Summary
I denna artikel presenteras en metod för detektion och kvantifiering av organiska syror från växtmaterial med hjälp av gratis zoner kapillärelektrofores. Ett exempel på den potentiella tillämpningen av denna metod att bedöma effekterna av en andra jäsning på organiska syranivåer i kaffefrön, tillhandahålls.
Abstract
Karboxylsyror är organiska syror innehållande en eller flera terminala karboxylgruppen (COOH) funktionella grupper. Kortkedjiga karboxylsyror (SCCAs, karboxylsyror innehållande tre till sex kolatomer), såsom målat och citrat, är avgörande för en väl fungerande många biologiska system, där de fungerar i cellandningen och kan fungera som indikatorer på cell hälsa. I livsmedel, kan halten organisk syra ha en betydande inverkan på smak, med ökade SCCA nivåer resulterar i en sur eller "syra" smak. På grund av detta, metoder för snabb analys av organiska syranivåer är av särskilt intresse för livsmedels- och dryckesindustrin. Men tyvärr, de flesta metoder som används för SCCA kvantifiering är beroende av tidskrävande protokoll kräver derivatisering av prover med farliga reagens, följt av dyra kromatografiska och / eller masspektrometrisk analys. Denna metod detaljer en alternativ metod för detektion och kvantifiering av orgAnic syror från växtmaterial och livsmedelsprover med hjälp av gratis zoner kapillärelektrofores (CZE), ibland helt enkelt benämnd kapillärelektrofores (CE). CZE ger en kostnadseffektiv metod för att mäta SCCAs med en låg detektionsgräns (0,005 mg / ml). Den här artikeln detaljer utvinning och kvantifiering av SCCAs från växtprover. Medan den metod som fokuserar på mätning av SCCAs från kaffebönor, kan den metod som föreskrivs tillämpas på flera växtbaserade livsmedelsmaterial.
Protocol
1. Provframställning
- Montera prover för kortkedjig karboxylsyra (SCCA) extraktion. Förbered 1,0 g kaffe frö i taget för att säkerställa att tillräckligt prov kommer att finnas kvar efter bearbetning.
- Om proverna frystes före malningen hålla vävnaden frysas under bearbetningen för att förhindra frysning / tining skador och prov oxidation. Avlägsna provet från frysen eller under noll lagring endast efter behov för slipning.
- Flash frysa färska prover i flytande kväve omedelbart före prov slipning. För att minimera provhantering, flash frysa proverna genom att placera dem i en mortel förfylld med flytande kväve.
- Analysera vätskeprover omedelbart efter generation, eller blixt frysa i flytande kväve och förvara vid -20 ° C eller -80 ° C tills analys. Före analys, ta bort frysta prover från lagring och låt tina. För vätskeprover vidare till steg (3,5) för bearbetning.
- bär lämplämpligt personlig skyddsutrustning (inklusive skyddsglasögon, handskar och laboratorierock) innan du arbetar med flytande kväve.
- Trippel-grind vävnadsprover till ett likformigt fint pulver (det vill säga, med likformig partikelstorlek) i flytande kväve med användning av en keramisk mortel och mortelstöt.
OBS: Att uppnå en enhetlig partikelstorlek är väsentlig för att maximera SCCA extraktionseffektivitet.- Pre-chill morteln och mortelstöt med flytande kväve före tillsatsen av provet. Hålla murbruket fylld med en liten volym av flytande kväve som provet tillsätts.
- Med hjälp av en slev, tillsätt tillräckligt flytande kväve till murbruket att helt dränka provet.
- Lägg lätt malda prover, såsom löv eller rostat kaffe, för att det flytande kvävet och krossa med en cirkelsliprörelse. Börjar att mala prover när kvävenivån vätska har minskat till den punkt där det bara knappt täcker proverna.
- Lägg svårt att slipa prover, så ens råkaffe frön, till flytande kväve och tillåta dem att frysa för 10-30 sekunder (eller tills det flytande kvävet slutar kraftigt kokande) före malning. Bryt vävnaden i mindre fragment med hjälp av en vertikal krossning rörelse, och sedan fullständig vävnad slipning med hjälp av en rundslipning rörelse.
- Upprepa steg 1.3.2-1.3.4 ytterligare två gånger, så att proven mals totalt tre gånger. Typiskt kommer tre på varandra följande rundor av slip reducera prover till ett pulver med en mjölliknande konsistens.
- Om en mjölliknande konsistens inte uppnås, upprepa steg 1.3.2-1.3.4 tills proverna reduceras till ett pulver likformigt liten partikelstorlek (extraktion effektivitet är omvänt proportionell mot partikelstorlek).
- Överföra pulvret till glasampuller eller 1,5 ml mikrocentrifugrör. Initiera nedströms behandling omedelbart efter slipning (rekommenderas), eller lagra proverna vid -80 ° C tills proverna är klara för utvinning.
- Om prover måste lagras innananalys, dela upp provet i 500 mg portioner (eller 500 l alikvoter för vätskeprover) och delas mellan flera tuber för förvaring. Undvik att utsätta prover upprepade frysning / upptiningscykler, eftersom dessa kan påverka provets sammansättning och negativt påverka framtida provmätningar.
