Summary
Denne artikel præsenterer en metode til påvisning og kvantificering af organiske syrer fra plantemateriale ved hjælp af gratis zoner kapillarelektroforese. Et eksempel på den mulige anvendelse af denne fremgangsmåde, bestemmelse af virkningerne af en sekundær fermentering af organiske syre niveauer i kaffe frø, er tilvejebragt.
Abstract
Carboxylsyrer er organiske syrer, som indeholder et eller flere terminale carboxylgruppe (COOH) funktionelle grupper. Kortkædede carboxylsyrer (SCCAs; carboxylsyrer indeholdende tre til seks carbonatomer), såsom malat og citrat, er afgørende for et velfungerende mange biologiske systemer, hvor de fungerer i cellulær respiration og kan tjene som indikatorer for celle sundhed. I fødevarer, kan organisk syre indhold har betydelig indvirkning på smag, med øgede SCCA niveauer resulterer i en sur eller "syre" smag. På grund af dette, fremgangsmåder til hurtig analyse af organiske syre niveauer er af særlig interesse for fødevare- og drikkevareindustrien. Men desværre fleste metoder til SCCA kvantificering er afhængige af tidskrævende protokoller kræver derivatisering af prøver med farlige reagenser, efterfulgt af dyr kromatografisk og / eller massespektrometriske analyser. Denne metode beskriver en alternativ metode til påvisning og kvantificering af orgAnic syrer fra plantemateriale og fødevareprøver ved hjælp af gratis zoner kapillarelektroforese (CZE), undertiden blot kaldet kapillarelektroforese (CE). CZE tilbyder en omkostningseffektiv metode til måling SCCAs med en lav detektionsgrænse (0,005 mg / ml). Denne artikel beskriver udvinding og kvantificering af SCCAs fra vegetabilske prøver. Mens metoden fokuserer på måling af SCCAs fra kaffebønner kan fremgangsmåden billede anvendes til flere plantebaserede fødevarematerialer.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Saml prøver til kortkædet carboxylsyre (SCCA) ekstraktion. Forbered 1,0 g kaffe frø ad gangen for at sikre, at nok prøve vil forblive efter forarbejdning.
- Hvis prøverne blev frosset forud for slibeprocessen, holde vævet frosset hele behandlingen for at forhindre frysning / optøning og prøve oxidation. Fjern prøven fra fryseren eller sub-zero lagring kun behov for slibning.
- Flash fryse friske prøver i flydende nitrogen umiddelbart før prøve slibning. For at minimere prøvehåndtering, flash fryse prøverne ved at placere dem i en morter fyldt med flydende nitrogen.
- Analyser flydende prøver umiddelbart efter generation, eller flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -20 ºC eller -80 ºC indtil analyse. Før analyse fjerne frosne prøver fra lagring og tillade at tø. For flydende prøver fortsætte til trin (3.5) til forarbejdning.
- Wear hensigtsmæssigt personlige værnemidler (herunder sikkerhedsbriller, handsker og kittel) før arbejde med flydende nitrogen.
- Triple-Grind vævsprøver til en ensartet fint pulver (dvs. med ensartet partikelstørrelse) i flydende nitrogen under anvendelse af en keramisk morter og støder.
BEMÆRK: At opnå en ensartet partikelstørrelse er vigtig for maksimering SCCA ekstraktionseffektivitet.- Pre-chill morter og støder med flydende nitrogen før tilsætningen af prøven. Hold mørtel fyldt med et lille volumen af flydende nitrogen som tilsættes prøven.
- Ved hjælp af en øse, tilføje nok flydende nitrogen til mørtel til helt nedsænkes prøven.
- Tilføj nemt formalede prøver, såsom blade eller ristet kaffe, til den flydende nitrogen og knuse med en cirkulær slibning bevægelse. Begynde at slibe prøver, når nitrogenet niveau væske er faldet til det punkt, hvor det lige knap dækker prøverne.
- Tilføj svært at slibe prøver, såsom ens rå kaffe frø, til flydende nitrogen og give dem mulighed for at fryse i 10-30 sek (eller indtil flydende nitrogen stopper kraftigt kogende) inden formaling. Bryd vævet ind i mindre fragmenter ved hjælp af en lodret knusning bevægelse, og derefter færdigt væv slibning ved hjælp af en cirkulær slibning bevægelse.
- Gentag trin 1.3.2-1.3.4 to gange mere, sådan at prøverne formales i alt tre gange. Typisk vil tre successive slibning reducere prøver til et pulver med en mel-lignende konsistens.
- Hvis en mel-lignende konsistens ikke er nået, gentages trin 1.3.2-1.3.4 indtil prøverne er reduceret til et pulver med ensartet lille partikelstørrelse (ekstraktionseffektivitet er omvendt proportional med partikelstørrelse).
- Overfør pulver til hætteglas eller 1,5 ml mikrocentrifugerør. Indled nedstrøms behandling umiddelbart efter slibning (anbefales), eller opbevare prøver ved -80 ºC indtil prøver er klar til udvinding.
- Hvis prøverne skal opbevares føranalyse, opdele prøven i 500 mg portioner (eller 500 pi prøver til flydende prøver) og delt mellem flere rør til opbevaring. Undgå at udsætte prøver gentagne fryse / tø cykler, da disse kan ændre prøven sammensætning og negativt påvirke de fremtidige prøve målinger.
