakan kan skapas med cellagret teknik och kan transplanteras till Zucker diabetiska feta råttor uppvisar fullhudsskador hud defekter med utsatt ben och sedan täckt med en lipidens av konstgjord hud.
Abstract
Konstgjord hud har uppnått betydande terapeutiska resultat i klinisk praxis. Konstgjord hudbehandlingar för sår hos diabetespatienter med hämmas blodflödet eller med stora sår kan dock förlängas. Cellbaserade terapier har dykt upp som en ny teknik för behandling av diabetiska sår och cellagret teknik har förbättrat effekten av stamcellstransplantation. Ett antal rapporter har föreslagit att adipose-derived stamceller (ASCs), en typ av mesenkymala stromaceller celler (MSC), uppvisar terapeutisk potential på grund av deras relativa överflöd i fettväv och deras tillgänglighet för samling jämfört med MSCs från andra vävnader. Därför verkar ASCs vara en bra källa av stamceller för terapeutiska användning. I denna studie skapats ASC ark från epididymal fett fett normala Lewis råttor har med hjälp av temperatur-lyhörd kultur rätter och normalt odlingsmedium som innehåller askorbinsyra. ASC arken transplanterade i Zucker diabetiker fettsyror (ZDF) råttor, en råtta modell av typ 2-diabetes och fetma, som uppvisar minskad sårläkning. Ett sår skapades på den bakre kraniala ytan, ASC ark transplanterades in i såret och en lipidens konstgjord hud användes för att täcka arken. ZDF råttor som fick ASC ark hade bättre sårläkning än ZDF råttor utan transplantation av ASC ark. Detta tillvägagångssätt var begränsad eftersom ASC ark är känsliga för torra förhållanden, som kräver underhåll av en fuktig såret miljö. Därför användes konstgjord hud att täcka ASC plåten för att förhindra uttorkning. Allogenic transplantation av ASC ark i kombination med konstgjord hud kan också tillämpas på andra svårbehandlade sår eller brännskador, såsom dem som observerats med perifer arteriell sjukdom och kollagen sjukdom, och kan ges till patienter som är undernärda eller använder steroider. Denna behandling kan således vara ett första steg mot att förbättra de terapeutiska alternativ för diabetiker sår läkning.
Introduction
Befolkningen av diabetiker ökar världen över och nått 400 miljoner i 20151. uppskattningsvis 15-25% av patienter med diabetes riskerar från utvecklingen av en lägre-extremitet diabetiska sår2. Nedre-extremitet diabetiska sår är svårbehandlad och kan behöva terapeutisk återkoppla med rehabiliteringsträning efter fullständig återhämtning. En lång terapi-period ofta resulterar i en betydande minskning av patientens livskvalitet. Nya terapier som minska eller förhindra försämringen måste således utvecklas för behandling av diabetiska sår. Utvärdera diabetiker sårläkning, vi optimerat en diabetiker sår sårläkning modell hos råttor som härmar praktiska kliniska tillstånd, och utvärderas om omplantering adipose-derived stamceller (ASC) blad med cellagret engineering accelererad sårläkning.
Mesenkymala stromaceller (MSCs) uppvisar en utmärkt potential för att påskynda sårläkning på grund av deras självförnyelse, deras immunmodulerande effekter, och deras förmåga att differentieras till olika cell härstamningar3. ASCs är en typ av MSC härrör från fettvävnad, och de uppvisar flera fördelar över MSCs härrör från andra vävnader, inklusive deras angiogena potentiella och parakrin verksamhet4,5. Fettvävnad är relativt rikligt i den mänskliga kroppen och dess tillgänglighet möjliggör samling med minimalt invasiva ingrepp. ASCs har därför använts experimentellt för sårläkning program6,7.
Tidigare rapporter har visat att de direkt injektionen av encelliga MSC suspensioner i områden runt sår kan påskynda sårläkning8,9. Trots rapporter om accelerationen av sårläkning i diabetiska sår modeller efter injektionen med encelliga suspensioner, är överlevnadstiden för transplanterade celler på sårområdet dock inte klart.
