Introduction
Transduktion-transplantation er en nyttig metode til at modellere hæmatologiske maligniteter hos mus. Denne teknik har været særdeles værdifuldt for at studere myeloide maligniteter går tilbage til den første demonstration af, at ektopisk ekspression af BCR-ABL1 trofast kunne rekapitulere kronisk myeloid leukæmi i mus 1. Denne teknik har efterfølgende lettet omfattende undersøgelse af JAK2 V617F og MPL W515K / L muteret myeloproliferativ neoplasme (MPN).
MPN er en gruppe af hæmatologiske maligniteter er karakteriseret ved overproduktion af modne myeloide celler og knoglemarv fibrose. Disse sygdomme generelt skyldes den klonale udvidelse af en hæmatopoietisk stamcelle, der har erhvervet en somatisk mutation i enten Jak2, MPL eller CALR. Transduktion-transplantation JAK2 V617F og MPL W515K / L-modeller udviser de kliniske funktioner i Polycytæmia Vera og myelofibrose 2 - 5, </ Sup>. For nylig er en musemodel for calreticulin-muterede MPN også blevet genereret med transduktionen-transplantation metode 6. Disse mus udvikler en væsentlig thrombocytæmi-lignende sygdom med øgede blodplader, øget antal megakaryocytter og knoglemarv fibrose. Tilsammen har disse modeller ikke kun gav mulighed for at få indsigt i den molekylære patogenese MPN, men også evnen til at udvikle og studere lægemidler i en præ-kliniske omgivelser.
Dette håndskrift indeholder en detaljeret beskrivelse af transduktion-transplantation metode med fokus på CALRdel52 mutationen. Denne teknik indebærer transplantation af retroviralt transducerede knoglemarvsceller, der udtrykker mutant konstrukt i bestrålede syngene recipientmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt og gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of California, Irvine. Alle procedurer blev udført under isofluran anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.
1. Generering af ecotropisk retrovirus
- Forbered høj kvalitet plasmider med en koncentration på mindst 1 pg / pl anvendelse af enten et kommercielt maxi-prep-kit eller cæsiumchlorid oprensning.
BEMÆRK: Disse omfatter en MSCV rygrad, der koder for genet af interesse (i dette tilfælde CALR 7,8) og markør af valg (GFP, Neo, etc.) samt en ecotrop pakkende plasmid, der koder gag-pol-env (benævnt her som plasmid). - Optø og udvide lav passage 293T-celler i DMEM suppleret med 10% FBS og L-glutamin med penicillin / streptomycin (D10). Plade 5 x 10 6 celler i en 10 cm vævskultur-behandlet skålen i en befugtetvævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Expand 293T-celler i kultur. På dagen før transfektion vaskes cellerne ved tilsætning af 1 ml PBS og aspireres supernatanten i en termoflaske.
- At Trypsinisér celler, der tilsættes 2 ml 0,05% trypsin og inkuberes retter i en befugtet vævskultur-inkubator til 2 - 3 min ved 37 ° C og 5% CO2.
- For at stoppe trypsinisering, tilsættes 3 ml D10 til parabol og overføre celler til en 15 ml konisk rør. Spin celler ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten i en termokande og resuspender cellepelleten i 2 ml D10.
- Tæl cellerne ved trypan blå-udelukkelse under anvendelse af et hæmocytometer.
- Seed 2 x 10 6 celler pr skål i tre 10 cm vævskultur-behandlede retter pr virus genereret.
BEMÆRK: For at opnå optimale resultater, ikke tillader, at cellerne overstige 30 - 50% sammenløb på tidspunktet for transfektion eller kan opnås et dårligt virus udbytte. - Umiddelbart før transfektion,Aspirer medier i en termokande og erstatte med 5 ml frisk D10.
