Summary
Dit artikel presenteert een methode voor de detectie en kwantificering van organische zuren uit plantaardig materiaal met behulp van gratis zonale capillaire elektroforese. Een voorbeeld van de mogelijke toepassing van deze methode bepalen van de effecten van een tweede gisting op organische zuurgraad in koffiezaden is voorzien.
Abstract
Carbonzuren zijn organische zuren die één of meer eindstandige carboxyl (COOH) functionele groepen. Kortketenige carbonzuren (SCCAs; carbonzuren met 3-6 koolstofatomen), zoals citraat malaat en zijn essentieel voor de goede werking van vele biologische systemen, waarbij ze functioneren cellulaire ademhaling en kunnen als indicatoren van celgezondheid dienen. In voedingsmiddelen, kan het gehalte aan organische zuren significante invloed op de smaak, met een verhoogde SCCA niveaus resulteert in een zure of "zure" smaak. Hierdoor werkwijzen voor de snelle analyse van organische zuurgraad van bijzonder belang voor de voedings- en drankenindustrie. Helaas zijn de meeste methoden voor SCCA kwantificering afhankelijk zijn tijdrovend protocollen die de derivatisering van monsters met gevaarlijke reagentia, gevolgd door kostbare chromatografische en / of massaspectrometrische analyses. Deze methode Gegevens van een alternatieve methode voor de detectie en kwantificering van organic zuren uit plantmateriaal levensmiddelenmonsters behulp vrije zonale capillaire elektroforese (CZE), soms eenvoudig aangeduid als capillaire elektroforese (CE). CZE levert een rendabele werkwijze voor het meten SCCAs met een lage detectielimiet (0,005 mg / ml). Dit artikel beschrijft de extractie en kwantificering van SCCAs uit plantaardige monsters. Terwijl de methode gericht op metingen van SCCAs van koffiebonen, kan de methode worden toegepast om meerdere plantaardige voedselmaterialen.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Assembleren monsters voor korte keten carbonzuur (SCCA) extractie. Bereid 1,0 g koffie zaad per keer dat voldoende monster na verwerking blijven garanderen.
- Als monsters werden bevroren voorafgaand aan het maalproces, houden het weefsel bevroren hele verwerking vries / dooi schade en sample oxidatie te voorkomen. Verwijder het monster uit de vriezer of sub-zero opslag alleen nodig voor het slijpen.
- Flash bevriezen verse monsters in vloeibare stikstof onmiddellijk voorafgaand aan proeven slijpen. Handling monster flash freeze monsters minimaliseren door ze in een mortier voorgevuld met vloeibare stikstof.
- Analyseer vloeibare monsters onmiddellijk na generatie, of flash-vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -20 ° C of -80 ° C tot analyse. Voorafgaand aan de analyse, verwijderen ingevroren monsters uit de opslag en laat ontdooien. Voor vloeibare monsters ga dan naar stap (3.5) voor de verwerking.
- slijtage voorkomendsende persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas) voordat u gaat werken met vloeibare stikstof.
- Triple-grind weefselmonsters aan een gelijkmatig fijn poeder (dat wil zeggen, van een uniforme deeltjesgrootte) in vloeibare stikstof met behulp van een keramische mortier en een stamper.
Opmerking: Het bereiken van een uniforme deeltjesgrootte essentieel is voor het maximaliseren SCCA afzuigniveau.- Pre-koel de mortier en stamper met vloeibare stikstof voorafgaande aan de toevoeging van het monster. Houd de mortel gevuld met een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof als het monster wordt toegevoegd.
- Met behulp van een pollepel, voeg genoeg vloeibare stikstof om de mortel aan het monster volledig onder te dompelen.
- Voeg gemakkelijk gemalen monsters, zoals bladeren of gebrande koffie, de vloeibare stikstof en plet met een draaiende beweging slijpen. Begin monsters vermalen wanneer de vloeibare stikstof niveau is afgenomen tot het punt waar het nauwelijks bedekt de monsters.
- Voeg moeilijk monsters dergelijke malens ruwe koffie zaden, vloeibare stikstof en hen in staat stellen te bevriezen gedurende 10-30 sec (of tot de vloeibare stikstof stopt krachtig kokend) vóór het wordt vermalen. Breek het weefsel in kleinere fragmenten met behulp van een verticale beweging verpletteren, en vervolgens compleet weefsel slijpen met behulp van een cirkelvormige beweging slijpen.
- Herhaal stappen 1.3.2-1.3.4 tweemaal, zodat de monsters in totaal driemaal gemalen. Kenmerkend zullen drie opeenvolgende ronden van vermalen monsters te beperken tot een poeder met een bloem-achtige consistentie.
- Indien een bloem consistentie niet wordt bereikt, herhaal stappen 1.3.2-1.3.4 tot monsters worden tot een poeder uniform kleine deeltjesgrootte (extractie efficiëntie is omgekeerd evenredig met de deeltjesgrootte).
- Transfer poeder aan glazen flesjes of 1,5 ml microcentrifugebuizen. Initiëren downstream processing onmiddellijk na het slijpen (aanbevolen), of monsters op te slaan bij -80 ºC tot monsters zijn klaar voor extractie.
- Als monsters moeten worden bewaard alvorensanalyse gesplitst monster in porties 500 mg (of 500 ul aliquots voor vloeibare monsters) en verdeeld over meerdere buizen voor opslag. Vermijd het onderwerpen van monsters aan herhaalde vries / dooi cycli, omdat deze sample samenstelling kan veranderen en een negatieve invloed op de toekomstige sample metingen.