I denna studie tillämpat vi cellagret teknik med hjälp av temperatur-lyhörd kultur rätter. Dessa rätter har den temperatur-lyhörd polymer N- isopropylacrylamide kovalent bundna till sin yta10. Den ympade polymerskikt möjliggör temperaturreglerade celladhesion till eller lossnar från ytan av kultur skålen. Ytan av skålen blir hydrofoba vid 37 ° C, vilket gör att cellerna att följa och föröka, medan celler lossna spontant från ytan när det blir hydrofil vid temperaturer under 32 ° C. Odlade celler kan skördas som en sammanhängande cellagret med intakt cell till cell i korsningar och extracellulära matriser (ECMs) helt enkelt genom att minska temperaturen; proteolytiska enzymer som skada ECM, såsom trypsin, är således inte krävs11. Cellagret teknik kan därför bevara cell till cell-anslutningar och förbättra effekten av stamcellstransplantation.
Dessutom, ökar cellagret transplantation cell överlevnaden jämfört med cell injektionen12. I detta protokoll valdes Zucker diabetiska feta (ZDF) råttor som typ 2 diabetes och fetma modell med fördröjd sårläkning. ZDF råttor utvecklar spontant fetma på cirka 4 veckor. De sedan utveckla typ 2-diabetes med övervikt mellan 8 och 12 veckors ålder, vid vilket tillfälle de uppvisar hyperglykemi är associerad med insulin resistens, dyslipidemi och hypertriglyceridemi13. Fördröjd sårläkning, minskat blodflöde i perifera blodkärl och diabetesnefropati observeras också14,15,16. ZDF råttor kan dessutom vara en lämplig modell för att studera läkning av svårlösta kutana sår, såsom diabetiska sår.
Skillnaderna mellan människa och gnagare i sårläkning mekanismer är associerade med anatomiska skillnader i huden. Sårläkning i normala råttor är baserad på såret kontraktion, medan sårläkning hos människa är baserat på återepitelisation och granulationsvävnad bildas. Normalt såret skenor används i gnagare modeller hjälper till att minimera såret kontraktion och möjliggör gradvis bildningen av granulationsvävnad17, även om såren i korttidsstudier råttor är nästan helt stängd genom sammandragning. Dock diabetiker sår kontraktion i ZDF råttor är nedsatt och sårläkning främst sker genom återepitelisation och granulationsvävnad bildas; denna process är således mer liknar mänskliga sårläkning14.
Diabetiska sår med utsatt ben efter debridering påträffas ofta kliniskt. Tidigare studier har undersökt 12-mm diameter fullhudsskador hudsår på ryggen av atymiska naken möss18,19 och 10 mm diameter fullhudsskador hudsår på ryggen av normala möss20. För att utveckla en klinisk modell för svår diabetiska sår, större (15 x 10 mm2) fullhudsskador hud defekter med exponerade ben och utan periostet skapades, som tidigare beskrivits21, hos råttor med typ 2-diabetes och fetma.
Rat ASC (rASC) ark från ASCs normala Lewis råttor skapades genom prövningar transplantation av ASC ark. I klinisk praxis är autolog transplantation omöjligt eftersom diabetiker med sår ofta uppvisar svåra diabeteskomplikationer, såsom okontrollerad höga blodsockernivåer och högt body mass index och dessa komplikationer orsakar sårläkning sjukdomar som ökar svårigheten att få fettvävnad från dessa patienter. Dessutom ASCs från djur med diabetes uppvisar ändrat egenskaper och nedsatt funktion22. Därför beskriver protokollet presenteras här prövningar transplantation av rASC ark från normala råttor och tillämpningen av konstgjord hud på diabetiska råttor.
Lipidens konstgjorda huden används i detta protokoll förhindrar den spontan kontraktion av såren, främjar syntesen av en ny bindväv matris och liknar den sanna dermis23. I detta protokoll, konstgjord hud placeras på en rASC blad och fast med nylontrådar att förhindra sår kontraktion eller utvidgningen som härrör från lös råtta hud. Dessutom konstgjorda huden ger en tredimensionell ram för ASC arken, upprätthåller en fuktig miljö för de transplanterade ASC ark och sår och skyddar såren från infektion och yttre krafter. Slutligen, placeras ett icke-vidhäftande förband över såret att skydda den från yttre påverkan, upprätthålla en fuktig såret miljö och absorberar exsudat.