2. Økologisk Acid standardpraeparat
- Saml autentiske standarder for SCCAs af interesse. Disse vil blive anvendt til at oprette eksterne og interne standardopløsninger til anvendelse ved bestemmelse SCCA koncentrationer. Til kaffe prøver indbefatter citronsyre, æblesyre, eddikesyre, og mælkesyre som syrer af interesse og adipinsyre som den interne standard.
- Sørg for sikker på, at den interne standard valgt ikke findes naturligt i prøven, og at standarden ikke co-elueres med andre toppe i prøven profil.
- Kør standardkurver for hver SCCA af interesse, og bestemme den lineære respons interval for hver SCCA (se afsnit 4 for at køre instballade). Sørg for at køre standardkurver for hver SCCA der skal måles i prøven.
BEMÆRK: Standardkurver kan køres i enten buffer eller på baggrund af den prøve, der skal analyseres. I det andet tilfælde ( "standard addition"), vil værdier for toparealet for hver standardkurve punkt bestemmes ved subtraktion væk baggrunden af prøven. - Pre-label alle rør og glasvarer nødvendige med SCCA syre navn, koncentration, og datoen for analysen.
- Forbered stamopløsninger for hver standard ved en kendt koncentration (10 mg / ml) under anvendelse af en målekolbe at sikre nøjagtighed under standard forberedelse.
- Opløs faste SCCA standarder (citronsyre og æblesyre) i ultrarent vand (18,2 MOhm) for at opnå den ønskede for stamopløsningen koncentration.
- Opret en 10 mg / ml stamopløsning ved tilsætning af 100 mg standard til en 10 ml målekolbe. Fyld målekolben til 10 ml linje med ultrarent vand til dissolve syren.
- Lav en lavere koncentration af syre standard eller opvarmes forsigtigt kolberne at drive vanskelige at opløse SCCA standarder, som adipinsyre, i opløsning.
- Fortynd flydende fase syre standarder (eddikesyre og mælkesyre), i ultrarent vand for at opnå den ønskede koncentration.
- en målekolbe Pre-fyld med 5 ml ultrarent vand. Tilføj nok syre til at forberede en 10 mg / ml opløsning (beregnet ved hjælp af syrevægtfylde leveres af sælgeren) til kolben, og derefter tilføje vand nok til at bringe det endelige volumen af opløsningen til 10 ml.
- Opløs faste SCCA standarder (citronsyre og æblesyre) i ultrarent vand (18,2 MOhm) for at opnå den ønskede for stamopløsningen koncentration.
- Overfør hver stamopløsning til en ren 15 ml reagensglas, med en polytetrafluorethylen (PTFE) foret hætte, og forsegle med plastik paraffin film. Stamopløsninger kan opbevares i forseglede rør ved 4 * C i 1 uge.
- Sørg for, at SCCA standarder ikke er udfældet af før brug løsning, hvis stamopløsninger er nedkølet efter preparation. Drive udfældes tilbage i opløsning gennem blid opvarmning.
- Forbered SCCA udvinding løsning. Indbefatter den interne standard i en koncentration tilstrækkelig til påvisning i prøverne (0,05 mg / ml). Forbered nok løsning til at udtrække alle prøver.
- Forbered 50 ml SCCA ekstraktionsopløsning ved fortynding af intern standard stamopløsning til 0,05 mg / ml i ultrarent vand. Tilsættes 250 pi af den interne standard-stamopløsning (10 mg / ml) til 49,75 ml vand.
- Hvis ekstraktet skal fortyndes, justere den interne standard koncentration i ekstraktionsopløsningen således at den endelige koncentration vil falde inden for rammerne af kvantificering (hvilket giver en påviselig, men ikke over-mættet, peak, se 5.2.2 nedenfor) af det CE-systemet efter fortynding (0,05 mg / ml).
- Forbered frisk udsugningsløsning for hver serie af ekstraktioner (dvs. for hver forsøgsrække).
- Forbered standardkurveprøver(En serie af passende fortyndinger) for SCCAs af interesse, under anvendelse af en minimum mindst 5 point. Standardkurven anvendte koncentrationer skal være i det lineære respons interval for en given SCCA, og spænder SCCA koncentrationer forventes i prøverne.
- Medtag den valgte interne standard i standardkurven løsninger til at tillade kvantificering af den interne standard i prøver. Den interne standard vil blive brugt til at støtte i peak identifikation og beregning udsugningseffektivitet (afsnit 6).
- Fortyndes SCCA for koncentrationerne bestemt ovenfor (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml; se ovenfor, 2.4.2) i nye mikrocentrifugerør (en for hver koncentration / standardkurve punkt) under anvendelse ultrarent vand. Forbered 1 ml opløsning for hver standardkoncentrationskurve punkt. Sikre, at hver koncentration punkt indeholder alle fire sure standarder og den interne standard i den korrekte koncentration.
- Forbered nye standard kurve point for hvert sætprøver, der skal køres på kapillarelektroforesesystem. Hold standard kurve SCCA prøver ved 4 ºC indtil analyse, som vil forekomme efter udvinding af SCCAs fra målvæv (afsnit 3).
3. Organisk syreekstraktion
- Pre-label prøveglas, forbereder mindst et rør for hver prøve, der skal udvindes.
- Fjern prøver, der skal ekstraheres fra lageret og placere dem på is under vejningen ud materiale til ekstraktion.
- Afvejes 100 mg af prøven til SCCA udvinding.