2. Biologische Acid Standard Voorbereiding
- Monteer authentieke normen voor het SCCAs van belang. Deze zullen worden gebruikt om externe en interne standaardoplossingen maken die bepalen SCCA concentraties. Voor koffiestaaltjes omvatten citroenzuur, appelzuur, azijnzuur en melkzuur zuren plaats en adipinezuur als interne standaard.
- Ervoor zorgen dat de interne standaard geselecteerde niet van nature in het monster wordt gevonden, en dat de norm niet co-elueren met andere pieken van het monster profiel.
- Run standaard curves voor elk SCCA van belang, en het bepalen van de lineaire respons bereik voor iedere SCCA (zie hoofdstuk 4 voor het uitvoeren instructions). Zorg ervoor dat de standaard curves lopen voor iedere SCCA te meten in het monster.
OPMERKING: Standaard krommen kunnen worden gebruikt in ofwel buffer of de achtergrond van het te bepalen monster. In het tweede geval ( "standaard") kan zijn, worden waarden van het piekoppervlak van elke standaardcurve punt worden bepaald door afstand aftrekken van de achtergrond van het monster. - Pre-label alle buizen en glaswerk nodig de SCCA zuur naam, concentratie en de datum van de test.
- Bereid voorraadoplossingen per standaard met een bekende concentratie (10 mg / ml) met een maatkolf nauwkeurigheid tijdens standaardpreparaat waarborgen.
- Lossen vaste SCCA normen (citroenzuur en appelzuur) in ultrazuiver water (18,2 MQ) om het gewenst voor de voorraadoplossing concentratie bereiken.
- Een 10 mg / ml voorraadoplossing door het toevoegen van 100 mg van een standaard 10 ml maatkolf. Vul de maatkolf aan de 10 ml lijn met ultrapuur water om dissolve het zuur.
- Een lagere zuurconcentratie standaard of verwarm de kolven te rijden moeilijk te lossen SCCA standaarden, zoals adipinezuur, in oplossing.
- Verdunde vloeibare fase zuur normen (azijnzuur en melkzuur) in ultrazuiver water tot de gewenste concentratie te bereiken.
- Pre-fill een maatkolf met 5 ml ultrapuur water. Voeg voldoende zuur om een 10 mg / ml oplossing (berekend met de zuurdichtheid door de verkoper) aan de kolf bereiden en voeg voldoende water om het eindvolume van de oplossing 10 ml wordt.
- Lossen vaste SCCA normen (citroenzuur en appelzuur) in ultrazuiver water (18,2 MQ) om het gewenst voor de voorraadoplossing concentratie bereiken.
- Transfer elke voorraadoplossing om een schone 15 ml glazen buis met een polytetrafluorethyleen (PTFE) gevoerd deksel en afdichting met plastic folie paraffine. Voorraadoplossingen kunnen worden opgeslagen in afgesloten buizen bij 4 ° C gedurende 1 week.
- Zorg ervoor dat de SCCA normen niet zijn neergeslagen uit de oplossing vóór gebruik als stockoplossingen zijn gekoeld na preparatie. Drive neerslaat terug in oplossing door voorzichtig verwarmen.
- Bereid de SCCA extractie-oplossing. Onder de interne standaard in een concentratie voldoende voor detectie in de monsters (0,05 mg / ml). Bereid genoeg oplossing voor alle monsters te halen.
- Bereid 50 ml SCCA extractievloeistof door verdunning van de interne standaard stockoplossing aan 0,05 mg / ml in ultrazuiver water. Voeg 250 ul van de interne standaard voorraadoplossing (10 mg / ml) aan 49,75 ml water.
- Als het extract moet worden verdund, pas de interne standaard concentratie in de extractievloeistof zodat de uiteindelijke concentratie in de bepalingsgrens zal vallen (die een detecteerbaar, maar niet oververzadigd, piek, 5.2.2 hieronder) van de CE systeem na verdunning (0,05 mg / ml).
- Bereid verse extractie oplossing voor elke serie extracties (dat wil zeggen, voor elke experimentele serie).
- Bereid standaard curve samples(Een reeks van geschikte verdunningen) voor SCCAs plaats, met een minimum van ten minste 5 punten. De standaardkromme concentraties moeten in het lineaire meetgebied van een bepaalde SCCA en overspannen de SCCA concentraties verwacht in de monsters.
- Onder de geselecteerde interne standaard in de standaardcurve oplossingen voor kwantificering van de interne standaard in monsters mogelijk. De interne standaard zal worden gebruikt om te helpen bij de piek identificatie en het berekenen van extractie-efficiëntie (hoofdstuk 6).
- Vul telkens SCCA de hiervoor bepaalde concentraties (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml, zie hierboven 2.4.2) in nieuwe microcentrifugebuizen (één voor elke concentratie / standaardcurve onder) met behulp ultrazuiver water. Bereid 1 ml oplossing voor elke standaard concentratie curve punt. Zorg ervoor dat elke concentratiepunt bevat alle vier zuur normen en de interne standaard op de juiste concentratie.
- Bereid nieuwe standaard curve punten voor elke setmonsters dat moet worden uitgevoerd op het capillaire elektroforesesysteem. Houd de standaard curve SCCA monsters bij 4 ºC tot analyse, die zal optreden na de winning van SCCAs van doelweefsels (deel 3).
3. Biologische Acid Extraction
- Pre-label monsterbuizen, bereiden ten minste één buis voor elk monster te extraheren.
- Verwijder monsters te extraheren uit de opslag en leg ze op het ijs, terwijl een gewicht uit materiaal voor de extractie.
- Weeg 100 mg van het monster voor SCCA extractie.
- Na het wegen elk monster, weefsel overbrengen naar een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Meet een hoeveelheid monster zo dicht mogelijk bij de doelgroep massa mogelijk om de variabiliteit te verminderen.