- For hver 10 cm petriskål, der skal transficeres forberede en individuel steril 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Pipette 760 pi af reducerede serum medie i hvert mikrocentrifugerør, derefter forsigtigt tilsættes 40 pi transfektionsreagens direkte i medierne. Inkubér rør i vævskultur hætte ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 30 ug MSCV vektor med genet af interesse (15 ug hvis hjælp tom vektor) samt 5 ug plasmid til hvert respektive rør og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Der inkuberes ved stuetemperatur i vævskultur hætte i yderligere 15 min.
BEMÆRK: Mindre vektorer tendens til at have højere virale udbytter. - Forsigtigt tilføje det samlede volumen af hver reaktion (ca. 800 pi) dråbevis i sin respektive 10 cm petriskål og forsigtigt vippe skålen fra side til side for at blande. Retur celler til den befugtede væv culture inkubator.
- Efter en 8 timers eller inkubation natten i vævskultur inkubator, Aspirer medie i en termokande og forsigtigt erstatte med 10 ml frisk D10.
- Ved 48 timer efter transfektion indsamle supernatanten til en 35 ml sprøjte og filtreres gennem et 0,45 um membran for at fjerne cellerester.
- EKSTRA: Sted 10 ml frisk D10 tilbage på 293T-celler og flere virus kan høstes ved 72 timer efter transfektion.
- Bortskaffes 293T celler i biohazard affald, når ingen yderligere virus opsamles.
- Portion viral supernatant i mængder engangsbrug (f.eks 1 ml for virus titer eller 6,5 ml for BM-infektion). Flash-frost virus med flydende nitrogen og opbevares virus ved -80 ° C.
BEMÆRK: Undgå gentagne fryse / tø cykler, da de i høj grad reducere virustiter.
2. Bestem Relativ Viral Titer ved flowcytometri
- Thaw 3T3-celler og vedligeholde i D10. Kultur cellerne i en 10 cmcellekultur behandlet skålen i en befugtet vævskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Udfør viral titer i tre eksemplarer. For at forberede celler, vask celler ved at tilsætte 1 ml PBS og aspireres supernatant i en termoflaske.
- At Trypsinisér celler, der tilsættes 2 ml 0,05% trypsin og inkuberes retter i en befugtet vævskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- For at stoppe trypsinisering, tilsættes 3 ml D10 til parabol og overføre celler til en 15 ml konisk rør. Spin celler ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten i en termokande og resuspender cellepelleten i 2 ml D10.
- Tæl cellerne ved trypan blå-udelukkelse under anvendelse af et hæmocytometer.
- Seed 3T3 celler ved en densitet på 1 x 10 5 celler i femten 60 mm vævskultur-behandlede skåle og inkuberes natten over.
- Foretag 1: 3, 1:10, 1:30, og 1: 100 fortyndinger af optøede viral supernatanten under anvendelse af D10 i alt 1 ml. omfatter også en virus-fri kontrol.
- aspireres migdia fra 3T3-celler i en termokande og erstatte med 4 ml D10.
- Overlay 3T3-celler med fortyndinger af viral supernatant og tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml til hver skål. Inkuber i 48 timer i vævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Bestemme relative virale titer ved flowcytometri:
- At vaske celler, aspireres medierne i en termokande, og der tilsættes 5 ml PBS.
- Aspirer PBS i en termoflaske. Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin og inkuberes ved 37 ° C til 2 - 5 min at frigøre celler fra skålen.
- Tilsæt 3 ml D10 og pipette op og ned for at frigøre eventuelle resterende celler fra pladen. Overfør cellerne til en FACS rør og centrifugeres ved 400 xg i 10 min.
- Dekanteres supernatanten og vask celler med 3 ml PBS. Centrifuger ved 400 xg i 10 minutter og dekanter supernatanten. Resuspender i 200 pi PBS.
- Kør celler på et flowcytometer 9. Saml mellem 20.000 - 30.000 begivenheder inden than bor celle gate (bestemt ved FSC versus SSC) og beregne den procentdel af GFP + og GFP - celler.