- Efter vejning af hver prøve, overføre vævet til en ren 1,5 ml mikrocentrifugerør. Afmål en mængde af prøven, som tæt på målet masse som muligt for at reducere variabilitet.
- Hold styr på massen af hver prøve måles som mængden af SCCAs detekteres vil normaliseres ved hjælp af prøven masse (se 6.5.2 nedenfor).
- Efter vejning alle prøver, tilsættes 1 ml ekstraktionsmiddel (den water + intern standard blandingen fra trin 2.4) til hver af prøverørene. Hold forholdet mellem udvinding løsning på vævsmasse den samme på tværs af alle ekstraktioner (i dette tilfælde 1 ml til 100 ± 5 mg væv). Bland godt ved vortex i 10 sek.
- Tillad prøver at henstå ved stuetemperatur i 1 time. Under denne time, bland hvert rør hver 15 min som i trin 3.4.
- Efter 1 time af udvinding, blande prøverne en sidste gang og overføre prøveglas til en mikrocentrifuge. Centrifugér prøver ved 4 ° C, til 10.000 xg i 10 min udfælde fast materiale (cellevægge, partikler etc.).
- Ved behandling væskeprøver, tilsættes en passende koncentration af intern standard, bland kortvarigt og centrifugeres. Efter centrifugering behandle flydende prøver identisk med uddrag af faste prøver.
- PH kontrolleres af prøverne for at bekræfte, at de er forenelige med pH-området løbebufferen i afsløring kit (trin 4.6) eller buffer systemet er employed. Da prøvevolumener er normalt ganske små, kan pH overvåges ved hjælp pH-papir.
- Forbered dig på at filtrere prøver ved anvendelse af sprøjte monteret disk filtre (3,8).
BEMÆRK: Undgå prøvetab ved at sikre, at hvert filter er korrekt fastgjort til en sprøjte, før du overfører supernatant. Forbered en sprøjte udstyret med en disk filter for hver prøve, der skal analyseres (herunder standard kurve prøver). - Efter centrifugering af prøver og forberedelsen af sprøjtefiltre, overføre supernatanten fra hver prøve til en 3 ml sprøjte med en 0,2 um sprøjtefilter. Brug et nyt filter og sprøjte til hver prøve. Filter alle prøver, herunder standard kurve prøver og buffer kontroller forud for at køre på CE-systemet.
- Foretage prøven direkte til et rent mikrocentrifugerør. Efter filtrering, lukke rør indeholdende filtrat og kassér sprøjten / filter apparat.
- Anbring straks filtrerede prøverind i CE-systemet for SCCA påvisning eller gemmer prøver ved 4 ° C natten over. Hvis prøverne skal opbevares natten over, forsegle rørene med plastik paraffin film for at forhindre gas udveksling og prøve fordampning.
- Hvis prøverne skal opbevares længere end en dag efter filtrering, flash fryse ekstrakter i flydende nitrogen eller fryse ved -20 ºC. Efter optøning dog sikre, at hver prøve undersøges for dannelse af bundfald og filtreres om nødvendigt (som i trin 3.6).
4. Opsætning af scca Detection Run
- Rådfør CE brugervejledningen for programmerings- og styringssoftware-specifikke detaljer.
- Forbered kapillar elektroforese (CE) prøve hætteglas for SCCA detektion. Sørg hætteglas mærkes korrekt, rene og fri for fejl.
- Vask og tør hætterne af CE hætteglas før brug.
- Vask hætter ved at nedsænke dem i ultrarent vand og lade dem blød natten over. Efter iblødsætning hætterne, kasseres sættetiding løsning og skyl hætterne to gange mere med ultrarent vand.
- Overførsel skyllet hætter til en ren tørring overflade foret med fnugfri væv og tillade dem at lufttørre. Sørg caps er helt tørre før brug for at undgå tryk fiaskoer.
- Overfør 1 ml prøve til hver CE hætteglas, være omhyggelig med at undgå uheld sprøjt prøven i halsen af hætteglasset. Efter overførsel, placere en CE hætte på hvert hætteglas.
- Hvis der er behov en fortynding, fortynde kaffe frøprøver 1:10 eller 1: 100 direkte i CE hætteglasset ved hjælp ultrarent vand. For fortyndinger større end 1: 100, oprette en mellemliggende fortynding for at undgå pipetteringsfejl.
- Forbered et hætteglas for hvert standardkurve punkt ved at overføre standardkurveprøver opløsninger (1,0 ml) fra trin 2,5 til CE hætteglas. Cap hvert rør efter overførsel.
- Der fremstilles en 0,1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH) ved tilsætning af 0,04 g NaOH til et bægerglas indeholdende 90 ml ultrarent vand og lade pelletene to opløses. Overfør 0,1 M NaOH-opløsning til en 100 ml målekolbe og bringe det totale volumen til 100 ml.
- Der tilsættes 1 ml 0,1 M NaOH-opløsning til et rent CE hætteglas og hætte.
- Forbered CE buffer hætteglas for hver batch af prøver, der skal køre på CE-systemet. Separation kits er tilgængelige eller brugerdefinerede buffere kan bruges 13.
- Forbered 1 hætteglas med 1 ml start bufferopløsning og hætte.
- Forbered tre hætteglas med 1 ml af hver af løbebuffer opløsning og hætte. Udskift kører buffer inden hver batch af prøver og standard kurve punkter, eller efter 35 prøver, alt efter hvad der indtræffer først.