- Blijf op de hoogte van de massa van elk monster gemeten, als de bedragen van SCCAs gedetecteerd zal worden genormaliseerd met behulp van de steekproef massa (zie 6.5.2 hieronder).
- Na afweging van alle monsters, voeg 1 ml van de extractie-oplossing (de water + interne standaard mengsel uit stap 2,4) aan elk van de monsterbuizen. Houd de verhouding extractievloeistof aan weefselmassa dezelfde voor alle extracties (hier 1 ml van 100 ± 5 mg weefsel). Meng goed door vortex gedurende 10 sec.
- Sta monsters op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Tijdens dit uur mengen elke buis elke 15 min zoals in stap 3,4.
- Na 1 uur van de winning, meng de monsters een laatste keer en transfer monsterbuizen naar een microcentrifuge. Centrifugeer de monsters bij 4 ° C, 10.000 xg gedurende 10 min vol materiaal (celwanden, deeltjes, enz.) Te precipiteren.
- Bij het verwerken van vloeibare monsters, voeg de juiste concentratie van de interne standaard, meng kort en centrifuge. Na centrifugeren behandelen vloeistofmonsters identiek aan het extract van vaste monsters.
- Controleer de pH van de monsters om te bevestigen dat zij met de pH van de loopbuffer in de detectie kit (stap 4,6) of buffer systeem dat employed. Als de omvang van de steekproef zijn meestal vrij klein is, kan de pH worden gecontroleerd met behulp van pH-papier.
- Bereid je voor om monsters te filteren met behulp van de spuit gemonteerd disc filters (3.8).
OPMERKING: Voorkom sample verlies door ervoor te zorgen dat elk filter juist vóór de overbrenging van bovenstaande vloeistof wordt bevestigd aan een spuit. Bereid een injectiespuit voorzien van een schijf filter voor elk monster te analyseren (waaronder standaard curve monsters). - Na centrifugeren van de monsters en voorbereiding van de spuit filters, breng de supernatant van elk monster naar een 3 ml injectiespuit met een 0,2 urn spuitfilter. Gebruik een nieuwe filter en spuit voor elk monster. Filter de monsters, waaronder standaard curve monsters en buffercontroles, voordat die op het CE-systeem.
- Filter het monster direct in een schone microcentrifugebuis. Na filtering, sluit de buis met filtraat en gooi de spuit / filter apparaten.
- Onmiddellijk plaats gefilterde samplesin het CE-systeem voor SCCA detectie; of bewaar monsters bij 4 ° C overnacht. Als monsters moeten 's nachts worden opgeslagen, sluit de buizen met plastic paraffine film gasuitwisseling en sample verdamping te voorkomen.
- Indien monsters langer moeten worden bewaard dan een dag na verfijning, flash freeze-extracten in vloeibare stikstof of bevriezen bij -20 ºC. Na het ontdooien, maar ervoor te zorgen dat elk monster wordt onderzocht op neerslag vorming en het filter indien nodig (zoals in stap 3.6).
4. Instellen van de SCCA Detection Run
- Raadpleeg de CE gebruikershandleiding voor programmeer- en besturingssoftware-specifieke details.
- Bereid capillaire elektroforese (CE) monster flesjes voor SCCA detectie. Zorg ervoor flesjes naar behoren worden geëtiketteerd, schoon en vrij van gebreken.
- Was en de doppen van de CE-flacons drogen voor gebruik.
- Was caps door ze onder te dompelen in ultrapuur water en waardoor ze 's nachts genieten. Na het weken de doppen, gooi het genietening oplossing en spoel de doppen twee keer meer met ultrapuur water.
- Transfer gespoeld caps op een schoon droog oppervlak bekleed met niet-pluizende tissue en laat ze aan de lucht drogen. Zorg ervoor dat caps zijn volledig droog zijn voor gebruik om de druk storingen te voorkomen.
- Transfer 1 ml van het monster aan elk CE flesje, en voorzichtig om te voorkomen dat per ongeluk spatten van het monster in de hals van het flesje. Na overdracht, plaats een CE-dop op elk flesje.
- Als een verdunning nodig is, verdunnen de koffie zaadmonsters 1:10 of 1: 100 direct in het CE flacon met behulp van ultrapuur water. Verdunningen groter dan 1: 100, maak een extractieoplossing te pipetteren fouten te voorkomen.
- Bereid een flesje per standaardcurve punt voor overdracht standaardcurve oplossingen (1,0 ml) van stap 2,5 CE flesjes. Cap elke buis na de overdracht.
- Bereid een 0,1 M oplossing van natriumhydroxide (NaOH) door toevoeging van 0,04 g NaOH in een bekerglas met 90 ml ultrazuiver water en waardoor de pellets to ontbinden. Breng de 0,1 M NaOH-oplossing teneinde een 100 ml maatkolf en breng het totale volume 100 ml.
- Voeg 1 ml 0,1 M NaOH-oplossing teneinde een schone CE flacon en dop.
- Bereid CE buffer flesjes voor elke partij van de monsters worden uitgevoerd op de CE-systeem. Scheiding kits beschikbaar zijn of aangepaste buffers kunnen worden gebruikt 13.
- Bereid 1 flacon met 1 ml startbuffer oplossing en cap.
- Bereid drie flesjes met elk van loopbuffer oplossing en cap 1 ml. Vervang de lopende buffer voor elke partij van de monsters en de standaard curve punten, of na 35 monsters, hetgeen het eerste plaatsvindt.
- Vul drie extra flesjes met 1 ml ultrapuur water en dop iedere flacon.
