Introduction
Трансдукция-трансплантация является полезным методом для моделирования гематологических злокачественных новообразований у мышей. Этот метод особенно ценным для изучения миелоидных злокачественных новообразований , начиная с первой демонстрацией того, что эктопическая экспрессия BCR-ABL1 мог точно резюмировать хронический миелолейкоз у мышей 1. Этот метод впоследствии способствовало обширное исследование JAK2 V617F и MPL W515K / л мутировали миелопролиферативными новообразование (MPN).
MPN представляют собой группу гематологические злокачественных опухолей, характеризующихся гиперпродукцией зрелых миелоидных клеток и фиброз костного мозга. Эти заболевания возникают, как правило из клональной экспансии гемопоэтических стволовых клеток, которая приобрела соматической мутации в любом jak2, MPL или CALR. Трансдукция трансплантации JAK2 V617F и MPL W515K / L модели демонстрируют клинические признаки полицитемии и миелофиброза 2 - 5 </ SUP>. В последнее время , модель мыши калретикулин-мутированный MPN также генерироваться с методом трансдукции трансплантации 6. Эти мыши развивают существенную тромбоцитемией заболевание, подобное с увеличением тромбоцитов, увеличение числа мегакариоцитов и фиброза костного мозга. Вместе взятые, эти модели не только при условии, что возможность получить представление о молекулярном патогенезе MPN, но и возможности для разработки и изучения терапии в доклинических условиях.
Эта рукопись содержит подробное описание методологии трансдукции трансплантации с акцентом на мутации CALRdel52. Этот метод включает в себя трансплантацию ретровирусно трансдуцированных клеток костного мозга, экспрессирующих мутантный конструкции в облученных сингенных мышей-реципиентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено и осуществляется в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете Калифорнии в Ирвине по. Все процедуры проводились под анестезией изофлуран и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания.
1. Генерация экотропного ретровируса
- Подготовка высококачественных плазмид с концентрацией по меньшей мере 1 мкг / мкл с использованием либо коммерческий макси-Prep Kit или очистку хлорида цезия.
Примечание: К ним относятся MSCV магистральную вектор , кодирующий представляющий интерес ген (в данном случае CALR 7,8) и маркер выбора (GFP, Neo и т.д.), а также экотропным упаковки плазмиду, кодирующую рвотный-POL-ENV (далее здесь, как плазмиды). - Разморозить и расширяющие низкого прохода 293T клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина с пенициллин / стрептомицин (D10). Пластина 5 × 10 6 клеток в 10 см культуре ткани обработанных блюдо в в увлажненнойтканевой культуры инкубатор при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Расширение 293T клеток в культуре. За день до трансфекции, промыть клетки путем добавления 1 мл PBS и аспирировать надосадочную жидкость в вакуумной колбе.
- Для Trypsinize клетки, добавляют 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать блюда в увлажненном инкубаторе культуры ткани в течение 2 - 3 мин при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Чтобы остановить трипсинизации, добавьте 3 мл D10 блюдо и клетки передачи в 15 мл коническую трубку. Спин клетки при 400 мкг в течение 10 мин.
- Отберите супернатант в клеточный осадок термос и ресуспендируют в 2 мл D10.
- Граф клеток от трипанового синего использованием гемоцитометра.
- Семя 2 х 10 6 клеток на чашку в трех 10 см тканевой культуры обработанных блюд на вирус сгенерированных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения оптимальных результатов, не позволяют клеткам превышать 30 - 50% слияния во время трансфекции или плохой выход вируса может быть получен. - Непосредственно перед трансфекцией,аспирата СМИ в термос и заменить 5 мл свежей D10.
- За каждые 10 см чашку Петри, чтобы быть трансфицированы подготовить индивидуальный стерильный 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- Пипетка 760 мкл восстановленного сыворотки сред в каждую пробирку микроцентрифужных, затем осторожно добавляют 40 мкл реагента для трансфекции непосредственно в средствах массовой информации. Инкубируйте пробирки в культуре ткани капот при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 30 мкг MSCV вектора с интересующего гена (15 мкг при использовании пустой вектор), а также 5 мкг плазмиды каждой соответствующей трубки и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в капюшоне культуры ткани в течение еще 15 мин.