2. organisk syra standardpreparatet
- Montera autentiska standarder för SCCAs av intresse. Dessa kommer att användas för att skapa externa och interna standardlösningar för användning vid bestämning av SCCA koncentrationer. För kaffe prover inkluderar citronsyra, äppelsyra, ättiksyra, och mjölksyra som syror av intresse och adipinsyra som inre standard.
- Säkerställa säker på att den interna standarden vald inte finns naturligt i provet, och att standarden inte samar elueras med andra toppar i provet profil.
- Kör standardkurvor för varje SCCA av intresse och bestämma linjär respons intervall för varje SCCA (se avsnitt 4 för att köra instbråk). Se till att köra standardkurvor för varje SCCA som ska mätas i provet.
OBS: Standardkurvor kan köras i antingen buffert eller bakgrunden av provet som skall analyseras. I det andra fallet ( "standard addition"), kommer värdena för topparean för varje standardkurva punkt bestämmas genom att subtrahera bort bakgrunden av provet. - Pre-etikett alla rör och glas som behövs med SCCA syra namn, koncentration, och datum för analysen.
- Bered stamlösningar för varje standard vid en känd koncentration (10 mg / ml) med hjälp av en mätkolv för att säkerställa exakthet under standardberedning.
- Upplösa fasta SCCA standarder (citronsyra och äpplesyra) i ultrarent vatten (18,2 MQ) för att uppnå den önskade för stamlösningens koncentration.
- Skapa en 10 mg / ml förrådslösning genom tillsats av 100 mg av standard till en 10 ml mätkolv. Fyll mätkolven till 10 ml linje med ultrarent vatten till dissolve syran.
- Skapa en lägre koncentration av syra standard eller försiktigt värma kolvarna för att driva svåra att upplösa SCCA standarder, till exempel adipinsyra, i lösning.
- Utspädd flytande fas syrastandarder (ättiksyra och mjölksyra) i ultrarent vatten för att uppnå den önskade koncentrationen.
- Pre-fylla en mätkolv med 5 ml ultrarent vatten. Tillsätt tillräckligt syra för att framställa en 10 mg / ml lösning (beräknas med hjälp av syratätheten som säljaren) till kolven, och sedan lägga tillräckligt med vatten för att bringa den slutliga volymen av lösningen till 10 ml.
- Upplösa fasta SCCA standarder (citronsyra och äpplesyra) i ultrarent vatten (18,2 MQ) för att uppnå den önskade för stamlösningens koncentration.
- Överför varje stamlösning till en ren 15 ml glasrör, med en polytetrafluoreten (PTFE) fodrade lock, och täta med plastparaffinfilm. Stamlösningar kan förvaras i förslutna rören vid 4 ° C i en vecka.
- Se till att SCCA standarder inte har fällts ut ur lösningen före användning om stamlösningar har varit kyld efter FÖRBEREDELSEation. Drive fälls tillbaka i lösning genom försiktig uppvärmning.
- Förbereda SCCA extraktionslösningen. Inkluderar den inre standarden vid en koncentration som är tillräcklig för detektering i proven (0,05 mg / ml). Förbered tillräckligt lösning för att extrahera alla prover.
- Förbered 50 ml SCCA extraktionslösningen genom utspädning av inre standardstamlösningen till 0,05 mg / ml i ultrarent vatten. Tillsätt 250 | il av den interna standardstamlösning (10 mg / ml) till 49,75 ml vatten.
- Om extraktet behöver spädas, justera den interna standardkoncentration i extraktionslösningen så att den slutliga koncentrationen kommer att falla inom ramen för kvantifiering (ger en detekterbar, men inte över mättad, topp, se 5.2.2 nedan) av CE systemet efter utspädning (0,05 mg / ml).
- Framställ färsk extraktionslösningen för varje serie av extraktioner (dvs., för varje experimentserie).
- Bered standardkurva prover(En serie av lämpliga spädningar) för SCCAs av intresse, med användning av ett minimum av åtminstone 5 poäng. Standardkurvan koncentrationerna måste vara i linjär respons intervall för en given SCCA, och spänner SCCA koncentrationer kan förvänta sig av proverna.
- Inkluderar den valda inre standard i standardkurvan lösningar för att tillåta kvantifiering av den interna standarden i prover. Den inre standarden kommer att användas för att underlätta topp identifiering och beräkning av extraktion effektivitet (avsnitt 6).
- Späd varje SCCA till koncentrationerna som anges ovan (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml, se ovan, 2.4.2) i nya mikrocentrifugrör (en för varje koncentration / standardkurva punkt) med hjälp av ultrarent vatten. Förbereda 1 ml av lösningen för varje standardkurva koncentrationspunkt. Se till att varje koncentrationspunkt innehåller alla fyra sura standarder och den interna standarden i rätt koncentration.
- Förbereda nya standard kurvpunkter för varje uppsättningprover som skall köras på det kapillära elektroforessystem. Håll standardkurvan SCCA prover vid 4 ° C tills analys, som kommer att ske efter utvinning av SCCAs från målvävnader (avsnitt 3).
3. Organisk syraextraktion
- Pre-label provrör, förbereder åtminstone ett rör för varje prov som skall extraheras.
- Ta prover som ska hämtas från lagring och placera dem på is medan väger ut material för extraktion.
- Väg upp 100 mg av provet för SCCA extraktion.