- Fyld tre yderligere hætteglas med 1 ml ultrarent vand og hætten hvert hætteglas.
- Forbered en tom "affald" hætteglas med hætte.
- Efter fremstilling hætteglassene er beskrevet i trin 4.8, indlæse hætteglassene indeholdende buffere og vand, samt affald hætteglas (fra trin 4.8.2-5) ind i bufferen bakke af kapillarelektroforese system, som ifølge producentens anvisninger 15. Læg nøje mærke til positionen af hvert hætteglas for auto-sampler programmering.
- Indlæse hætteglassene indeholdende Standardkurven punkter, og hætteglassene indeholder prøverne, der skal analyseres i indløbet prøvebakke, som beskrevet i producentens instruktioner. Bemærk placeringen af hvert hætteglas for auto-sampler programmering (se trin 4.11.1 nedenfor).
- Forbered condition og prøve separationsmetoder (programmer for disse leveres i tabel 1 og 2, henholdsvis), og skrive en prøve sekvens fil som pr instrument betjeningsvejledning. Brug separationsmetode beskrevet i Tabel 2: skyl søjlen med initiator (20 psi) i 0,2 minutter; skyl med accelerator (20 psi) i 0,5 min, injicere prøver (0,5 psi) på søjlen for 0,09 min, separate prøver ved 20 kV i 12 minutter, skylles med NaOH (20 psi) i 0,5 min, og til sidst skylles med vand ( 20 psi) i 0,5 min.
- Using CE kontrol software, skriv prøven kører sekvens (dvs. arbejdslisten, en filliste beskriver den rækkefølge, som de prøver, vil blive analyseret, og den metode, der skal anvendes til at separere hver prøve) ved hjælp af "sekvens" regneark interface. Hver række i regnearket vil svare til en prøve køre og producere en enkelt datafil.
- Sørg for, at når du skriver sekvensen fil, prøver identificeres ved hjælp af den korrekte position i prøvetagning bakken. Sørg for, at hver datafil har et unikt navn for at forhindre, at software fra at overskrive tidligere filer. Program CE kapillær conditioning kører som en separat sekvens forud for sekvensen løb med prøven adskillelsesmetode.
- Begynd prøven sekvens køre med standardkurven løsninger, efterfulgt af SCCA prøver, og slutter med en anden kørsel af standardkurven løsninger. Dette vil muliggøre en beregning af graden af ethvert signal tab opstår under analyseresultater. </ Ol>
- Using CE kontrol software, skriv prøven kører sekvens (dvs. arbejdslisten, en filliste beskriver den rækkefølge, som de prøver, vil blive analyseret, og den metode, der skal anvendes til at separere hver prøve) ved hjælp af "sekvens" regneark interface. Hver række i regnearket vil svare til en prøve køre og producere en enkelt datafil.
Tabel 1: Conditioning metode program anvendt til fremstilling af kapillære for kortkædet carboxylsyre separation via kapillarelektroforese en.
Tabel 2: Separation metode program anvendes til analyser kortkædede carboxylsyrer via kapillarelektroforese en.
5. SCCA Detection Run Udførelse og dataindsamling
- Indled kapillar conditioning kørsler. Forvent at konditionere kapillarrøret to eller tre gange, før kolonnen er klar til prøve separation. Kolonne konditionering skal udføres som beskrevet i tabel 1. Kort fortalt, skylles søjlen med 0,1 M NaOH (20 psi) i 1 min, skylles med vand (20 psi) i1 min, skylles med initiator (20 psi) i 0,5 min, skyllet med accelerator (20 psi) i 0,5 min, separat accelerator ved 30 kV i 10 minutter, skylles søjlen med 0,1 M NaOH (20 psi) i 0,5 min, og endelig skylles søjlen med vand (20 psi) i 0,5 min.
- Konditionere kapillær før hver prøve sekvens løb. Opnå ordentlig condition ved at holde adskillelse spænding er konstant under hele kørslen og observere en flad baseline på fotodiodearray spor.
- Efter konditionering, initiere prøve separation ved at åbne menuen "kontrol" i softwaren og vælge (dvs. at klikke på) "køre sekvens." Overvåg fotodiode array (PDA) spor for at sikre korrekt adskillelse.
- Overhold den første spor og sikre, at den har en flad baseline og rent løst (baseline opløsning), enkelte sure toppe. Over-loaded prøver vil vise lange peak haler, eller peak hale, og bliver nødt til at blive fortyndet (figur 1).
Figur 1:. En sammenligning af PDA er spor fremhæve en overbelastet prøve Som analyt koncentrationen stiger, kan individuel peak geometri begynder at blive asymmetrisk. Ved (a) 0,05 mg / ml, eddikesyre præsenterer en veldefineret, bilateralt symmetrisk top. Efterhånden som koncentrationen af eddikesyre stiger til (b) 0,07 mg / ml og (c) 0,10 mg / ml, en top hale former (pile). Denne top hale er en god indikation af, at prøven er overbelastet. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Ved afslutningen af sekvensen run, åbne datafiler en ad gangen i CE analyse software og integrere toppene.
- Integrer prøve toppe.
- Åbn den første filog indstille de automatiske trin integration at udelukke første 3 min af kørslen (hvor spændingen, og derfor retningen af kolonnen flow, vendes som beskrevet i tabel 1). I den samme menu, sæt udvælgelseskriterier peak til et minimum top bredde på 50 enheder og peak areal på 100 enheder (eller producentens standardindstillinger) for at give et moderat højt selektivitet, der adskiller syre toppe fra baggrundsstøjen i spor.