Примечание: Меньшие векторы , как правило, имеют более высокие вирусные урожаи. - Аккуратно добавить общий объем каждой реакции (примерно 800 мкл) по каплям в соответствующей 10 см чашку Петри и слегка наклоните блюдо из стороны в сторону, чтобы перемешать. Возвращение клеток в куб увлажненной тканиlture инкубатор.
- После 8 ч или инкубации в течение ночи в инкубаторе тканевых культур, аспирация средств массовой информации в вакуумную колбу и осторожно заменить 10 мл свежей D10.
- На 48 ч после трансфекции супернатант собирают в 35 мл шприц и фильтруют через мембрану 0,45 мкм для удаления остатков клеток.
- ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Поместите 10 мл свежей D10 назад на клетках 293Т и дополнительного вируса могут быть собраны в 72 ч после трансфекции.
- Утилизировать клеток 293Т в биологически опасных отходов, когда никаких дополнительных вирус не собирается.
- Алиготе вирусный супернатант в отдельные объемы использования (например, 1 мл для титра вируса или 6,5 мл для БМ-инфекции). Вирус флэш-замораживание жидким азотом и вируса хранят при температуре -80 ° C.
Примечание: Избегайте повторных циклов замораживания / оттаивания , поскольку они значительно снижают титр вируса.
2. Определить относительную титр вируса с помощью проточной цитометрии
- Оттепель 3T3 клеток и поддерживать в D10. Культуры клеток в 10 смтканевых культур обрабатывают блюдо в инкубаторе тканевых культур увлажненным при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Выполните титр вируса в трех экземплярах. Для подготовки клеток, мыть клетки путем добавления 1 мл PBS и аспирировать надосадочную жидкость в вакуумной колбе.
- Для Trypsinize клетки, добавляют 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать блюда в инкубаторе тканевых культур увлажненным при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Чтобы остановить трипсинизации, добавьте 3 мл D10 блюдо и клетки передачи в 15 мл коническую трубку. Спин клетки при 400 мкг в течение 10 мин.
- Отберите супернатант в клеточный осадок термос и ресуспендируют в 2 мл D10.
- Граф клеток от трипанового синего использованием гемоцитометра.
- Семя 3Т3 при плотности 1 × 10 5 клеток в пятнадцать 60 мм тканевой культуры обработанных блюд и инкубировать в течение ночи.
- Сделайте 1: 3, 1:10, 1:30 и 1: 100 разведения талой вирусного супернатанта с использованием D10 в общей сложности 1 мл. Также включите безвирусного контроль.
- Аспирируйте менядиам от 3Т3 в вакуумную колбу и заменить 4 мл D10.
- Наложить 3Т3 с разведениями вирусного супернатанта и добавляют полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл в каждую чашку. Инкубируют в течение 48 часов в культуральной инкубаторе ткани при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Определить относительную титр вирусов с помощью проточной цитометрии:
- Для того, чтобы промыть клетки, аспирация СМИ в вакуумную колбу и добавляют 5 мл PBS.
- Аспирируйте PBS в вакуумную колбу. Добавить 1 мл 0,05% трипсина и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 2 - 5 мин, чтобы отделить клетки от тарелки.
- Добавить 3 мл D10 и пипетку вверх и вниз, чтобы отсоединить все оставшиеся клетки от пластины. Передача клеток в пробирку, FACS и центрифуге при 400 мкг в течение 10 мин.
- Слейте супернатант и промыть клетки с 3 мл PBS. Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин и декантации надосадочной жидкости. Ресуспендируют в 200 мкл PBS.
- Запуск клетки на проточном цитометре 9. Собрать между 20 000 - 30 000 мероприятий в рамках тон живой клетки ворота (определяется FSC против SSC) и вычислить процент GFP + и GFP - клетками.
Примечание: Титр вируса считается приемлемым , когда 1:30 разведение супернатанта вирусными урожайность по меньшей мере , 50% GFP + 3Т3. Если этого раствора приводит к менее чем 50% GFP + клеток затем субоптимальные результаты трансдукции могут быть получены. Расчет для определения титра вируса был адаптирован из Лимона и др. , Blood (1997) 9. - Для определения относительного титра вируса, использовать уравнение: титр вируса = частиц образующих единиц (БОЕ) / мл = [(Количество 3Т3 × Частота GFP + клеток) / Объем супернатанта (мл)] × коэффициент разбавления.