En rASC ark är tunna, flexibla och deformerbar och kan följas till flytta mottagaren platser, såsom ett bultande hjärta24. Cellagret teknik har använts för återuppbyggnaden av olika vävnader och kan generera läkande effekter25,26. ASC-ark som uppvisar kliniska terapeutisk potential kan påskynda läkning av många typer av sår. Dessutom allogen transplantation av ASC ark, kombinerat med användningen av konstgjord hud, kan vara tillämplig på behandling av svårbehandlad sår eller brännskador, såsom de som observerades i perifer arteriell sjukdom eller kollagen sjukdom, eller de kan administreras till patienter som är undernärda eller använder steroider. Detta tillvägagångssätt ökar effektiviteten av omplantering ASCs. Sårläkning ZDF råtta modellen producerar en svår sår tillstånd som liknar mänskliga sårläkningsprocessen och härmar kliniska tillstånd i en små experimentella djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll försökte upprätta en ny cell-baserad terapi för svårbemästrade diabetiska sår. Kort (som illustreras i figur 1), allogen rASC ark skapades från normala råttor cellagret engineering och transplanterades sedan med en lipidens av konstgjord hud på en fullhudsskador hud defekt på en diabetiker råtta. Ljusmikroskop bilder av ett bra exempel på en rASC ark (figur 2A) och ett dåligt exempel på ett rASC-ark (figur 2B) visas i figur 2. När ASCs är pläterade på en ny maträtt som kultur, bör skålen vara långsamt rockade fram och tillbaka och vänster och höger i en inkubator att uppnå enhetliga rASC sådd och ett enhetligt tjock rASC ark (figur 2A). Om rASCs inte kan vara jämnt fäst och odlade på ytan av kultur skålen, bladet inte kan samlas in som ett sammanhängande ASC ark (figur 2B). Figur 3 visar ASC ark som har skördats som en sammanhängande cellagret i rumstemperatur eftersom ASCs bifogades enhetligt maträtt ytan. Vanligtvis, kan rASC ark hanteras med ett par pincett. Om nödvändigt, en överföring membran kan användas för att överföra en cellagret från kultur skålen till sårområdet, till exempel om är cellagret skör och bräcklig.
Figur 4 illustrerar ZDF råttor används som en diabetiker sårläkning modell och transplantation av allogena rASC ark kombinerat med konstgjord hud. Ett rASC blad är mjuka och flexibla, justerbara i storlek och kan utvidgas till varje hörn av sårområdet med ett par pincett (Figur 4A-F). RASC-täckta defekten var också täckt med konstgjord hud (15 x 10 mm2) och sys med cirka 10 maskor med en 5-0 nylon sutur (figur 4 g). För att skydda såret, en fuktig såret miljö bibehölls och exudat absorberas, ett icke-vidhäftande förband (20 x 15 mm2) placerades över konstgjorda huden och 5-0 nylon suturer tillämpades (figur 4I). Icke-självhäftande förbandet avlägsnas ofta av ZDF råttorna inom flera dagar efter ansökan. Därför måste råttorna övervakas efter transplantation. Vanligtvis, byts icke-självhäftande förbandet varannan dag under narkos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De makroskopiska fotografierna i figur 5 är representativa resultaten av transplantation av ett rASC blad. I vår tidigare studie var den genomsnittliga sårområdet i gruppen rASC ark transplantation (figur 5B) betydligt mindre än i kontrollgruppen (figur 5A). För kontroller användes endast konstgjord hud att täcka såret, utan transplantation av ett rASC blad. Dessa bilder togs den 14: e dagen efter skapandet av såret (n = 6 i varje grupp)31.