- kontrollere manuelt peak grænser og basislinjer for hver PDA spor for at sikre korrekt peak integration. Forkert integrerede toppe (dvs. en lidt asymmetrisk SSCA peak, der er blevet integreret som to separate toppe ved automatiserede software) vil være nødvendigt at re-integreres manuelt.
- Integrer prøve toppe.
- Efter integration, se rapporten procent område, så markere og kopiere rapporten procent område og indsætte det i en separat regneark. Gentag for hver prøve at konstruere den fuld køre peak REPORt med hver række repræsenterer en enkelt top (dvs.., for hver top indeholde en enkelt forbindelse, hvis adskillelsen fungerer godt).
6. Data Analysis
- Forbered data til analyse ved anvendelse af regnearket konstrueret i (5.4). Begynd analyse ved at mærke de sure standarder for hver af standardkurven punkter, herunder den interne standard.
- Beregne en tilbageholdelse indeks for hver enkelt top ved at dividere retentionstiden for hver top i prøven ved retentionstiden for den interne standard i denne prøve. Sortere datasættet af den deraf fastholdelse indeks til at identificere toppene af interesse i hver prøve.
- Efter identificering af toppen for hver syre af interesse, konstruere standardkurver for hver syre under anvendelse af de eksterne standard curve point.
- Generer en standard (koncentration) kurve for hver SCCA standard ved at bestemme arealerne for hver koncentration af SCCA standarder, og viser koncentration på xaxis vs. topareal på y-aksen. Plot den lineære regression for hver SCCA standardkurve og definere hældning ligning (y = mx + b).
- Sikre, at R 2 værdier af de lineære regressioner er 0,90 eller højere, da de kvantificeringerne er mest nøjagtigt udført i det lineære område af standardkurven.
- Beregn syrekoncentrationen i en bestemt SCCA i en prøve under anvendelse af toparealet og hældningen ligningen for den lineære regressionslinje af standardkurven (beregnet i 6.3.2 ovenfor). Kort fortalt opdele den observerede arealerne for en given syre ved hældningen på regressionslinien for at syre standard kurve.
- Ret de rå koncentrationsværdier beregnet i trin 6.4 for prøve tab under behandling ved hjælp af den interne standard (trin 6.5).
- Beregn korrektionsfaktoren for hver prøve ved hjælp af den interne standard.
- Opdele den faktiske koncentration af den interne standard (dvs. known beløb tilsat ved begyndelsen af eksperimentet) ved den observerede værdi for den interne standard i prøven (dvs. det beløb beregnet ved anvendelse hældningen ligning af standardkurve for den interne standard). Gang de rå koncentrationsværdier af hver SCCA i prøven ved denne korrektionsfaktor.
- Opdel den interne standard korrigeret SCCA koncentration ved massen af den prøve, der anvendes til udvinding til at korrigere for enhver variation i prøven masse. Denne beregning giver mængden af analyt pr massen af prøven (mg SCCA per mg malet kaffe i dette eksempel), der derefter kan omdannes til de passende enheder for den givne undersøgelse (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
- Efter beregning SCCA koncentrationer (normaliseret til enten massen [for faste eller flydende prøver] eller volumen [for flydende prøver]), bruge disse værdier til statistisk analyse som pr kravene fra eksperimentelle design og spørgsmål af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er blevet anvendt til at måle effekterne af frø behandlinger på SCCA indhold af grøn kaffe frø. I dette forsøg var de seks behandlinger var: en mættet mikrobiel suspension af Leuconostoc pseudomesenteroides stamme GCP674 i dens vækstmedium (1), en vandig suspension af GCP674 mikrober i vand (2), en vandig opløsning af eddikesyre og mælkesyre (0,15 og 0,4 mg / ml) (3), en brugt M1 vækstmedium behandling (4), dH2O vand (5), og en ubehandlet kontrol (intet stof tilsat til frø) (6). Behandlinger blev påført og fik lov at gære i 24 timer. Fire uafhængige replikater blev vurderet for hver behandling. Analyse blev udført for citronsyre (C), æblesyre (M), eddikesyre (A) og mælkesyre (L) syre niveauer under anvendelse adipinsyre som en intern standard.
For hver SCCA og den interne standard, standardkurver spænder than koncentrationsområde forudsiges at være i kaffe prøver (5, 10, 20, 40, 60 og 80 ng / pl) blev genereret. Som forventet, hver syre udviste en lineær respons for dette koncentrationsområde med R-squared værdier på 0,9876 for citronsyre, 0,9987 for æblesyre, 0,9998 til eddikesyre, og 0,9999 for mælkesyre. Den interne standard (adipinsyre) udviste også en lineær respons over dette koncentrationsområde, hvilket gav en R-kvadreret værdi på 0,9984. Forud for prøve analyser blev detektionsgrænser (LOD) og grænserne for kvantificering (LOQ) bestemt for hver SCCA og den interne standard (adipinsyre). Detektionsgrænsen af citronsyre, æblesyre, eddikesyre, og adipinsyre var 1 ng / pl; og LOD for mælkesyre var 2 ng / pl. Grænsen for kvantificering af citronsyre, adipinsyre, eddikesyre, og mælkesyre var 4 ng / pl; og LOQ for æblesyre var 2 ng / pl. For at beregne procent opsving SCCAs og adipinsyre, blev kaffe tilsat individuelle SCCAs eller adipinsyre og processed under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor. Den procent opsving blev derefter beregnet ved hjælp af følgende formel ([{toparealet spiked prøve - toparealet kontrolprøve} / teoretisk topareal af beregnede koncentration af spidse prøve {genereres ved at analysere buffer + SCCA / adipinsyre spike}] x 100) . Under anvendelse af denne metode, vi beregnede procentvise genfindelse af 106,08% ± 12.66 for citronsyre, 98,35% ± 1,15 for æblesyre, 91.94% ± 3,07 for eddikesyre, 97,42% ± 1,48 for mælkesyre og 100,19% ± 2,57 for adipinsyre.