- Efter vägning av varje prov, överföra vävnad till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör. Mät upp en mängd av provet som nära målet massan som möjligt för att minska variabilitet.
- Håll koll på massan av varje prov, som mängderna av SCCAs upptäckts kommer att normaliseras med hjälp av provmassan (se 6.5.2 nedan).
- Efter att ha vägt alla prover, tillsätt 1 ml extraktionslösning (den water + intern standardblandning från steg 2,4) till var och en av provrören. Hålla förhållandet av extraktionslösningen till vävnadsmassa detsamma över alla extraktioner (i detta fall 1 ml för 100 ± 5 mg vävnad). Blanda väl genom virvling i 10 sek.
- Tillåta proverna att stå vid rumstemperatur under 1 timme. Under denna timme, blanda varje rör var 15 min som i steg 3,4.
- Efter 1 h av extraktion, blanda proverna en sista gång och överföra provrören till en mikrocentrifug. Centrifugera proverna vid 4 ° C, för att 10.000 xg i 10 min utfälla fast material (cellväggar, partiklar, etc.).
- Vid behandling av vätskeprover, tillsätt lämplig koncentrationen av inre standard, blanda en kort stund och centrifugera. Efter centrifugering, behandla vätskeprover identiskt med utdrag ur fasta prover.
- Kontrollera pH-värdet av proverna för att bekräfta att de är förenliga med pH-intervallet löpbufferten i detektionskit (steg 4,6) eller buffertsystem som employed. Såsom volymerna av provet är vanligtvis ganska liten, kan pH övervakas med användning av pH-papper.
- Förbered dig på att filtrera prover med hjälp av sprutmonterade skivfilter (3,8).
OBS: Förhindra provförlust genom att säkerställa att varje filter är korrekt ansluten till en spruta innan överföring supernatant. Förbered en spruta utrustad med en skivfilter för varje prov som skall analyseras (inklusive standardkurva prover). - Efter centrifugering av prover och framställning av sprutfilter, överför supernatanten från varje prov till en 3 ml spruta utrustad med en 0,2 um sprutfilter. Använda ett nytt filter och spruta för varje prov. Filtrera alla prover, inklusive standardkurva prover och buffertkontroller innan körs på CE-systemet.
- Filtrera provet direkt i en ren mikrocentrifugrör. Efter filtrering, stänga röret med filtratet och kassera sprutan / filterapparat.
- Placera omedelbart filtrerade proveri CE-system för SCCA detektering; eller lagra proverna vid 4 ° C över natten. Om proverna ska förvaras under natten, täta rören med plast paraffin film för att förhindra gasutbyte och prov avdunstning.
- Om proverna skall lagras längre än en dag efter filtrering, blixt frysa extrakt i flytande kväve eller frysa vid -20 ° C. Efter upptining, dock se till att undersöks varje prov för fällning och filter vid behov (som i steg 3,6).
4. Installera SCCA Detection Run
- Konsultera CE manual för programmerings- och kontrollprogramvaruspecifika detaljer.
- Förbered kapillär elektrofores (CE) provflaskor för SCCA detektion. Säkerställa flaskor är korrekt märkta, ren och fri från defekter.
- Tvätta och torka locken av CE flaskor före användning.
- Tvätta lock genom att sänka dem i ultrarent vatten och låta dem dra över natten. Efter blötläggning locken, kassera blöting lösning och skölj locken två gånger med ultrarent vatten.
- Överföring sköljdes lock till en ren torkytan fodrad med luddfri vävnad och låta dem lufttorka. Säkerställer lock är helt torra innan användning för att undvika tryck misslyckanden.
- Överför 1 ml prov till varje CE flaska, som är noga med att undvika misstag stänker provet i halsen av flaskan. Efter överföring, placera en CE locket på varje flaska.
- Om det behövs en utspädning, späd kaffe fröprover 1:10 eller 1: 100 direkt i CE flaskan med hjälp av ultrarent vatten. För späd större än 1: 100, skapa en mellanliggande utspädning för att undvika pipetteringsfel.
- Förbered en flaska för varje standardkurva punkt genom att överföra standardkurva lösningar (1,0 ml) från steg 2,5 till CE flaskor. Cap varje rör efter överföring.
- Bered en 0,1 M lösning av natriumhydroxid (NaOH) genom att tillsätta 0,04 g NaOH till en bägare innehållande 90 ml ultrarent vatten och låta pelletsen to upplösas. Överför 0,1 M NaOH-lösning till en 100 ml mätkolv och bringa den totala volymen till 100 ml.
- Tillsätt 1 ml 0,1 M NaOH-lösning till en ren CE flaskan och locket.
- Förbered CE buffertflaskor för varje sats av prover som ska köras på CE-systemet. Separations kit är tillgängliga eller anpassade buffertar kan användas 13.
- Förbereda en ampull med 1 ml startbuffert lösning och locket.
- Förbered tre flaskor med 1 ml vardera av rinnande buffertlösning och mössa. Byt löpbufferten före varje sats av prover och standard kurvpunkter, eller efter 35 prover, beroende på vilket som inträffar först.
- Fyll ytterligare tre flaskor med 1 ml ultrarent vatten och locket varje flaska.
- Förbered en tom "avfall" flaska med lock.