3. трансдукции Донорские клетки костного мозга
- Для подготовки мышей-доноров для костного мозга (ВМ), урожай, первые анестезию мышей изофлурановым испарителем со скоростью потока 5% в сочетании дополнительному каналукислорода на 1 л / мин. Pinch ногу для оценки отклика.
Примечание: Донорские мышей (менее 8 недель) должны быть подготовлены за 5 дней до сбора костного мозга (8 дней до трансплантации). Один мышей-доноров обеспечит достаточное количество клеток, по крайней мере, 2 получателей. - Вводят 150 мг / кг 5-фторурацила (5-ФУ) с помощью ретро-орбитальной инъекции в анестезированных мышей с помощью 27 G × ½ "игла.
ВНИМАНИЕ! 5-ФУ анти-рак химиотерапевтическое средство. Всегда обращайтесь с 5-FU внутри сертифицированного химического вытяжного шкафа или шкафа канальным биологической безопасности. Проконсультируйтесь с комитетом по безопасности лабораторных животных и учреждения, чтобы определить соответствующую маркировку мышей, получавших 5-ФУ.- Поместите наркозом мышь на его стороне и сдерживать как с помощью большого пальца и указательного пальца таким образом, что глаз слегка выступает из головы.
- Начиная с иглы латеральнее медиального угла глазной щели и с фаской вверх, вставить иглу в 45° угол в медиальном направлении и останавливается, когда игла вставлена наполовину. Медленно вводят клетки и удалить осторожно удалите иглу.
Примечание: Если этот метод выполняется правильно, глаз должен убрать немного и никакого сопротивления не должно ощущаться при введении иглы. - Проверьте мышь для любых признаков повреждения, таких как отек или кровотечение.
- Урожай костного мозга 5 дней после того, как 5-FU обработки (за 3 дня до трансплантации).
- Обезболить мышей изофлурановым испарителем со скоростью потока 5% в сочетании дополнительного кислорода на 1 л / мин. Pinch ногу для оценки отклика.
- Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать мышь путем распыления щедро с 70% этанола до мех не намокает.
- Использование рассекает ножницы, надрезать кожу и рассекают фасцию от мышц ног. Затем рассекают ногу от мыши, отделяя бедренной кости в тазобедренном суставе и голени на лодыжке.
- сгибатьнога в форме "L" и отделить каждую ногу кость путем разрезания в коленном суставе с рассекающих ножницами.
- Чтобы удалить хрящ на дистальных концах каждой кости ноги, используйте ножницы, чтобы рассекает аккуратно соскрести мышцы к одному концу кости ноги, пока хрящ не отсоединяется.
- С помощью шприца с 27 G х ½ дюйма иглы, на одном уровне каждая нога кости с PBS с добавлением 2% FBS над нейлоновую мембрану 100 мкМ в 50 мл коническую пробирку. Флеш кости до кости становится белым, чтобы максимизировать количество собранных клеток.
- Используйте поршень шприца, чтобы месиво клеток через нейлоновую мембрану в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы получить суспензию единичных клеток. Повторите с другой ногой мыши.
- Центрифуга клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 400 мкг и отбросить супернатант. Ресуспендируют БМ в 5 мл хлористого аммония калия (ACK) буфера для лизиса эритроцитов. Инкубируйте клетки на льду в течение 10 мин.
- Заполните трубку с PBS, чтобы остановить лизиса клеток. CentriФьюдж клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 400 мкг и отбросить супернатант. Повторите шаг для лизиса, если осадок BM имеет красный цвет.
- Ресуспендируют в 5 мл PBS и подсчета клеток с помощью трипанового синего, используя гемоцитометра.
- Ресуспендируют клеток в 2 х 10 6 клеток на м с 2x предварительно стим коктейль , который содержит DMEM , дополненной 20% FBS, L-глутамина, пенициллин / стрептомицин, ИЛ-3 (14 нг / мл), IL-6 (24 нг / мл), и SCF (112 нг / мл). Пластина 2 мл на лунку в 6-луночные планшеты.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Добавляют 2 мл вирусного супернатанта в каждую лунку, содержащих клетки BM и добавляют полибрен (8 мкг / мл). Спин пластины при 30 ° С в течение 90 мин при 1500 х г а затем вернуть пластину к культуре ткани инкубаторе на ночь.