Til bestemmelse af nøjagtigheden af metoden, den intra- og inter-dag-variation af målinger foretaget ved hjælp af CZE blev også beregnet. Til bestemmelse intra-dag-variation, blev prøver af hver SCCA og adipinsyre målt fra en enkelt kop kaffe prøve fem gange over en 24-timers periode, og koefficienter af variation (COV, beregnet ved at dividere standardafvigelsen i topareal [eller koncentration] for hver SCCA med det gennemsnitlige topareal [eller koncentration] for at SCCA, og derefter gange resultatet med 100) for hver forbindelse blev beregnet ved anvendelse toparealet. For at vurdere vigtigheden af at korrigere prøver med det interne standard, blev koefficienten af varians for hvert SCCA også beregnet under anvendelse af koncentrationer af hver SCCA beregnet med adipinsyre som en intern standard. Som forventet, CZE metode var i stand til præcist at måle SCCAs og adipinsyre, med COVs af 3,02% til citronsyre, 2,64% for æblesyre, 3,74% for eddikesyre, og 2,01% for adipinsyre (mælkesyre var under LOD / LOQ for alle kaffe prøver målt). Disse målinger blev gentaget over en periode på fem dage, og de CV'er varierede fra 2,11 til 5,25% for citronsyre, 2,01-5,32% for æblesyre, 1,72-3,74% for eddikesyre, og 1,26-3,82% for adipinsyre. Når toparealer blev korrigeret ved hjælp af den interne standard og beregnet koncentrationer af SCCA blev brugt til at beregne COVs, de intradag-COVs varierede from 1,08-4,17% for citronsyre, 1,47-3,40% for æblesyre og 2,68-5,10% for eddikesyre. For at vurdere inter-dag-variation, blev SCCAs i en enkelt kop kaffe prøve målt én gang om dagen over en periode på fem dage. Dette eksperiment blev derefter gentaget fem gange for hver SCCA og adipinsyre. Den COV for hver SCCA blev derefter beregnet ved at dividere standardafvigelsen i topareal (eller koncentration) for hver SCCA med det gennemsnitlige topareal (eller koncentration) for at SCCA og gange med 100. For at vurdere betydningen af at korrigere prøver ved hjælp af den interne standard, COVs blev også beregnet under anvendelse af koncentrationer af hver SCCA beregnet med adipinsyre som en intern standard. Den CZE metode var i stand til pålideligt at reproducere SCCA målinger med COVs spænder fra 5.24-10.02% for citronsyre, 6,55-9,47% for æblesyre, 7,67-8,63% for eddikesyre, og 3,08 til 6,57% for adipinsyre. Når toparealer blev korrigeret ved hjælp af den interne standard og beregnet koncentrationer af SCCA blev brugt til calculated COVs, de inter-dages COVs varierede fra 4,56 til 6,23% for citronsyre, 3,39-4,99% for æblesyre, og fra 9,5 til 10,94% for eddikesyre.
Figur 2: Eksempel PDA spor med toppe angivet Grøn kaffe prøver blev fortyndet 1:10, før du lægger ind CE hætteglas.. Syrer af interesse er angivet:. Eddikesyre (A), citronsyre (C), mælkesyre (L), æblesyre (M) og den interne standard, adipinsyre (IS) Klik her for at se en større version af denne figur.
Statistisk analyse blev udført på korrigerede syrekoncentrationer hjælp af et generelt lineær model (GLM) for at afgøre, hvorvidt behandlinger ændret organiske syre niveauer. En model der indgår "behandling" x "run" (kodet som en tilfældig faktor) var gennemførel ted for GLM. Tukey parvise sammenligninger ved 95% sikkerhed blev anvendt til at bestemme retningen af ændringer.
Behandling ændret SCCA koncentrationer i den grønne kaffe. Eddikesyre blev signifikant beriget i alle behandlinger i løbet af ingen behandling-kontrol (GLM, p <0,0001).