- Bereid 1 leeg "afval" flesje met dop.
- Na bereiding van de in stap 4.8 beschreven flesjes, laadt de flacon met buffers en water, en het afval flesjes (van stap 4.8.2-5) in de bufferbak van de capillaire elektroforese sysTEM instructies van de fabrikant 15. Let goed op de positie van elk flesje voor de auto-sampler programmering.
- Laad de flesjes die de standaardcurve punten en de flesjes die de monsters te analyseren in de inlaat monsterblad, volgens de instructies van de fabrikant. Let op de positie van elk flesje voor de auto-sampler programmering (zie stap 4.11.1 hieronder).
- Bereid conditionering en monster scheidingsmethoden (programma's voor deze zijn in de tabellen 1 en 2, respectievelijk), en schrijft een reeks monsters bestand per instrument gebruiksaanwijzing. Gebruik de scheidingswerkwijze in tabel 2: spoel de kolom met initiator (20 psi) gedurende 0,2 min; spoelen met versneller (20 psi) gedurende 0,5 min, injecteren monsters (0,5 psi) op de kolom 0,09 min, afzonderlijke monsters bij 20 kV gedurende 12 min, spoelen met NaOH (20 psi) gedurende 0,5 min, en tenslotte spoelen met water ( 20 psi) gedurende 0,5 min.
- Using van de CE-control software, schrijf het monster loopt sequentie (dat wil zeggen, de werklijst, een lijst met bestanden waarin de volgorde waarin de monsters worden geanalyseerd, en de methode die moet worden gebruikt om elk monster te scheiden) met behulp van de "sequentie" spreadsheet interface. Elke rij op het werkblad komt overeen met een monster run en een enkel bestand te produceren.
- Zorg ervoor dat bij het schrijven van de reeks bestand, monsters worden geïdentificeerd met behulp van de juiste positie in de steekproef lade. Zorg ervoor dat elk bestand heeft een unieke naam om de software te voorkomen dat het overschrijven van eerdere bestanden. Programma CE capillaire conditioning loopt als een aparte reeks voorafgaand aan de sequentie run met het monster scheidingsmethode.
- Begin met het monster volgorde uitgevoerd met de standaard curve oplossingen, gevolgd door SCCA monsters, en eindigen met een tweede run van de standaard curve oplossingen. Dit is een berekening van de mate van elke signaalverlies optreedt tijdens monsteranalyses mogelijk. </ Ol>
- Using van de CE-control software, schrijf het monster loopt sequentie (dat wil zeggen, de werklijst, een lijst met bestanden waarin de volgorde waarin de monsters worden geanalyseerd, en de methode die moet worden gebruikt om elk monster te scheiden) met behulp van de "sequentie" spreadsheet interface. Elke rij op het werkblad komt overeen met een monster run en een enkel bestand te produceren.
Tabel 1: Conditioneringmethode programma gebruikt om de capillaire korte keten carbonzuur scheiding bereiden via een capillaire elektroforese.
Tabel 2: Scheidingsmethode programma gebruikt om kortketenige carbonzuren analyses via een capillaire elektroforese.
5. SCCA Detection Run Execution en gegevensverzameling
- Initiëren capillaire conditioning runs. Verwachten dat de capillaire conditioneren twee of drie keer voordat de kolom klaar is voor het monster scheiding. Conditioning kolom worden uitgevoerd zoals beschreven in tabel 1. In het kort spoelen kolom met 0,1 M NaOH (20 psi) gedurende 1 min spoelen met water (20 psi)1 min spoelen met initiator (20 psi) gedurende 0,5 min, gespoeld met gas (20 psi) gedurende 0,5 min, aparte versneller bij 30 kV gedurende 10 minuten, spoel de kolom met 0,1 M NaOH (20 psi) gedurende 0,5 min, en tenslotte spoel de kolom met water (20 psi) gedurende 0,5 min.
- Breng de capillaire voorafgaand aan elk monster volgorde run. Bereiken juiste conditionering door het houden van de scheiding spanning is constant gedurende de vlucht en het observeren van een vlakke basislijn op de fotodiode array-trace.
- Na het conditioneren, initiëren sample scheiding door het openen van het menu "controle" in de software en het selecteren (dat wil zeggen, op te klikken) "run volgorde." Bewaken van de fotodiode array (PDA) trace om een goede scheiding verzekeren.
- Neem de eerste sporen en ervoor te zorgen dat het een vlakke basislijn en netjes opgelost (baseline resolutie), individuele zuur pieken. Overbelast monsters lang piek staarten of tailing piek vertonen en moet worden verdund (figuur 1).
Figuur 1:. Een vergelijking van PDA sporen wijzen op een overbelaste monster Omdat analytconcentratie toeneemt, kan de individuele piek geometrie beginnen te asymmetrische geworden. Bij (a) 0,05 mg / ml azijnzuur presenteert een welomschreven, tweezijdig symmetrische piek. Als de concentratie van azijnzuur verhoogd tot (b) 0,07 mg / ml en (c) 0,10 mg / ml, een piek staart vormen (pijlen). Deze piek tailing is een goede indicatie dat de steekproef is overbelast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Aan het einde van de reeks run, opent u de data bestanden één voor één in de CE-analyse software en de pieken te integreren.
- Integreer sample pieken.
- Open het eerste bestanden stel de automatische integratiestappen de eerste 3 minuten van de run (indien de spanning en dus de richting van kolom stroming wordt omgekeerd zoals beschreven in Tabel 1) sluiten. In hetzelfde menu, ingesteld piek selectiecriteria tot een minimum piek breedte van 50 eenheden en de maximale oppervlakte van 100 eenheden (of de standaardinstellingen van de fabrikant) aan een matig hoge mate van selectiviteit, het scheiden van zure pieken van achtergrondlawaai in het spoor.