Figur 1: Schematisk av förfarandet experimentella Transplantation. Schematisk bild av det experimentella transplantation förfarandet utförs med en allogen råtta adipose-derived stamceller (rASC) ark och konstgjord hud i en råtta sårläkning modell av typ 2-diabetes och fetma. (A) råtta fett vävnad var kirurgiskt utskurna från normala Lewis råttor. rASCs var isolerade och seedade på en 60 cm2 kultur maträtt och odlade vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 7-8 dagar. (B) rASCs var subkultiveras varje 2-3 dagar, och passagen 3 rASCs var seedad på en 35 mm diameter temperatur-lyhörd kultur maträtt. Cellerna odlades i komplett medium innehållande 16,4 µg/mL L-ascorbic syra fosfat magnesium salt n-hydrat (AA) vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 7-8 dagar. RASCs skördades som ett sammanhängande rASC ark genom att minska temperaturen till 20 ° C. (C) rASC ark transplanteras till en 15 x 10 mm2 fullhudsskador hud defekt med utsatt ben på huvudet på råttor uppvisar diabetes och fetma (Zucker diabetiska feta (ZDF) råttor) används som en sårläkning modell. (D) en rASC ark var placeras på skallen direkt över defekten och täckt) med en 15 x 10 mm2 ark lipidens konstgjord hud, som var sys in i rum med 10 nylon (5-0) suturer. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; med tillstånd. Diabetes (c) copyright (2015) genom American Diabetes Association. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ljus mikroskopbilder av ASCs. Ljusmikroskop bilder av ASC spridning till kanten av kultur rätter, utan luckor mellan ASCs. (A) en rASC ark med en enhetlig tjocklek i alla riktningar 7 dagar efter starten av odling (A). (B) ett rASC blad utan enhetlig sådd. Ett sammanhängande rASC blad inte kan erhållas på dag 7 efter starten av odling (B). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Time-lapse bilder av rASC ark statyer i rumstemperatur. Time-lapse bilder av status för en rASC ark i rumstemperatur. rASCs på en 35 mm diameter temperatur-lyhörd kultur maträtt spontant och successivt fristående från skålen ytan vid rumstemperatur (cirka 20 ° C) och skördats som ett sammanhängande ark. (A) ca 5 min efter flytten temperatur-lyhörd kultur skålen till rumstemperatur. (B) ca 10 min efter flytten 35 mm diameter temperatur-lyhörd kultur skålen till rumstemperatur. (C) cirka 20-30 min efter flytten temperatur-lyhörd kultur skålen till rumstemperatur. Detta är ett bra rASC blad (C). (D-E) rASC ark status cirka 20-30 min efter flytten temperatur-lyhörd kultur skålen till rumstemperatur. Detta rASC blad är av genomsnittlig kvalitet (D). (F-G) rASC ark hanteras oftast med ett par pincett. Om cellagret är spröda och sköra, kan ett membran användas som en byggnadsställning för att överföra cellagret från kultur skålen till sårområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tidsserier bilder av såret skapelsen och rASC ark Transplantation med konstgjord hud och icke-häftande förband
Tid serie bilder av såret skapande och rASC ark transplantation med konstgjord hud och icke-vidhäftande förband. (A) huvuden av ZDF råttor var rakad med en rakapparat. Efter rakning kroppshår, drogs markeringar (15 x 10 mm2) med en fet hydrofoba penna. (B) en fullhudsskador hud defekt (15 x 10 mm2) skapades på huvudet av en sövda ZDF råtta genom att ta bort kutan vävnad från epidermis till periostet. Hud och kutan vävnad var utskurna med en skalpell, och periostet avlägsnades med en periosteal raspatorium. Med gasväv fuktad med steril koksaltlösning, tillämpades påtryckningar för att stoppa blödningen efter excision. (C) rASC ark transplantation. En rASC ark placerades över felet omedelbart ovanför skallen av råtta med ett par pincett. (D-G) Justera rASC ark förlängning att matcha såret storlek. RASC arket är flexibla, justerbara, och kan förlängas till varje hörn av sårområdet med hjälp av ett par pincett. För större sår, kan två eller tre flexibla rASC ark staplas. (H) suturering konstgjorda huden som täcker rASC arket. Defekten och bladet transplanterade rASC täcktes med konstgjord hud (15 x 10 mm2), som var sys med 10 maskor med 5-0 nylon suturer. (jag) Suturing av den icke-vidhäftande förband (20 x 15 mm2) till sårområdet täckt med konstgjord hud. För att skydda såret, placerades icke-vidhäftande förband (20 x 15 mm2) över konstgjorda huden med 5-0 nylon suturer. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; med tillstånd. Diabetes (c) copyright (2015) genom American Diabetes Association. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: makroskopisk bilder av fullhudsskador hud defekter. Makroskopiska fotografier av fullhudsskador hud defekter utan transplantation av en rASC ark (A) och med transplantation av en rASC ark (B) 14 dagar efter skapandet av såret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste stegen för framgångsrikt odla en rASC ark är följande: 1) temperatur skall hållas vid ca 37 ° C under odling på de temperatur-lyhörda kultur rätterna. Under skapandet av en rASC ark, varje förfarande utfördes på en 37 ° C thermo-tallrik, och varje reagens värmdes till 37 ° C att förhindra celler från spontant ta loss från skålen31. (2) mottagaren ZDF råttorna måste övervakas för att förhindra borttagning av icke-häftande dressing, vilket är avgörande för framgångsrik transplantation av rASC ark. Om förbandet avlägsnas, måste ett nytt icke-vidhäftande förband tillämpas för att förhindra att transplanterade ASC arken lossa från sårområdet.