Figur 3:. Virkningen af behandlingen på organiske syre niveauer i grøn kaffe Behandlingen havde nogen indflydelse på (a) citronsyre eller æblesyre syre niveauer i grøn kaffe. Men alle behandlinger steget (b) Eddikesyre niveauer væsentligt i forhold til ingen behandling kontroller (GLM, p <0,001). Stigninger i eddikesyre niveauer var størst med mikroben + medium behandling. Bogstaver angiver signifikant forskel ved Tukey parvise sammenligninger ved 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Den største stigning blev observeret i mikroben + medier behandling, som steg 0,25 gange (0,5 vs 0,4 mg / g kaffe i GCP674 vs. NT). En lignende tendens blev observeret i mælkesyre niveauer, selvom de ikke var signifikant forskellige. Der var ingen signifikante ændringer eller tendenser i andre syrer sporede (citronsyre og æblesyre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med enhver analyseteknik, er der flere kritiske faktorer, der væsentligt kan påvirke kvaliteten og pålideligheden af de data, der genereres. For det første er det vigtigt at behandle prøver effektivt med et minimum af frysning / optøningscykler. Gentagen nedfrysning og optøning kan kompromittere den kemiske sammensætning af prøven før behandling eller analyse. For det andet, er det vigtigt at anvende trin i denne protokol til alle prøver konsekvent og jævnt. Tekniske fejl i forbindelse inkonsekvent prøveforberedelse og håndtering kan få alvorlige konsekvenser for kvaliteten af de data, der genereres, og resultere i øget "støj" i SCCA målinger. For eksempel vil partikelstørrelsen af prøven efter slibning påvirke hastigheden og effektiviteten af SCCA ekstraktion. Det er derfor afgørende at sikre, at prøverne er jorden til en ensartet partikelstørrelse, da dette vil opretholde udvinding effektivitet på tværs af prøver og bidrage til at reducere prøve-til-prøve variation. Similarly, vil nøjagtig måling og pipettering under udarbejdelsen af standardløsninger, nøjagtig måling af prøve masser, og omhyggelig overvågning (og normalisering) af udvinding gange resultere i dannelsen af mere ensartede data. Tager tid til omhyggeligt at normalisere, måle og registrere hver af disse parametre vil sikre pålideligheden af de data og muliggøre præcis post-run korrektion af data for eventuelle behandlingsfejl, som kan forekomme. Det tredje er det vigtigt at vælge og anvende en passende intern standard. Beregninger af den endelige analytkoncentration vil stærkt afhængige præcis korrektion baseret på arealet af den interne standard observeret i hver prøve. På grund af dette, er det vigtigt, at den interne standard være både nøjagtigt og præcist målt; og bør ideelt set ikke forekommer naturligt i prøven eller co-eluerer med andre forbindelser. Ikke alene korrekt udvælgelse og anvendelse af en intern standard i alle prøver gør det muligt for forskeren at kontrollere for ændringer i metabolit observerede niveauer på grund af forskelle i Centrifugeringsevne; det også i høj grad forenkler nedstrøms forarbejdning og peak identifikation. Endelig er det nødvendigt at overvåge peak identifikation og integrationsprocessen. Mens automatiserede algoritmer er nyttige, er de ikke perfekt. De data, der genereres af denne teknik stole på nøjagtigheden af integration, og sporene skal kontrolleres manuelt for at sikre kvaliteten af integration begivenheder, især definitionen af peak grænser og basislinjerne.
Som med enhver analytisk procedure, er det vigtigt at fastslå, at CZE metode præsenteres her er: a. præcis: i stand til at bestemme mængden af et givet SCCA stede; b. præcist: i stand til reproducerbart at kvantificere SCCAs inden for samme dag, og i målinger foretaget over flere dage analysemetoder; og c. robust: stand til at inddrive det meste af SCCAs stede i prøverne, der analyseres. Som vist ovenfor i de repræsentative resÜLTS, den her beskrevne fremgangsmåde er i stand til nøjagtigt at bestemme mængderne af SCCAs stede i prøver. Alle SCCAs målt (citronsyre, æblesyre, eddikesyre, og mælkesyre) og den interne standard (adipinsyre) udviste en lineær reaktion i 0-80 ng / pl koncentrationsområde. Derudover LOQs og bestemmelsesgrænseværdier for disse syrer varierede fra 2-4 ng / pl og 1-2 ng / pl hhv. Metoden var også præcis, som alle de SCCAs målte og adipinsyre interne standard udstillet lav intra-dag-variation, der falder mellem 2,0-5,5% af peak-området (eller mellem 1,0-5,2% af den beregnede koncentration) for alle SCCAs målt. Den inter-dag-variation af SCCA målinger var også forholdsvis lav, falder mellem 3,05-10,10% af peak-området (eller mellem 3,30-10,95% af den beregnede koncentration) for alle SCCAs målt. Interessant, med undtagelse af eddikesyre, som var konsekvent på eller tæt ved detektionsgrænsen / kvantificering i alle kaffeprøver analyzed, korrigere prøver under anvendelse adipinsyre som en intern standard resulterede i mere reproducerbare målinger og et fald i koefficienten variabilitet (se Repræsentative resultater, ovenfor). Disse data er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater indikerer, at korrektion med intern standard er afgørende for opretholdelsen af præcision i CE-analyser over tid 16. Mens nogle metoder har anvendt uorganiske ioner som en intern standard, følte vi, at adipinsyre var en mere passende standard for CZE metode præsenteres her, da det er en organisk syre og derfor mere tilbøjelige til at opleve tab i prøveforberedelsen trin svarende til den, opleves af SCCAs af interesse i prøven. Adipinsyre havde de yderligere fordele ved ikke at være til stede i kaffe prøver, der undersøges, udviser en lineær respons på tværs af de samme koncentrationer anvendt til SCCAs i denne undersøgelse, udviser relativt lav LOD / LOQ værdier (1 ng / pl og 4 ng / pl, henholdsvis), enda høj procent nyttiggørelse fra kaffe matrix (100,19% ± 2,57), hvilket gør det til et nyttigt standard til kvantificering SCCAs i kaffe prøver. Interessant, den høje procent opsving observeret for adipinsyre var opnåelige for alle organiske syrer målt i denne undersøgelse, som udviste procent recovery værdier i området fra 91,94 til 106,08%. Disse data viser, at CZE metode præsenteret her er i stand til at genvinde det meste af SCCAs stede i coffee prøver.