- Суспензию клеток Налить в конические пробирки и центрифугируют при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г, не отбрасывать пластину. Ресуспендируют клеток в 2 мл свежей 2x предварительно стим коктейль на лунку и вернуться в исходные лунки. Выполните 2 - й spinoculation, повторяя шаги 3,7-3,9.
4. Пересадка Донорские клетки в мышей-реципиентов
- Подготовьте сингенных мышей-реципиентов для трансплантации с летальной дозой облучения всего тела <24 ч до инъекции клеток BM.
Примечание: Смертельная доза облучения для BALB / с мышей , как правило , 800-900 сГр и 1000-1200 сГр для C57B / 6 10. Доза, как правило, делится на две сессии облучения, разнесенных по меньшей мере, 3-4 часов друг от друга. - Продолжение со стадии 3.11, урожай трансдуцированных клеток-доноров из 6-луночные планшеты осторожно пипеткой надосадочную жидкость в конические пробирки. Промыть каждую лунку с 1 мл PBS для сбора остаточных клеток и добавляют 50 мл конические пробирки.
- Добавьте 0,5 мл 0,05% трипсина в лунки и инкубируют при 37 ° С в инкубаторе культуры ткани в течение 5 мин.
- Добавляют 1 мл D10 в лунки и снять все оставшиеся клетки осторожно пипеткой. Добавить клетки в соответствующей трубеs из шага 4.2 и окатышей центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г.
- Промыть клетки с PBS и центрифугировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г. Ресуспендируют в 5 мл PBS и сосчитайте клеток с использованием гемоцитометра по трипанового синего.
Примечание: Если вектор имеет GFP тег затем количественно процент GFP-положительных клеток с проточной цитометрии. - Ресуспендируют 5 х 10 5 - 2 х 10 6 клеток в 50 - 100 мкл PBS для инъекции в мышей.
- Вводят клетки через ретро-орбитальное инъекции в мышей под наркозом с помощью стерильного 27 G х ½ "иглы.
Примечание: Другие методы включают в себя инъекционные хвостом вены, селезеночной или бедренных.- Обезболить мышь, используя изофлуран и пинч ногу, чтобы оценить отклик.
- Поместите мышь на его стороне и сдерживать как с помощью большого пальца и указательного пальца таким образом, что глаз слегка выступает из головы.
- С фаска лицевой стороной вверх, вставьте пeedle сбоку от медиального угла глазной щели под углом 45 °.
Примечание: Если этот метод выполняется правильно, глаз должен убрать немного и никакого сопротивления не должно ощущаться при введении иглы. - Проверьте мышь для любых признаков повреждения, таких как отек или кровотечение.
Примечание: После трансплантации мышей будут иметь низкие показатели крови в течение нескольких недель и поэтому восприимчивы к инфекции. Профилактика антибиотиками или использование подкисленной воды может быть использован.
- Через месяц после трансплантации, измеряют% GFP в периферической крови в качестве показателя для приживления донорских клеток с помощью проточной цитометрии.
Примечание: одна GFP не может определить успешность приживления клеток. Вирусный трансдукция может потерпеть неудачу еще приживления могло произойти. В этом случае нет GFP + клетки не будут обнаружены, но приживление трансплантированных клеток был успешным.- Возьмите 10 мкл периферической крови бу прокалывания подкожной вены ноги с 21 G х 1 ½ "шприца и добавить его в 100 мМ ЭДТА в PBS для предотвращения коагуляции.
- Добавляют 1 мл ACK в крови и лизировать на льду в течение 10 мин. Гранул клетки центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
- Отберите супернатант в вакуумной колбе и добавляют 1 мл PBS с добавлением 2% FBS, чтобы остановить лизиса. Гранул клетки центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
- Отберите супернатант в вакуумной колбе и ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS с добавлением 2% FBS.
- Выполнить образцов на проточном цитометре и собирают 300000 событий в сотовом ворот живой (определяется FSC против SSC) и вычислить процент GFP + и GFP - клеток 9.