- Handmatig controleren piek grenzen en basislijnen voor elke PDA spoor om een goede piek integratie te waarborgen. Onjuist geïntegreerde pieken (dwz een enigszins asymmetrische SSCA piek die is opgenomen als twee afzonderlijke pieken door geautomatiseerde software) moeten handmatig reïntegratie.
- Integreer sample pieken.
- Na de integratie, bekijk het percentage van het gebied rapport, dan markeren en kopieer het percentage van het gebied rapport en plak het in een aparte spreadsheet. Herhaal dit voor elk monster om de volledige run piek VERSLAG construerent waarbij elke rij vertegenwoordigt een enkele piek (bijv., dient elke piek één verbinding bevatten als de scheiding goed werkt).
6. Data Analysis
- Gegevensformulieren voor analyse met behulp van spreadsheet geconstrueerd (5,4). Beginnen analyse door het merken van het zuur normen voor elk van de standaardcurve, waaronder de interne standaard.
- Bereken een retentie-index voor elke piek door de retentietijd te verdelen voor elke piek in het monster door de retentietijd van de interne standaard in dat monster. Sorteer de door de resulterende retentie index ingesteld op de toppen van de interesse in elk monster te identificeren data.
- Na het identificeren van de piek voor elk zuur van belang zijn, te bouwen standaard curves voor elk zuur met behulp van de externe standaard curve punten.
- Genereer een standaard (concentratie) curve voor elke SCCA standaard door het bepalen van het piekoppervlak voor elke concentratie van de SCCA normen, en het uitzetten van de concentratie op de xxis vs piekoppervlak op de y-as. Plot van de lineaire regressie voor iedere SCCA standaard curve en definieert de helling vergelijking (y = mx + b).
- Het O 2 waarden van de lineaire regressies 0,90 of hoger als de kwantificering nauwkeurigst worden uitgevoerd in het lineaire gebied van de standaardcurve.
- Bereken de zuurconcentratie voor een gegeven SCCA in een monster met behulp van het piekoppervlak en de helling vergelijking voor de lineaire regressielijn van de standaardkromme (berekend 6.3.2 hierboven). Kort samengevat, verdelen de waargenomen piekoppervlak voor een bepaald zuur door de helling van de regressielijn voor standaard curve die zuur.
- Corrigeer de ruwe concentraties berekend in stap 6.4 voor het monster verlies tijdens het verwerken van het gebruik van de interne standaard (stap 6.5).
- Bereken de correctiefactor voor elk monster met behulp van de interne standaard.
- Verdeel de feitelijke concentratie van de interne standaard (dat wil zeggen, de known hoeveelheid aan het begin van het experiment) van de waargenomen waarde van de interne standaard in het monster (dat wil zeggen, de helling berekend met de vergelijking van de standaardcurve voor de interne standaard bedrag). Vermenigvuldig het ruwe concentratiewaarden van elk SCCA in het monster deze correctiefactor.
- Verdeel de interne standaard SCCA gecorrigeerde concentratie door de massa van de voor extractie te corrigeren voor variatie in monstermassa monster. Deze berekening levert hoeveelheid analyt per massa monster (mg SCCA per mg gemalen koffie in dit voorbeeld), dat vervolgens kan worden omgezet naar de juiste eenheden voor bepaalde studie (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
- Na het berekenen SCCA concentraties (genormaliseerd ofwel de massa [voor vaste of vloeibare monsters] of volume [voor vloeistofmonsters]), gebruiken ze voor statistische analyse volgens de eisen van het experimentele ontwerp en kwesties van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is met succes gebruikt om de effecten van de behandeling van zaden op de SCCA inhoud van groene koffie zaden te meten. In dit experiment werden de zes behandelingen waren: een verzadigde microbiële suspensie van Leuconostoc pseudomesenteroides stam GCP674 in het groeimedium (1) een waterige suspensie van GCP674 microben in water (2), een waterige oplossing van azijnzuur en melkzuur (0,15 en 0,4 mg / ml) (3), een uitgegeven M1 groeimedium behandeling (4), dH 2 O water (5), en een niet-behandelde controle (geen toegevoegde stof om zaden) (6). Behandelingen werden toegepast en men liet 24 uur fermenteren. Vier onafhankelijke replica's werden onderzocht voor elke behandeling. Analyse werd uitgevoerd gedurende citroenzuur (C), appelzuur (M), azijnzuur (A) en melkzuur (L) zuurgraad gebruikt adipinezuur als interne standaard.
Voor iedere SCCA en de interne standaard, standaard curves spanning thij concentratiegebied voorspeld in koffiestaaltjes (5, 10, 20, 40, 60 en 80 ng / ul) werden gegenereerd. Zoals verwacht, vertoonde elk zuur een lineaire respons voor dit concentratiebereik R-kwadraat waarden van 0,9876 voor citroenzuur, appelzuur 0,9987 voor, 0,9998 voor azijnzuur en 0,9999 voor melkzuur. De interne standaard (adipinezuur) vertoonden ook een lineaire respons over dit concentratiegebied, hetgeen een R-kwadraat waarde van 0,9984. Vóór monsteranalyses detectielimiet (LOD) en van kwantificering (LOQ) werden bepaald voor elk SCCA en de interne standaard (adipinezuur). De detectiegrens van citroenzuur, appelzuur, azijnzuur en adipinezuur was 1 ng / ul; en de LOD voor melkzuur werd 2 ng / ul. De limiet van kwantificering van citroenzuur, adipinezuur, azijnzuur en melkzuur was 4 ng / ul; en de LOQ van appelzuur werd 2 ng / ul. Om het percentage herstel SCCAs en adipinezuur te berekenen, werd koffie verrijkt met individuele SCCAs of adipinezuur en processed volgens de hierboven beschreven protocol. Het percentage herstel werd vervolgens berekend met behulp van de volgende formule ([{piekoppervlak spiked sample - piekoppervlak controle monster} / theoretische piek gebied van de berekende concentratie van het verrijkte monster {gegenereerd door het analyseren van buffer + SCCA / adipinezuur spike}] x 100) . Met deze methode, we berekende percentage teruggevonden 106,08% ± 12,66 voor citroenzuur, 98,35% ± 1,15 voor appelzuur, 91,94% ± 3,07 voor azijnzuur, 97,42% ± 1,48 melkzuur en 100,19% ± 2,57 voor adipinezuur.