- Efter beredning ampullerna som beskrivs i steg 4,8, ladda flaskor innehållande buffertar och vatten samt avfallsflaskor (från steg 4.8.2-5) i buffertbrickan av kapillärelektrofores system, enligt tillverkarens anvisningar 15. Noggrant notera positionen för varje flaska för automatisk sampler programmering.
- Ladda de små flaskor innehållande standardkurvan poäng och de flaskor som innehåller de prover som skall analyseras in i inlopps sampelbrickan, såsom beskrivs i tillverkarens instruktioner. Notera positionen för varje flaska för automatisk provtagare programmering (se steg 4.11.1 nedan).
- Förbered konditionering och provseparationsmetoder (program för dessa ges i tabellerna 1 och 2, respektive), och skriva en provsekvens fil enligt bruksanvisning instrument. Använda separationsmetoden i detalj i tabell 2: Skölj kolonnen med initiator (20 psi) under 0,2 min; skölj med gaspedalen (20 psi) under 0,5 min, injicera prover (0,5 psi) har laddats in i kolumnen för 0,09 min, separata proverna vid 20 kV under 12 minuter, skölj med NaOH (20 psi) under 0,5 min, och slutligen skölj med vatten ( 20 psi) under 0,5 min.
- using CE styrprogram, skriva provet körs sekvensen (dvs arbetslista, en lista fil med uppgifter om i vilken ordning prover kommer att analyseras, och den metod som skall användas för att separera varje prov) med hjälp av "sekvens" kalkylblad gränssnitt. Varje rad i det kalkylblad kommer att motsvara en provkörning och producera en enda datafil.
- Se till att när man skriver sekvensen filen tas prover identifieras med användning av rätt position i provtagningsbrickan. Se till att varje datafil har ett unikt namn för att förhindra programmet från att skriva över tidigare filer. Program CE kapillär konditione körs som en separat sekvens innan sekvensen körningen innehåller provet separationsmetoden.
- Börja provsekvensen körs med standardkurvan lösningar, följt av SCCA prover, och avslutas med en andra körning av standardkurvan lösningar. Detta kommer att möjliggöra en beräkning av graden av eventuella signalförlust som inträffar under provanalyser. </ Ol>
- using CE styrprogram, skriva provet körs sekvensen (dvs arbetslista, en lista fil med uppgifter om i vilken ordning prover kommer att analyseras, och den metod som skall användas för att separera varje prov) med hjälp av "sekvens" kalkylblad gränssnitt. Varje rad i det kalkylblad kommer att motsvara en provkörning och producera en enda datafil.
Tabell 1: Conditioning metod program som används för att förbereda kapillären för kortkedjig karboxylsyra separation via kapillärelektrofores a.
Tabell 2: Separationsmetod program som används för att analyserar kortkedjiga karboxylsyror via kapillärelektrofores a.
5. SCCA Detection Run Execution och datainsamling
- Initiera kapillära körningar konditionerande. Räkna med att påverka kapillär två eller tre gånger innan kolonnen är redo för provseparation. Kolonnkonditionering bör utföras som beskrivs i tabell 1. I korthet, skölj kolonnen med 0,1 M NaOH (20 psi) under 1 min, skölj med vatten (20 psi) under1 min, skölj med initiator (20 psi) under 0,5 min, sköljdes med gaspedalen (20 psi) under 0,5 min, separat accelerator vid 30 kV under 10 min, skölj kolonnen med 0,1 M NaOH (20 psi) under 0,5 min, och slutligen skölj kolonnen med vatten (20 psi) under 0,5 min.
- Konditionera kapillär före varje prov sekvenskörning. Uppnå rätt konditionering genom att hålla separations spänningen är konstant genom hela körningen och observera en platt baslinje på fotodioduppsättningen spår.
- Efter konditionering, initiera provseparation genom att öppna menyn "kontroll" i programmet och välja (dvs klicka på) "run sekvens." Övervaka fotodioduppsättningen (PDA) spår för att säkerställa korrekt separation.
- Observera första spår och se till att den har en plan baslinje och rent löst (baslinje upplösning), enskilda sura toppar. Över belastade prover kommer att visa lång topp svansar, eller topp svans, och kommer att behöva spädas (Figur 1).
Figur 1:. En jämförelse av PDA spår belyser en överbelastad prov Som koncentrationen ökar analyt får enskilda toppgeometri börjar bli asymmetrisk. Vid (a) 0,05 mg / ml, presenterar ättiksyra en väldefinierad, bilateralt symmetrisk topp. När koncentrationen av ättiksyra ökar till (b) 0,07 mg / ml och (c) 0,10 mg / ml, en topp svans former (pilar). Denna topp tailing är en bra indikation på att provet är överbelastad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Vid slutet av sekvensen sikt öppna datafiler en i taget i CE analysprogrammet och integrera topparna.
- Integrera prov toppar.
- Öppna den första filenoch ställa in de automatiska stegen integrations att utesluta den första 3 min av körningen (där spänningen, och därför riktningen av kolonnflödet, inverteras som beskrivs i tabell 1). I samma meny, ange topp urvalskriterier till ett minimum toppbredd på 50 enheter och topparean av 100 enheter (eller tillverkarens standardinställningar) för att ge en måttligt hög selektivitet, separera sura toppar från bakgrundsbrus i spåret.