Med den här proceduren, erhölls rASC ark allmänhet inom 5-7 dagar efter sådd passage 3 celler på temperatur-lyhörd kultur rätter. Kulturtid att generera en rASC ark kan justeras enligt första cell densiteten och den tid då komplett odlingssubstratet som innehåller AA är tillämpas. Om en rASC plåt lossnar från skålen under cell odling, bladet rASC bör vara omgjord och ytterligare rätter bör förberedas vid cell avlossning.
Begränsningarna i detta protokoll är följande: 1) strikt temperaturhantering måste tillämpas för att behålla en ungefärlig temperatur av 37 ° C under hela processen när du använder temperatur-lyhörd kultur rätter. (2) efter att få ett rASC blad, måste speciella medicinska enheter användas för att upprätthålla fuktiga förhållanden, eftersom bladet rASC är känslig för torra förhållanden. (3) postoperativ hantering, inklusive daglig observation av villkora av mottagarens råtta, krävs.
Större sår med utsatt ben är ofta observerats kliniskt. Exempelvis kan trafik olycka trauma, brännskador, infekterade sår och skadad eller nekrotiska sår efter debridering utvecklas till stora sår med utsatt ben. Här, utvecklades en klinisk modell av svåra sår med en stor, fullhudsskador hud defekt med utsatt ben hos råttor med typ 2-diabetes och fetma. Denna modell har potential att användas som en standardmodell för att utvärdera sårläkning i diabetiska råttor.
Konstgjord hud är en kommersiellt tillgänglig medicinsk enhet för fullhudsskador hud defekter efter debridering och rekombinant basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) har använts för sårläkning för att främja angiogenes och granulering. Dessa två behandlingar har använts för att uppnå betydande terapeutiska resultat, även för kroniska sår, såsom diabetiska sår. Det har rapporterats att ASCs utsöndrar angiogeneic tillväxtfaktorer28, såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) och bFGF, som kunde bidra till kärlnybildning29,30 och påskynda sårläkning. Vår tidigare studie bekräftade att ASCs kontinuerligt utsöndrar dessa tillväxtfaktorer31. Därför ASC ark, kombinerat med konstgjord hud, har potential att användas som nya behandlingsalternativ för att påskynda vaskularisering och sårläkning31, och dessa ark kan vara tillämplig på behandling av många typer av svårbehandlade sår eller brännskador i mänskliga kliniska inställningar i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Följande författare avslöja ekonomiska förhållanden relevanta för denna publikation: Teruo Okano är grundare och styrelseledamot av Cell utsäde Inc., som licensierar teknik och patent från Tokyo Women's Medical University, och Teruo Okano och Masayuki Yamato är intressenter i Cell utsäde Inc. Tokyo Women's Medical University får forskningsmedel från Cell utsäde Inc. De andra författarna förklarar att de inte har finansiella förhållanden relevanta för denna publikation.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Yukiko Koga av institutionen av plast och rekonstruktiv kirurgi, Juntendo University School of Medicine, för att ge praktiska råd. Vi tackar också Mr Hidekazu Murata diabetes Center i Tokyo Women's Medical University School of Medicine för utmärkt teknisk support. Denna studie stöddes av skapandet av Innovation Centers för avancerade tvärvetenskapliga områden forskningsprogram av projekt för utvecklingsländerna innovationssystem ”Cell ark Tissue Engineering Center (CSTEC)” från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) av Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60 cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