De nauwkeurigheid van de werkwijze te bepalen, de intra- en inter-dag variabiliteit van metingen uitgevoerd met behulp CZE werd ook berekend. Intra-day variabiliteit te bepalen, werden monsters van elk SCCA en adipinezuur gemeten vanaf een enkele koffie monster vijf keer over een periode van 24 uur, en de coëfficiënten van de variabiliteit (COV; berekend door de standaarddeviatie in piekoppervlakte [of de concentratie] foReach SCCA door het gemiddelde piekoppervlak [of concentratie] voor die SCCA, en vervolgens te vermenigvuldigen met 100) voor elke verbinding werd berekend met de piekgebied. Om het belang van het corrigeren monsters met behulp van de interne standaard te beoordelen, werd de variatiecoëfficiënt voor elke SCCA ook berekend met behulp van de concentraties van elke SCCA berekend met adipinezuur als interne standaard. Zoals verwacht, de CZE methode kon nauwkeurig meten SCCAs en adipinezuur, met CoVs van 3,02% van citroenzuur, 2,64% voor appelzuur, 3,74% voor azijnzuur en 2,01% voor adipinezuur (melkzuur was onder LOD / LOQ voor alle koffie monsters gemeten). Deze metingen werden herhaald over een periode van vijf dagen, en de cv's varieerde 2,11-5,25% voor citroenzuur, 2,01-5,32% voor appelzuur, 1,72-3,74% voor azijnzuur en 1,26-3,82% voor adipinezuur. Toen piekoppervlakken werden gecorrigeerd met behulp van de interne standaard en berekende concentraties van SCCA werden gebruikt om CoVs te berekenen, de intra-day CoVs varieerden from 1,08-4,17% van citroenzuur, 1,47-3,40% voor appelzuur en 2,68-5,10% van azijnzuur. Om inter-dag variabiliteit te beoordelen, werden SCCAs in één koffie monster eenmaal gemeten per dag over een periode van vijf dagen. Dit experiment werd vervolgens herhaald vijfmaal per SCCA en adipinezuur. De COV voor iedere SCCA werd vervolgens berekend door de standaarddeviatie in oppervlakte (of concentratie) voor elk SCCA door de gemiddelde oppervlakte (of concentratie) voor die SCCA en te vermenigvuldigen met 100. Om het belang van het corrigeren van monsters met behulp van de interne beoordelen standaard, CoVs werden berekend met de concentraties van elke SCCA berekend met adipinezuur als interne standaard. De CZE methode kon betrouwbaar reproduceren SCCA metingen met CoVs variërend 5,24-10,02% van citroenzuur, 6,55-9,47% voor appelzuur, 7,67-8,63% voor azijnzuur en 3,08-6,57% voor adipinezuur. Wanneer piekoppervlakken werden gecorrigeerd met behulp van de interne standaard en berekende concentraties SCCA gebruikt calculated CoVs, de inter-dag CoVs varieerde 4,56-6,23% voor citroenzuur, 3,39-4,99% voor appelzuur en 9,5-10,94% voor azijnzuur.
Figuur 2: Voorbeeld PDA sporen met pieken aangegeven werden Groene koffie monsters verdund 1:10 voordat u het in CE flesjes.. Zuren die van belang zijn aangegeven. Azijnzuur (A), citroenzuur (C), melkzuur (L), appelzuur (M) en de interne standaard, adipinezuur (IS) Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Statistische analyse werd uitgevoerd op zuur gecorrigeerd door gebruikmaking van een algemeen lineair model (GLM) om te bepalen of behandeling veranderde organisch zuur niveaus. Een model met "behandeling" x "run" (gecodeerd als een willekeurige factor) was uitvoe ted de GLM. Tukey paarsgewijze vergelijkingen bij 95% betrouwbaarheidsinterval werden gebruikt om de richting waarin de veranderingen te bepalen.
Behandeling gewijzigd SCCA concentraties in de groene koffie. Azijnzuur significant verrijkt in alle behandelingen via geen behandeling controle (GLM, p <0,0001).