- Kontrollera manuellt topp gränser och baslinjer för varje PDA spår för att säkerställa korrekt toppintegrering. Felaktigt integrerade toppar (dvs en något asymmetrisk SSCA topp som har integrerats som två separata toppar vid automatiserad programvara) måste återintegreras manuellt.
- Integrera prov toppar.
- Efter integration, visa rapporten procent området, markera och kopiera rapporten procent området och klistra in den på en separat kalkylblad. Upprepa för varje prov för att konstruera hela körningen topp report med varje rad representerar en enda topp (dvs., varje topp bör innehålla en enda förening, om separationen fungerar bra).
6. Dataanalys
- Förbereda data för analys med användning av kalkylbladet konstruerad i (5,4). Börja analys genom att märka syrastandarder för var och en av standardkurvan poäng, inklusive den inre standarden.
- Beräkna en retentionstid index för varje topp genom att dividera retentionstiden för varje topp i provet genom retentionstiden för den interna standarden i det provet. Sortera data som fastställts av den resulterande kvarhållande index för att identifiera topparna av intresse i varje prov.
- Efter att identifiera toppen för varje syra av intresse, konstruera standardkurvor för varje syra med hjälp av externa standard kurvpunkter.
- Generera en standard (koncentration) kurva för varje SCCA standard genom bestämning av topparean för varje koncentration av SCCA standarder, och som visar koncentration på xaXis vs. topparea på y-axeln. Rita den linjära regressionen för varje SCCA standardkurva och definiera lutningen ekvation (y = mx + b).
- Säkerställa att de R-2 värdena för de linjära regressionerna är 0,90 eller högre som de kvantifieringar är mest exakt utförs i det linjära området för standardkurvan.
- Beräkna syrakoncentrationen för ett givet SCCA i ett prov med användning av topparea och lutningen ekvationen för den linjära regressionslinjen för standardkurvan (beräknat i 6.3.2 ovan). Kortfattat, dividera den observerade topparean för en given syra av lutningen för regressionslinjen för det syra: s standardkurva.
- Rätta råkoncentrationsvärden som beräknats i steg 6,4 för provförlust under bearbetning med hjälp av intern standard (steg 6,5).
- Beräkna korrektionsfaktorn för varje prov med användning av den interna standarden.
- Dela den faktiska koncentrationen av inre standard (dvs known belopp läggas till i början av experimentet) av det observerade värdet av den interna standarden i provet (dvs det belopp som beräknas med hjälp av lutningen ekvationen för standardkurvan för den inre standarden). Multiplicera de råa koncentrationsvärdena för varje SCCA i provet genom denna korrektionsfaktor.
- Dela den interna standarden korrigeras SCCA koncentration av massan av det prov som används för extraktion för att korrigera för eventuella variationer i provmassan. Denna beräkning ger mängden analyt per massa av provet (mg SCCA per mg målet kaffe i detta exempel), som sedan kan omvandlas till lämpliga enheter för den givna studien (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
- Efter beräkning SCCA koncentrationer (normaliserad till antingen massa [för fasta eller flytande prover] eller volym [för vätskeprover]), använda dessa värden för statistisk analys enligt de krav som experimentell design och frågor av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har framgångsrikt används för att mäta effekterna av utsädes behandlingar på SCCA innehållet i gröna kaffefrön. I detta experiment, de sex behandlingar var: en mättad mikrobiell suspension av Leuconostoc pseudomesenteroides stam GCP674 i dess tillväxtmedium (1), en vattenhaltig suspension av GCP674 mikrober i vatten (2), en vattenlösning av ättiksyra och mjölksyra (0,15 och 0,4 mg / ml) (3), en förbrukad M1 odlingsmedium behandling (4), dH 2 O vatten (5), och en icke-behandlad kontroll (ingen ämnen som tillsätts frön) (6). Behandlingar applicerades och fick jäsa under 24 timmar. Fyra oberoende replikat bedömdes för varje behandling. Analys utfördes för citronsyra (C), äppelsyra (M), ättiksyra (A) och mjölksyra (L) syranivåer med användning av adipinsyra som en intern standard.
För varje SCCA och den interna standarden, standardkurvor som spänner than koncentrationsintervall förutsägs vara i kaffeprover (5, 10, 20, 40, 60, och 80 ng / l) genererades. Som väntat, varje syra uppvisade en linjär respons för detta koncentrationsområde med R-kvadratvärden av 0,9876 för citronsyra, 0,9987 för äppelsyra, 0,9998 för ättiksyra, och 0,9999 för mjölksyra. Den interna standarden (adipinsyra) uppvisade också en linjär respons över detta koncentrationsintervall, vilket ger ett R-kvadratvärde av 0,9984. Före analys, detektionsgräns (LOD) och gränserna för kvantifiering (LOQ) bestämdes för varje SCCA och den interna standarden (adipinsyra). Detektionsgränsen av citronsyra, äppelsyra, ättiksyra, och adipinsyra var 1 ng / ul; och LOD för mjölksyra var 2 ng / l. Gränsen för kvantifiering av citronsyra, adipinsyra, ättiksyra och mjölksyra var 4 ng / l; och LOQ för äppelsyra var 2 ng / l. För att beräkna procent återvinning SCCAs och adipinsyra, var kaffe spetsat med enskilda SCCAs eller adipinsyra och processed med användning av protokollet beskrivet ovan. Den procentuella återhämtningen beräknades sedan med hjälp av följande formel ([{topparea spetsade provet - topp provyta kontroll} / teoretisk topparean för beräknade koncentrationen av provet med tillsats {genereras genom att analysera buffert + SCCA / adipinsyra spik}] x 100) . Med användning av denna metod, vi beräknade procentåtervinningar på 106,08% ± 12,66 för citronsyra, 98,35% ± 1,15 för äppelsyra, 91,94% ± 3,07 för ättiksyra, 97,42% ± 1,48 för mjölksyra, och 100,19% ± 2,57 för adipinsyra.