- Кроме того , на 1 месяц после трансплантации, проводить полный анализ крови (CBC) с использованием автоматического анализатора ветеринарного 18 гематологический контролировать прогрессирование заболевания.
Примечание: Продолжайте следить за болезни на%GFP в периферической крови и CBC ежемесячно. - Для завершения эксперимента, обезболить мышь, используя изофлуран и пинч ногу, чтобы оценить отклик. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков и урожая селезенки и костного мозга для гистопатологии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность эксперимента носит субъективный характер и дата окончания должны быть оценены на основе фенотипа заболевания ожидается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методика трансдукции трансплантации приводит к восстановления гемопоэза мышей-реципиентов с клетками, экспрессирующими интересующего гена. На рисунке 1 показан обзор модели мыши трансдукции-трансплантация калретикулин мутантного MPN. В кратком изложении, ретровирус, выражающие CALRwt или CALRdel52 используют для инфицирования клеток ГСК от донора мыши C57B / 6. Трансдуцированных клеток пересаживают в облученной C57B / 6 мыши реципиента и донора клеток приживление происходит в течение первого месяца после трансплантации. Доказательства фенотипа заболевания становится очевидным, 3 месяца после трансплантации, где мыши обнаруживают повышенную тромбоциты и мегакариоциты, а затем костного мозга фиброза в 6 - 10 месяцев после трансплантации. Если клетки донора не прижился, смерть мыши может произойти в течение первых 2 недель после пересадки. В дополнение к плохой инъекции или травмы во время инъекции, другие технические ошибки могут привести к плохому приживление трансдукцииD-клетки или смерть мыши. К ним относятся субоптимальную облучение мышей-реципиентов, если это происходит наиболее гемопоэтические клетки будут реципиента, а не донора происхождения. С другой стороны, чрезмерное облучение получателей может привести мышей развивать облучение индуцированных болезнь или даже смерть. Низкие титры вируса приводит к низкой эффективности инфицирование клеток-доноров. Как следствие низкое число клеток-доноров будет выражать интерес ген, и таким образом мыши могут не демонстрировать желаемый фенотип. По этой причине очень важно, что вирус с высоким титром используется для трансдукции клеток-доноров. На рисунке 2 показано , как вычислить относительную титр вируса , где% GFP рассчитывается из событий , собранных из клеток ворот живой. На фиг.2В показан титр с более чем одной вирусной частицы на клетку (1: 3 разбавления), а также титр с одиночными вирусных частиц на клетку (1:30, 1:10 и 1: 100 супернатанта). В идеале, по крайней мере , 50% GFP + клетки будут DETECТэд с 1:30 разбавлением вирусного супернатанта. На рисунке 3 показаны доказательства успешного реципиента трансплантата , где мыши CALRdel52 проявляют фенотип MPN с увеличением тромбоцитов, увеличение мегакариоцитов в костном мозге, и фиброзом костного мозга.