Figuur 3:. Impact van de behandeling op organisch zuur niveaus in groene koffie behandeling had geen invloed op de (a) citroen- of appelzuur niveaus in groene koffie. Echter, alle behandelingen significant verhoogd (b) azijnzuur niveaus vergelijking met geen behandeling controle (GLM, p <0,001). Verhogingen van azijnzuur niveaus waren het grootst bij de microbe + medium behandeling. Letters geven significante verschillen door Tukey paarsgewijze vergelijkingen op 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De grootste toename werd waargenomen in de microbe + media behandeling, die 0,25 maal (0,5 versus 0,4 mg / g koffie in GCP674 versus NT) toe. Een soortgelijke trend werd waargenomen in melkzuurspiegels, maar ze waren niet significant verschillend. Er waren geen significante veranderingen of trends in de andere zuren gevolgd (citroenzuur en appelzuur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals bij elke analytische techniek zijn er verschillende kritische factoren die een belangrijke invloed kunnen de kwaliteit en betrouwbaarheid van de gegenereerde data. Ten eerste is het belangrijk om monsters efficiënt te verwerken, met een minimum invries / ontdooi cycli. Herhaald invriezen en ontdooien kan de chemische samenstelling van het monster gevaar voor verwerking of analyse. Ten tweede, is het essentieel om de stappen van het protocol consistent en gelijkmatig voor alle monsters. Technische fouten gevolg van inconsistente monstervoorbereiding en de behandeling kan aanzienlijk invloed hebben op de kwaliteit van de gegenereerde gegevens, en resulteren in verhoogde "ruis" in de SCCA metingen. Zo zal de deeltjesgrootte van het monster na slijpen invloed hebben op de snelheid en efficiëntie van extractie SCCA. Het is daarom van groot belang dat de monsters gemalen tot een uniforme deeltjesgrootte, zoals deze extractie efficiëntie in monsters behouden en helpen om het monster tot monster variabiliteit te verminderen. Similarly, zal nauwkeurige meting en pipetteren tijdens de bereiding van standaardoplossingen, nauwkeurige meting van het monster massa's, en zorgvuldige controle (en normalisatie) van de winning tijden resulteren in het genereren van meer uniforme gegevens. De tijd nemen om zorgvuldig te normaliseren, te meten en vast te leggen elk van deze parameters zal zorgen voor de betrouwbaarheid van de gegevens en zorgen voor een nauwkeurige post-run correctie van de gegevens voor eventuele verwerking fouten die kunnen optreden. Ten derde, is het essentieel om te selecteren en gebruik een geschikte interne standaard. Berekeningen van de uiteindelijke analytconcentratie zal sterk afhankelijk zijn van nauwkeurige correctie van het piekoppervlak van de interne standaard waargenomen in elk monster. Hierdoor is het essentieel dat de interne standaard zowel nauwkeurig en precies meten; Liefst moet niet van nature in het monster of co-elueren met andere verbindingen. Niet alleen de juiste keuze en het gebruik van een interne standaard in alle monsters kan de onderzoeker te controleren for veranderingen in metabolietniveaus waargenomen als gevolg van verschillen in extractie-efficiëntie; ook vereenvoudigt opwerking en piek identificatie. Tenslotte is het noodzakelijk om de piek identificatie en integratie te monitoren. Hoewel geautomatiseerde algoritmes zijn bruikbaar, ze niet perfect. De opbrengst van deze techniek gegevens vertrouwen op de nauwkeurigheid van de integratie en de sporen worden gecontroleerd handmatig de kwaliteit van integratiegebeurtenissen, met name de bepaling van de piek grenzen en basislijnen waarborgen.
Zoals bij elke analyseproces is het belangrijk vast te stellen dat de CZE hier gepresenteerde methode is: a. nauwkeurig: in staat zijn om de hoeveelheid van een bepaald SCCA heden te bepalen; b. precies: in staat reproduceerbaar kwantificeren SCCAs binnen dezelfde dag en in de metingen gemaakt tussen verschillende dagen van de analyse; en c. robuust: kunnen recupereren meeste SCCAs in de monsters geanalyseerd. Zoals hierboven getoond in de representatieve resULT, de hier beschreven werkwijze kan het nauwkeurig bepalen van de hoeveelheid SCCAs aanwezig in monsters. Alle SCCAs gemeten (citroenzuur, appelzuur, azijnzuur en melkzuur) en interne standaard (adipinezuur) vertoonde een lineaire respons in de 0-80 ng / ul concentratiebereik. Bovendien, de LOQ en LOD deze zuren varieerden 2-4 ng / ul en 1-2 ng / gl resp. De methode was ook precies, alle van de SCCAs gemeten en de adipinezuur interne standaard tentoongesteld lage intra-dag variabiliteit, die tussen 2,0-5,5% van de oppervlakte (of tussen 1,0-5,2% van de berekende concentratie) voor alle SCCAs gemeten. De inter-dag variabiliteit van SCCA metingen was ook relatief laag, die tussen 3,05-10,10% van de oppervlakte (of tussen 3,30-10,95% van de berekende concentratie) voor alle SCCAs gemeten. Interessant, met uitzondering van azijnzuur, die consistent is bij of nabij de detectiegrens / kwantificering in alle monsters koffie Analyzed, corrigeren mbv adipinezuur als interne standaard geleid tot meer reproduceerbare metingen en een verlaging van de coëfficiënt van variabiliteit (zie Representatieve resultaten, hierboven). Deze gegevens zijn consistent met eerder gepubliceerde resultaten wijzen die correctie met een interne standaard essentieel voor het behouden precisie CE analyses tijd 16. Hoewel sommige werkwijzen anorganische ionen toegepast als een interne standaard, vonden we dat adipinezuur was een passende standaard voor de CZE hier gepresenteerde methode, zoals een organisch zuur en daardoor schade kunnen toebrengen ervaren de monstervoorbereiding stappen soortgelijk aan die ervaren door de SCCAs van belang in het monster. Adipinezuur hadden de additionele voordelen niet in de koffiestaaltjes zijn onderzocht, vertoont een lineaire respons over dezelfde concentraties gebruikt SCCAs in deze studie, vertoont relatief lage LOD / LOQ waarden (1 ng / pl en 4 ng / pl, respectievelijk), eenda hoog percentage herstelbaarheid van de koffie-matrix (100,19% ± 2.57), waardoor het een handige standaard voor het kwantificeren van SCCAs in de koffie monsters. Interessant is dat de hoge percentage winning waargenomen voor adipinezuur was haalbaar voor organische zuren gemeten in deze studie, die percentage winning waarden variërend 91,94-106,08% vertoonde. Deze gegevens geven aan dat de CZE hier gepresenteerde methode kan terugwinnen meeste SCCAs aanwezig koffiestaaltjes.