Tilpasning denne protokol til nye prøvetyper kræver indsamling af foreløbige data, baseret på litteratur eller empiriske beviser vedrørende de forventede mængder af målrettede analytter. Disse oplysninger vil hjælpe guide den eksperimentelle design, prøveforberedelse, og standardkurve konstruktion. Fastlæggelsen af den korrekte prøvefortynding at bruge let kan opnås empirisk ved at køre en fortyndingsserie af en testekstrakt at finde en passende fortynding. Denne protokol blev udformet til at detektereSCCAs skitseret i eksemplet resultater, men det kunne let tilpasses til påvisning af andre SCCAs ved at ændre parametrene adskillelse, såsom adskillelse spænding, tryk, eller tid. Det er vigtigt at huske dog, at ændre parametrene adskillelse kan ændre antallet af kørsler, der kan udføres på et enkelt sæt separation buffere, da disse buffere nedbrydes med brug. Baseline nedbrydning eller ændringer i de nuværende er ofte manifestationer af over-brugt / forarmet buffere. Udskiftning af kørende buffer og renovering af kapillær kan ofte løse disse problemer. Efter længere tids brug, vil evnen af kapillar at løse analytter falde såvel. Nedsat baseline stabilitet, drastiske skift i retentionstiden og reduceret peak opløsning er alle tegn på, at kapillær måske skal udskiftes. Det er også muligt at modtage et tryk fejl som følge af forkert tætning mellem prøveflasken og kapillarrøret på grund af en dårlig montering hætteglas hætte eller en defekt hætteglas. Sikrehætterne passe stramt ind i prøvehætteglas at forhindre denne fejl.
Traditionelt har kromatografiske fremgangsmåder, såsom GC-MS, GC-FID eller HPLC blevet anvendt til at påvise SCCAs i en lang række matricer, herunder luft, vand, jord og plante prøver 14. Mens effektiv, en stor ulempe ved disse metoder er behovet for at derivatisere SCCAs før påvisning. Derivatisering bruger farlige reagenser detektionsgrænsen er ofte ramt af effektiviteten af derivatiseringsreaktion 13,14. Påvisning af ikke-derivatiseret SCCAs gennem CZE undgår analyt tab under forarbejdning, udsættelse for farlige derivatiseringsmidler, og reducerer prøveforberedelse tid. Disse fordele kan ses i de høje procent recovery satser (på mellem 91,94 til 106,08%) beregnet for alle SCCAs målt i denne undersøgelse. Desuden CZE kvantificering af SCCAs opnår detektionsgrænser kan sammenlignes med dem rapporteret i litteraturen for GC-MS, GC-FID, og HPLC, i området of dele per million til dele pr milliard 13,14. Når det kombineres med high-speed run gange, høj opløsning adskillelse magt, de lige frem prøve behandling protokoller ansat af denne analysemetode, følsomhed og bekvemmelighed CZE gør det til et attraktivt alternativ til traditionelle GC eller HPLC-metoder.
Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at selv CZE tilbyder flere fordele i forhold GC-MS HPLC eller LC-MS / MS baserede metoder til SCCA analyse, er det ikke hensigtsmæssigt, at alle SCCA analyser. For eksempel, da den CZE beskrevet her udelukkende er afhængig af spektrofotometrisk detektion, det giver ikke mulighed for identifikation af ukendte SCCAs stede i prøven, eller bekræftelse af SCCA identitet via massespektral- profilering. På grund af dette, ville GC-MS eller LC-MS / MS-metoder være bedre egnet til SCCA analyser i prøver indeholdende et stort antal ukendte SCCAs, eller prøver, hvor det er afgørende at bekræfte identiteten af alle SCCAs tilstedeværende.Derudover, som tidligere rapporteret LC-MS / MS baserede metoder giver mulighed for lavere detektionsgrænser (Lods) -on gennemsnit 0,05 pg / ml til LC-MS / MS 17 vs. 1 pg / ml for CZE opnået ved hjælp af den metode, præsenteres her-LC-MS / MS baseret kvantificering af SCCAs kan være mere passende for prøver, hvor SCCAs er til stede i meget lave eller spormængder.
Protokollen præsenteres her fokuserer på udvinding og kvantificering af kortkædede carboxylsyrer (SCCAs) fra plantevæv. Indhentning færdigheder i denne teknik vil åbne døren til en bred vifte af anvendelser af denne teknologi for den enkelte forsker. Denne teknik, med kun små variationer i metoden, er med succes blevet anvendt i analysen af SCCAs i en forskelligartet population af prøver og substrater, der spænder fra fødevarer og vævsprøver til miljømæssig vand og jordprøver 8. Derudover få kendskab til de kemiske principper der ligger til grunddenne teknologi, selvom denne protokol vil give forskere med den fornødne videngrundlag til at forsøge analysen af andre forbindelser, såsom kulhydrater eller metaller 8,13. Den analytiske fleksibilitet kapillarelektroforese gør det et overordentligt stærkt værktøj egnet til et utal af eksperimentelle applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