Рисунок 1: Обзор Трансдукция-трансплантологии Mouse Модель миелопролиферативными Неоплазмы. А) поколение ретровируса и определение титра вируса происходит 1 - 2 недели до пересадки. B) D (-8) ( за пять дней до сбора костного мозга), мышей - доноров обрабатывают 5-FU истощать клональные совершенные клетки и вызывают гемопоэтических стволовых клеток на велосипеде. С) на D (-3), костный мозг собирают из костей ног и культивировали в 2 раза до стим на ночь , чтобы индуцировать клеточную велосипедного гемопоэтических стволовых клеток. D) Донорские клетки инфицируют вирусным супернатантом на D (-2) и клетки центрифугируют при 400 х г при 30 ° С в течение 1,5 ч в течение 1 - й spinoculation. Е) На D (-1), 2 - й spinoculation осуществляется на донорских клеток. Кроме того, мыши облученный истощать клетки-хозяина ниши костного мозга, чтобы позволить приживления донорских клеток. F) Трансдуцированные клетки донора пересаживают в облученных сингенных мышей - реципиентов на D0. G) Если клетки донора не прижился , то смерть будет происходить на 12 -й день - 14 следующей пересадки , если смертельная доза облучения была использована. H) Фенотип MPN становится очевидным , на 3 -х месяцев после трансплантации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
JPG "/>
Рисунок 2: Определение титра вируса с помощью проточной цитометрии. Клетки 3T3 трансдуцируют с различными концентрациями вируса и трансдукции эффективности ведется мониторинг с помощью проточной цитометрии. A) События собираются внутри клетки ворот живой , как визуализировали FSC против SSC. Мертвые клетки исключались из анализа GFP. B) Гистограммы показывают% GFP для каждого объема вирусного супернатанта испытуемого. Титр вируса является приемлемым , когда по меньшей мере 50% от 3Т3 клеток GFP + при инфицировании с 1:30 разбавлением вирусного супернатанта. С помощью уравнения с шага 2.11.6, титр вируса рассчитывали на основании подсчета клеток 400000 клеток. Расчет для титра вируса в 1:30 разбавление следующим образом : [(400000 х 0,56) / 1) х 30] = 6,72 × 10 6 БОЕ / мл. На шаг 3.7, поражающим 4 х 10 6 клеток с 2 мл вирусного супернатанта приведет к каждой клетке размещают 3 вирусные частицы.Iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Доказательства успешного приживления донорских клеток и MPN фенотипа. Облученные мышей-реципиентов выживающие за 2 недели после трансплантации указывает на успешное приживление инжектированных клеток. А) пересаженные клетки - доноры могут контролироваться с помощью% GFP в периферической крови. B) Кроме того, на счету CBC должны быть приняты с целью мониторинга прогрессирования заболевания. Повышенные тромбоциты обнаруживаются уже через 2 месяца после трансплантации в CALRdel52 по сравнению с CALRwt и пустого векторного управления. C) На момент прекращения действия мышей CALRdel52 демонстрируют классические черты фенотипа MPN включая спленомегалией (не показан), гиперклеточность костного мозга, расширение megakaryocyTES в костном мозге, и фиброзом костного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Техническая ошибка | причины | результат |
| Плохо Инъекции или Травма | Пересадка Отторжение | Пересадка Отказ |
| Плохое качество Донорские клетки | Пересадка Отторжение | Пересадка Отказ или смерть |
| Низкий Вирус Титр | Бедный Трансдукция HSC | Пересадка Отказ |
| Высокая доза облучения | Облучение индуцированное болезнь | Смерть |
| Низкий Облучение DoС.Е. | Пересадка Отторжение | Пересадка Отказ |
| Старые Донорские Мыши (+12 недель) | Низкая HSC вход | Пересадка Отказ |
Таблица 1: Технические ошибки , которые могут привести к смерти или Mouse трансплантационной Failure. В данной таблице приведены примеры технических ошибок и связанных с ними причин, которые могут возникнуть с протоколом по пересадке костного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол содержит подробное описание того, как осуществлять трансплантацию костного мозга у мышей резюмировать существенную тромбоцитемией, как болезнь с прогрессированием миелофиброза с CALRdel52 мутации как водитель заболевания. Успешная трансплантация клеток, экспрессирующих результаты CALRdel52 к увеличению тромбоцитов, расширение мегакариоцитов и фиброза костного мозга. Как трансплантация костного мозга является многоступенчатым процессом, важно иметь в виду действия, где технические ошибки можно избежать, чтобы предотвратить плохое приживление клеток, экспрессирующих ген интереса или даже смерти мыши.
Одним из важнейших факторов успешной модели трансдукции трансплантации, который часто упускают из виду, является качество вируса. Вирус с высокими титрами способствует хорошей эффективности трансдукции и тем самым прочную основу для заболевания, в то время как с использованием вирус, ассоциированный с низким титром, приведет к уменьшению числа клеток, экспрессирующих представляющий интерес ген. Трансдукция efficiобразность может быть повышена за счет реагентов, которые повышают контакт между вирусом и клетками, такими как полибрена и retronectin. Трансдукция ГСК, как известно, трудно даже при высокой концентрации вируса, экотропным ретровирус заражает только делящиеся клетки. Цель "предварительно стим" СМИ (содержащие SCF, IL-3 и IL-6), чтобы вызвать зацикливание покоящихся ГСК. Система лентивирусов может быть использован в качестве альтернативного подхода, если инфекция непролиферирующих клеток необходимо.