För att bestämma precisionen hos metoden, inom och mellan dag variation av mätningar med CZE beräknades också. För att bestämma intra-day variabilitet prover av varje SCCA och adipinsyra mätt från en enda kaffe prov fem gånger över en 24-timmarsperiod, och koefficienterna variabilitet (COV, beräknas genom att dividera standardavvikelsen i topparea [eller koncentration] for varje SCCA med den genomsnittliga topparean [eller koncentration] för att SCCA, och sedan multiplicera resultatet med 100) för varje förening beräknades med hjälp av toppytan. För att bedöma betydelsen av korrigera prover med hjälp av den interna standarden, var variationskoefficient för varje SCCA också beräknas med hjälp av koncentrationerna av varje SCCA beräknas med hjälp adipinsyra som en intern standard. Som väntat, CZE-metoden kunde exakt mäta SCCAs och adipinsyra, med COVs av 3,02% för citronsyra, 2,64% för äppelsyra, 3,74% för ättiksyra, och 2,01% för adipinsyra (mjölksyra var lägre LOD / LOQ för alla kaffeprover mäts). Dessa mätningar upprepas över ett fem-dagars period, och CV sträckte sig från 2,11 till 5,25% för citronsyra, 2,01-5,32% för äppelsyra, 1,72-3,74% för ättiksyra, och 1,26-3,82% för adipinsyra. När topp områden korrigeras med hjälp av intern standard och beräknas koncentrationer av SCCA användes för att beräkna COVs de intradagexponeringar COVs varierade from 1,08-4,17% för citronsyra, 1,47-3,40% för äppelsyra, och från 2,68 till 5,10% för ättiksyra. För att bedöma mellan dag variabilitet var SCCAs i en enda kaffe prov mäts en gång per dag över en fem-dagars period. Detta experiment upprepades därefter fem gånger för varje SCCA och adipinsyra. COV för varje SCCA därefter beräknas genom att dividera standardavvikelsen i topparean (eller koncentration) för varje SCCA med genomsnittligt topparean (eller koncentration) för att SCCA och multiplicera med 100. För att bedöma betydelsen av korrigera prover med hjälp av den interna standard, COVs beräknades också med hjälp av koncentrationerna av varje SCCA beräknas med hjälp adipinsyra som en intern standard. CZE-metoden kunde tillförlitligt reproducera SCCA mätningar, med COVs sträcker sig från 5,24 till 10,02% för citronsyra, 6,55-9,47% för äppelsyra, 7,67-8,63% för ättiksyra, och 3,08-6,57% för adipinsyra. När topp områden korrigeras med hjälp av intern standard och beräknas koncentrationer av SCCA användes till calculated COVs, de inter-dag COVs varierade från 4,56 till 6,23% för citronsyra, 3,39-4,99% för äppelsyra, och 9,5 till 10,94% för ättiksyra.
Figur 2: Exempel PDA spår med toppar anges gröna kaffeprover späddes 1:10 innan de laddas i CE flaskor.. Syror av intresse är upptagna. Ättiksyra (A), citronsyra (C), mjölksyra (L), äppelsyra (M) och den interna standarden, adipinsyra (IS) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Statistisk analys utfördes på korrigerade syrakoncentrationer med hjälp av en allmän linjär modell (GLM) för att bestämma huruvida behandlingar förändras organiska syranivåer. En modell som innehåller "behandling" x "kör" (kodad som en slumpfaktor) var genomföran ted för GLM. Tukeys parvisa jämförelser vid 95% konfidens användes för att bestämma riktningen på förändringar.
Behandling förändrade SCCA koncentrationer i råkaffet. Ättiksyra var signifikant anrikad på alla behandlingar över ingen behandling kontroll (GLM, p <0,0001).