BEMÆRK: Den virale titer anses for acceptabelt, når den 1:30 fortynding af virale supernatant udbytter mindst 50% GFP + 3T3 celler. Hvis så kan opnås denne fortynding resulterer i mindre end 50% GFP + celler suboptimale transduktion resultater. Beregningen at bestemme viral titer blev tilpasset fra Limon et al. , Blood (1997) 9. - For at bestemme relative virustiter, bruge ligningen: virus titer = partikel dannende enheder (PFU) / ml = [(Antal 3T3 Celler × Hyppigheden af GFP + Cells) / Volumen af Supernatant (ml)] x fortyndingsfaktoren.
3. transduktion Donor knoglemarvsceller
- Til fremstilling donormus til knoglemarv (BM) høst, først bedøver mus ved isofluran fordamper med en strømningshastighed på 5% kombineret supplerendeoxygen ved 1 l / min. Knib foden til at vurdere lydhørhed.
BEMÆRK: Donor mus (mindre end 8 uger gamle) bør være forberedt 5 dage før knoglemarvstransplantation høst (8 dage før transplantation). En donormus vil give nok celler i mindst 2 modtagere. - Injicer 150 mg / kg 5-fluoruracil (5-FU) via retro-orbital injektion i bedøvede mus ved anvendelse af en 27 G x ½ "nål.
FORSIGTIGHED! 5-FU et anti-cancer kemoterapeutiske middel. Altid håndtere 5-FU i en certificeret stinkskab eller et aftræk biosikkerhed kabinet. Rådfør dig med institutionens laboratorium og dyrs sikkerhed udvalg til at bestemme passende mærkning af mus behandlet med 5-FU.- Anbring den bedøvede mus på sin side og begrænse ved hjælp af både tommel- og pegefinger, så at øjet stikker lidt fra hovedet.
- Startende med nålen laterale til den mediale øjenkrog og med facet opad, indfør nålen i en 45° vinkel i den mediale retning og stoppe, når nålen halvvejs indsat. Injicer langsomt celler og fjern fjern forsigtigt nål.
BEMÆRK: Hvis denne teknik udføres korrekt, bør øjet trække lidt, og ingen modstand bør kunne mærkes på nål indsættelse. - Undersøg musen for tegn på skader såsom hævelse eller blødning.
- Harvest knoglemarv 5 dage efter 5-FU-behandling (3 dage før transplantation).
- Bedøver mus ved isofluran fordamper med en flowhastighed på 5% kombineret supplerende ilt ved 1 l / min. Knib foden til at vurdere lydhørhed.
- Sacrifice mus ved cervikal dislokation. Steriliseres musen ved at sprøjte rigeligt med 70% EtOH indtil pels bliver våd.
- Under anvendelse dissekere saks, lave et snit i huden og dissekere fascia væk fra benmusklerne. Dernæst dissekere benet væk fra musen ved overskæring lårbenet i hoften og skinnebenet ved anklen.
- Bøjebenet i en "L" form og adskille hvert ben knogle ved at skære på knæleddet med dissekere saks.
- At fjerne brusk ved de distale ender af hvert ben knogle, bruge dissekere saks til forsigtigt at skrabe muskel mod den ene ende af benet knoglen, indtil brusken er deaktiveret.
- Ved hjælp af en sprøjte med en 27 G x ½ tomme nål skylles hvert ben knogle med PBS suppleret med 2% FBS over en 100 uM nylon membran i en 50 ml konisk rør. Flush knogle indtil knogle bliver hvidt for at maksimere antallet af celler høstes.
- Brug stemplet i en sprøjte at mash celler gennem nylon membran ind i 50 ml konisk rør til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Gentag med andre mus ben.
- Centrifuger cellerne ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg og kassere supernatanten. Resuspender BM i 5 ml ammoniumchloridopløsning kalium (ACK) puffer til at lysere røde blodlegemer. Cellerne inkuberes på is i 10 min.