Другим фактором, который может оказать влияние на поколение вируса является тип реагента для трансфекции использовали. Оптимальные трансфекции реагенты должны быть определены эмпирически как отмечено различий в токсичности клеток наблюдались между исследовательскими группами. Трансфекция реагент, используемый здесь, привело к хорошим выхода вируса при низкой токсичности клеток. Другие общие трансфекции реагенты включают фосфат кальция 11 и nonliposomal реагента для трансфекции , такие как Fugene. Этот протокол использует в качестве плазмидыупаковка вектор с конкретными trophisms ткани для мышей и крыс. Если рассматривать другие модели животных для трансдукции трансплантации, другие векторы упаковки с более широкими trophisms также могут быть использованы для создания amphotrophic (мыши, крысы, человека) или pantrophic (широкий диапазон trophisms) ретровируса.
Дополнительным преимуществом модели трансдукции трансплантации костного мозга является способность исследовать конкурентные преимущества двух различных популяций доноров или выразить несколько интересующих генов одновременно, используя уникальные маркеры для обозначения каждой популяции интересов. Такие трансплантаты часто используют конгенных мышей C57BL / 6 для отслеживания донорских клеток за рамки использования интегрированного GFP маркера. Поскольку конгенных мыши C57BL / 6 могут выражать маркеры лейкоцитов либо для CD45.1 или CD45.2 донорские клетки могут быть получены из одного фона и пересадили в другую. Кроме того, гибридный штамм F1 может быть сгенерирована для получения потомства выражения как CD45.1 и CD45.2маркеры. В качестве альтернативы, MSCV ретровирусный вектор доступен с несколькими различными метками, в том числе unicistronic (например, FLAG HA) или бицистронный (например, GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) строит. Эти конструкции могут быть использованы одновременно в конкурентных трансплантатов, чтобы позволить дискриминацию среди населения стран-доноров и может быть особенно полезно в ситуациях, когда дифференциация с помощью выражения CD45.1 / CD45.2 не доступна, таких как / с линии мышей BALB.
Еще одним преимуществом трансдукции трансплантации является возможность исследовать вклад специфических типов клеток к инициации заболевания. Хотя этот протокол описывает только трансдукции-трансплантация всего костного мозга, другие экспериментальные проекты могут потребовать обогащения или выделения различных HSC отсеков. В этих случаях количество донорских клеток будет варьироваться в зависимости от конкретного донора населения, используемой. Кроме того, спасательные клетки из наивных донора должныможно использовать в качестве дополнения для поддержки мыши до HSC приживления и расширение может произойти. В таблице 2 указаны рекомендуемое количество донорских клеток для трансплантации костного мозга различных отсеков 12 - 15.
| # КЛЕТОК / Пересадка получателей | # Из клеток поддержки / Пересадка получателей | |
| Всего костного мозга | 500,000-2,000,000 | н / |
| с-Kit + | 1000-10000 | 200000 |
| Лин-с-Kit + Sca-1 + (ЛКС) | 100-10000 | 200000 |
| ЛКС CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200000 |
| ЛКС CD150 + CD34 - | 1-100 | 200000 |
Таблица 2. Число доноров клеток для трансплантации.
Кроме того, вторичный трансплантат может также быть выполнено, чтобы оценить способность трансдуцированных клеток для трансплантации последовательно заболевания.
Трансдукция-трансплантация является весьма универсальным методом, который намного быстрее и значительно более экономичным по сравнению с трансгенными, забивные, или ксенотрансплантата модели. Это позволяет быстро определить, достаточно ли интерес ген , чтобы побудить гематологические злокачественности, и может быть использован в качестве доклинической модели в естественных условиях для тестирования препаратов. Другие преимущества метода трансдукции-трансплантации, что он избегает выражение в не-кроветворных клеток и что ретровирусный место введения служит клонального маркером. Ограничения этой методики входите не-физиологические уровни трансдуцированную гена и различия в интеграции сайта гена 16,17. Принимая во внимание все из указанных выше преимуществ и ограничений во внимание, трансдукция трансплантации является очевидным выбором для начального моделирования в естественных условиях предполагаемых гемопоэтических онкогенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