Figur 3:. Inverkan av behandling på organiska syranivåer i råkaffe behandling hade ingen effekt på (a) citronsyra eller äppelsyranivåer i råkaffe. Men alla behandlingar ökat kraftigt (b) Ättiksyra nivåer jämfört med ingen behandling kontroller (GLM, p <0,001). Ökningar i ättiksyra nivåerna var störst med mikroben + medel behandling. Bokstäver indikerar signifikant skillnad genom Tukeys parvisa jämförelser vid 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den största ökningen observerades i mikroben + medias behandling, som ökade 0,25 gånger (0,5 vs 0,4 mg / g kaffe i GCP674 vs NT). En liknande trend observerades i mjölksyrenivåer, även om de inte var signifikant annorlunda. Det fanns inga signifikanta förändringar eller trender i andra syror spårade (citronsyra och äppelsyra).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alla analysteknik, finns det flera viktiga faktorer som väsentligt kan påverka kvaliteten och tillförlitligheten hos de data som genereras. För det första är det viktigt att bearbeta prover effektivt, med ett minimum av frysnings / upptiningscykler. Upprepad frysning och upptining kan äventyra den kemiska sammansättningen av provet före bearbetning eller analys. För det andra är det viktigt att tillämpa stegen i detta protokoll till alla prover konsekvent och jämnt. Tekniska fel till följd av inkonsekvent provberedning och hantering kan avsevärt påverka kvaliteten på de data som genereras, och resulterar i ökad "brus" i SCCA mätningarna. Till exempel, kommer partikelstorleken hos provet efter-slipning påverka hastigheten och effektiviteten i SCCA extraktion. Det är därför viktigt att säkerställa att proven mals till en jämn partikelstorlek, eftersom detta kommer att upprätthålla extraktion effektivitet över prover och bidra till att minska prov till prov variabilitet. Similarly kommer noggrann mätning och pipettering under framställningen av standardlösningar, noggrann mätning av provmassorna, och noggrann övervakning (och normalisering) av utvinnings gånger resultera i generering av mer enhetliga uppgifter. Tar tid att noggrant normalisera, mäta och registrera var och en av dessa parametrar kommer att säkerställa tillförlitligheten av uppgifterna och möjliggöra noggrann post-run korrigering av data för eventuella bearbetningsfel som kan uppstå. För det tredje är det viktigt att välja och använda en lämplig intern standard. Beräkningar av den slutliga analyskoncentrationen är starkt beroende av korrekt korrigering baserad på toppytan av den interna standarden observerats i varje prov. På grund av detta, är det kritiskt att den inre standarden vara både noggrant och exakt mätas; och bör helst inte förekommer naturligt i provet eller sam-elueras med andra föreningar. Inte bara korrekt val och användning av en inre standard i alla prover gör det möjligt för forskare att kontrollera for förändringar i metabolitnivåer observerats på grund av skillnader i utvinning effektivitet; det också i hög grad förenklar nedströms bearbetning och toppidentifiering. Slutligen är det nödvändigt att övervaka toppidentifiering och integrationsprocessen. Medan automatiserade bearbetningsalgoritmer är användbara, de är inte perfekta. De data som genereras av denna teknik är beroende av riktigheten i integrationen, och spåren måste kontrolleras manuellt för att säkerställa kvaliteten på integration evenemang, särskilt definitionen av topp gränser och baslinjer.
Som med alla analysförfarandet, är det viktigt att slå fast att CZE metod som presenteras här är: a. korrekt: kunna bestämma mängden av ett givet SCCA närvarande; b. exakt: kan reproducerbart kvantifiera SCCAs inom samma dag och i mätningar som gjorts i flera dagar för analys; och c. robust: kan återhämta det mesta av SCCAs närvarande i proverna som analyseras. Som framgår ovan i de representativa resÜLTS, är den här beskrivna metoden i stånd att noggrant bestämma mängderna av SCCAs närvarande i prover. All SCCAs mätas (citronsyra, äppelsyra, ättiksyra, och mjölksyra) och inre standard (adipinsyra) uppvisade ett linjärt svar i 0-80 ng / ul koncentrationsområde. Dessutom är LOQs och bestämningsgränser för dessa syror sträckte sig 2-4 ng / l och 1-2 ng / l, respektive. Metoden var också exakt, eftersom alla SCCAs uppmätta och adipinsyra intern standard uppvisade låg intra-day variabilitet faller mellan 2,0-5,5% av den topp (eller mellan 1,0-5,2% av den beräknade koncentrationen) för alla SCCAs mätt. Den inter dagen variabilitet SCCA mätningar var också relativt lågt, som faller mellan 3,05-10,10% av topparean (eller mellan 3,30-10,95% av den beräknade koncentrationen) för alla SCCAs uppmätta. Intressant med undantag av ättiksyra, som genomgående var vid eller nära detektionsgränsen / kvantifiering i alla kaffeprover analyzed, korrigera prover med användning av adipinsyra som en inre standard gav mer reproducerbara mätningar och en minskning i den koefficient för variabilitet (se Representativa resultat, ovan). Dessa data överensstämmer med tidigare publicerade resultat tyder på att korrigering med en intern standard är viktig för att bibehålla precisionen i CE-analyser över tiden 16. Medan vissa metoder har sysselsatt oorganiska joner som en inre standard, ansåg vi att adipinsyra var en mer lämplig standard för CZE metod som presenteras här, eftersom det är en organisk syra och därför mer benägna att uppleva förlust i provberedningen steg liknande det som upplevs av SCCAs av intresse i provet. Adipinsyra hade de ytterligare fördelarna av att inte vara närvarande i de kaffeproverna som undersöks, som uppvisar en linjär respons över samma koncentrationer som användes för SCCAs i denna studie, som uppvisar relativt låg LOD / LOQ-värden (1 ng / | il och 4 ng / | il, respektive), enda hög procent återvinning från kaffe matrisen (100,19% ± 2,57), vilket gör det en användbar standard för kvantifiering SCCAs i kaffeprover. Intressant nog var den höga procentuella återhämtningen observeras för adipinsyra uppnås för alla organiska syror som uppmätts i denna studie, som uppvisade procentuella återhämtningen värden varierande från 91,94 till 106,08%. Dessa data indikerar att den CZE metod som presenteras här kan återhämta det mesta av SCCAs närvarande i kaffeprover.