Aanpassing van dit protocol om nieuwe types sample vereist het verzamelen van voorlopige gegevens, op basis van literatuur of empirisch bewijs, met betrekking tot de verwachte hoeveelheden van gerichte analyten. Deze informatie zal helpen de experimentele opzet, monstervoorbereiding, en de standaard curve bouw. Het bepalen van de juiste monsterverdunning gebruiken kunnen gemakkelijk empirisch worden bewerkstelligd door het uitvoeren van een verdunningsreeks van een testextract een goede werking verdunning vinden. Dit protocol werd ontworpen om de sporenSCCAs geschetst in voorbeeld resultaten, maar het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere SCCAs detecteren door het veranderen van de scheiding parameters, zoals scheiding spanning, druk en tijd. Het is belangrijk om te onthouden echter dat verandering van de scheiding parameters het aantal runs die kan worden uitgevoerd op een enkele set van afscheiding buffers als deze buffers afbreken gebruik kunnen veranderen. Baseline degradatie of veranderingen in de huidige zijn vaak uitingen van over-gebruikte / uitgeput buffers. Het vervangen van de lopende buffer en reconditioneren van de capillaire kan vaak op te lossen deze problemen. Na langdurig gebruik, zal het vermogen van de capillaire analyten lossen ook afnemen. Verminderde basislijn stabiliteit drastische verschuivingen in retentietijd en lagere piek resolutie zijn allemaal tekenen dat de capillaire moet worden vervangen. Het is ook mogelijk een drukfout gevolg van onjuiste afdichting tussen het monsterbuisje en capillaire ontvangen als gevolg van een slecht passende dop of een defect flesje. verzekerende doppen passen precies in het monster flesjes om deze fout te voorkomen.
Traditioneel zijn chromatografische werkwijzen zoals GC-MS, GC-FID of HPLC gebruikt om SCCAs te detecteren in uiteenlopende matrices, zoals lucht, water, bodem en plantmonsters 14. Doeltreffende Een groot nadeel bij deze werkwijzen is de noodzaak om SCCAs derivatiseren voor detectie. Derivatisering gebruikt gevaarlijke reagentia aantoonbaarheidsgrens wordt vaak beïnvloed door de werking van de derivatiseringsreactie 13,14. De detectie van niet-gederivatiseerde SCCAs met CZE vermijdt analyt verlies tijdens verwerking, blootstelling aan gevaarlijke Derivatiseringsmiddelen en vermindert monstervoorbereiding tijd. Deze voordelen kunnen worden gezien in het hoge percentage recovery rates (tussen 91,94-106,08%) berekend voor alle SCCAs gemeten in dit onderzoek. Bovendien CZE kwantificering van SCCAs bereikt detectiegrenzen vergelijkbaar zijn met die in de literatuur voor GC-MS, GC-FID en HPLC, in het bereik of delen per miljoen tot delen per miljard 13,14. In combinatie met high-speed run tijden, scheiding power high-resolution, de straight-forward monster verwerking protocollen in dienst van deze analysemethode, de gevoeligheid en gemak van CZE maken het een aantrekkelijk alternatief voor de traditionele GC of HPLC methoden.
Het is echter belangrijk op te merken dat, hoewel CZE verschaft verscheidene voordelen ten opzichte van GC-MS HPLC of LC-MS / MS gebaseerde methoden SCCA analyse is het niet geschikt voor alle SCCA analyses. Bijvoorbeeld, omdat de CZE hier beschreven methode alleen vertrouwt op spectrofotometrische detectie, het niet mogelijk voor de identificatie van onbekende SCCAs aanwezig in het monster, of de bevestiging van de SCCA identiteit via massaspectrale profilering. Hierdoor zou GC-MS of LC-MS / MS methoden beter geschikt voor SCCA analyses in monsters bevattende grote aantallen onbekende SCCAs of monsters waarin het essentieel is voor de identiteit van alle aanwezige SCCAs te bevestigen.Bovendien, zoals eerder gerapporteerd LC-MS / MS gebaseerde methoden laten ondergrens van detectie (LOD) -on gemiddeld 0,05 ug / ml voor LC-MS / MS 17 vs. de 1 ug / ml voor CZE verkregen volgens de methode hier gepresenteerde-LC-MS / MS kwantificering van SCCAs geschikter voor monsters waarin SCCAs aanwezig zijn in zeer kleine of sporen zijn.
Het protocol hier gepresenteerde gericht op de extractie en kwantificering kortketenige carbonzuren (SCCAs) uit plantenweefsel. Verkrijgen vaardigheid in deze techniek zal de deur naar een groot aantal toepassingen van deze technologie voor de individuele onderzoeker openen. Deze techniek, met slechts weinig verschillen in methodologie, is met succes toegepast bij de analyse van SCCAs in een diverse populatie van monsters en substraten, variërend van voedingsmiddelen en weefselmonsters milieu water- en bodemmonsters 8. Bovendien, het verkrijgen van bekendheid met de chemische principes die ten grondslag liggenDeze technologie hoewel dit protocol onderzoekers met de kennis nodig is voor de analyse van andere verbindingen, zoals koolhydraten of metalen 8,13 poging verschaffen. De analytische flexibiliteit van capillaire elektroforese laat een buitengewoon krachtig hulpmiddel geschikt voor een groot aantal experimentele toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