Anpassa detta protokoll för nya provtyper kräver insamling av preliminära uppgifter, som bygger på litteratur eller empiriska bevis, om de förväntade mängderna av riktade analyter. Denna information kommer att hjälpa den experimentella designen, provberedning och standard kurvkonstruktion. Fastställande av rätt provspäd att använda lätt kan åstadkommas empiriskt genom att köra en utspädningsserie av en testlösning för att hitta en väl fungerande utspädning. Detta protokoll har utformats för att detekteraSCCAs beskrivs i exempel resultat, men det kan lätt anpassas för att detektera andra SCCAs genom att ändra separationsparametrar, såsom separation spänning, tryck, eller tid. Det är viktigt att komma ihåg dock att ändra separationsparametrarna kan ändra antalet körningar som kan åstadkommas på en enda uppsättning av separationsbuffertar eftersom dessa buffertar bryts ner med användning. Baseline nedbrytning eller förändringar i nuvarande ofta manifestationer av över användas / utarmade buffertar. Ersätter löpbufferten och rekonditionering kapillären kan ofta lösa dessa problem. Efter långvarig användning, kommer förmågan hos kapillären för att lösa analyter minskar också. Minskad baslinjen stabilitet, drastiska förändringar i uppehållstid och minskad toppupplösning är alla tecken på att kapillär kan behöva bytas ut. Det är också möjligt att ta emot en tryckfelet på grund av felaktig tätning mellan flaskan provet och kapillären på grund av en illasittande ampull mössa eller en defekt ampull. Säkerställalocken passar tätt in i provflaskor för att förhindra det här felet.
Traditionellt har kromatografiska metoder såsom GC-MS, GC-FID eller HPLC använts för att detektera SCCAs i ett brett spektrum av matriser, inklusive luft, vatten, jord och växtprover 14. Medan effektiv, är en stor nackdel i dessa metoder behovet att derivatisera SCCAs före detektering. Derivatisering använder farliga reagens detektionsgränsen ofta påverkas av effektiviteten i derivatiseringsreaktion 13,14. Detektion av icke-derivatiserad SCCAs genom CZE undviker analyt förlust under bearbetning, exponering för farliga derivatiserande medel, och minskar prov förberedelsetid. Dessa fördelar kan ses i de höga procentuella återvinningsprocent (på mellan 91,94 till 106,08%), beräknat för alla SCCAs uppmätt i denna studie. Dessutom, CZE kvantifiering av SCCAs uppnår detektionsgränser som är jämförbara med de som rapporterats i litteraturen för GC-MS, GC-FID, och HPLC, i intervallet Of delar per miljon till ppb 13,14. I kombination med hög hastighet körtider, högupplösande separation kraft, rakt framåt provbehandlingsprotokoll som används av denna analysmetod, känslighet och bekvämlighet CZE göra det till ett attraktivt alternativ till traditionella GC eller HPLC-metoder.
Det är dock viktigt att notera att medan CZE ger flera fördelar jämfört med GC-MS HPLC eller LC-MS / MS baserade metoder för SCCA analys, är det inte lämpligt för alla SCCA analyser. Till exempel, eftersom CZE metod som beskrivs här enbart förlitar sig på spektrofotometrisk detektion, det tillåter inte för att identifiera okända SCCAs närvarande i provet, eller bekräftelse av SCCA identitet via masspektrala profilering. På grund av detta, skulle GC-MS eller LC-MS / MS-metoder vara bättre lämpad för SCCA analyser i prover som innehåller ett stort antal okända SCCAs, eller prover där det är viktigt att bekräfta identiteten hos alla SCCAs närvarande.Dessutom, som tidigare rapporterats LC-MS / MS-baserade metoder möjliggör lägre detektionsgräns (Lods) -on genomsnitt 0,05 mikrogram / ml för LC-MS / MS 17 vs. den 1 | j, g / ml för CZE erhölls med användning av den metod som presenteras här-LC-MS / MS baserad kvantifiering av SCCAs kan vara mer lämplig för prover i vilka SCCAs är närvarande i mycket låga eller spårmängder.
Protokollet som presenteras här fokuserar på utvinning och kvantifiering av kortkedjiga karboxylsyror (SCCAs) från växtvävnader. Erhålla kunskaper i denna teknik kommer att öppna dörren till ett brett spektrum av tillämpningar av denna teknik för den enskilde forskaren. Denna teknik, med endast små variationer i metodiken har använts med framgång i analysen av SCCAs i en skiftande population av prover och substrat, som sträcker sig från livsmedelsprodukter och vävnadsprover för omgivnings vatten och jordprover 8. Dessutom, få kännedom om kemiska principer som ligger till grunddenna teknik även om detta protokoll kommer att ge forskare med den kunskapsbas som krävs för att försöka analysen av andra föreningar, såsom kolhydrater eller metaller 8,13. Den analytiska flexibilitet kapillärelektrofores gör det till ett utomordentligt kraftfullt verktyg som lämpar sig för en myriad av experimentella applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