- Fyld røret med PBS for at stoppe cellelyse. CentriFuge celler ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg og kassere supernatanten. Gentag lysistrin hvis BM pellet har rød farve.
- Resuspender i 5 ml PBS og tælle celler ved trypan blue udelukkelse under anvendelse af et hæmocytometer.
- Resuspender cellerne ved 2 x 10 6 celler pr m med 2x pre-stim cocktail, som indeholder DMEM suppleret med 20% FBS, L-glutamin, penicillin / streptomycin, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), og SCF (112 ng / ml). Plade 2 ml per brønd i 6-brønds plader.
- Inkuber cellerne natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tilsæt 2 ml viral supernatant til hver brønd indeholdende BM-celler og tilføj polybren (8 ug / ml). Spin plader ved 30 ° C i 90 minutter ved 1.500 xg derefter vende tilbage pladen til vævsdyrkningsinkubator natten over.
- Pipette cellesuspension i koniske rør og centrifugeres ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg, ikke kassere pladen. Resuspender cellerne i 2 ml frisk 2x pre-stim cocktail per brønd og vende tilbage til de oprindelige brønde. Udfør en 2. spinoculation ved at gentage trin 3,7-3,9.
4. Transplant donorceller i recipientmus
- Forbered syngene modtagende mus til transplantation med dødelig dosis kroppens samlede bestråling <24 timer før injektion af BM-celler.
BEMÆRK: Dødelig dosis bestråling for BALB / c-mus er typisk 800-900 cGy og 1.000-1.200 cGy for C57B / 6 10. Dosis opdeles typisk i to sessioner af bestråling afstand på mindst 3-4 timers mellemrum. - Fortsat fra trin 3.11, høst transducerede donorceller fra brønde 6 ved forsigtigt pipettering supernatant i koniske rør. Vask hver brønd med 1 ml PBS til at indsamle de resterende celler og tilføje til 50 ml koniske rør.
- Tilsæt 0,5 ml 0,05% trypsin til brønde og inkuberes ved 37 ° C i vævskultur inkubator i 5 min.
- Tilsæt 1 ml D10 til brønde og tag eventuelle resterende celler ved forsigtig pipettering. Tilføj celler til det respektive rørs fra trin 4.2 og pellet ved centrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 x g.
- Vask cellerne med PBS og centrifuger ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 x g. Resuspender i 5 ml PBS og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer ved trypan blå-udelukkelse.
BEMÆRK: Hvis vektoren har en GFP tag derefter kvantificere procentdelen af GFP-positive celler med et flowcytometer. - Resuspender 5 x 10 5 - 2 x 10 6 celler ud af 50 - 100 gi PBS til injektion i mus.
- Injicere celler via retro-orbital injektion i bedøvede mus ved anvendelse af en steril 27 G x ½ "nål.
BEMÆRK: Andre injektion teknikker omfatter hale-vene, milt, eller femoral.- Bedøver mus ved hjælp isofluran og knivspids fod til at vurdere lydhørhed.
- Anbring musen på sin side og begrænse ved hjælp af både tommel- og pegefinger, så at øjet stikker lidt fra hovedet.
- Med facet opad, sæt nEedle lateralt til den mediale øjenkrog i en 45 ° vinkel.
BEMÆRK: Hvis denne teknik udføres korrekt, bør øjet trække lidt, og ingen modstand bør kunne mærkes på nål indsættelse. - Undersøg musen for tegn på skader såsom hævelse eller blødning.
BEMÆRK: efter transplantation mus vil have tællinger lav blodets for et antal uger og så er modtagelige for infektion. Profylakse med antibiotika eller anvendelse af forsuret vand kan anvendes.
- En måned efter transplantation, måle% GFP i det perifere blod som en indikator for indpodede donorceller ved flowcytometri.
BEMÆRK: GFP alene kan ikke afgøre succes transplanteres af cellerne. Den virale transduktion kan have svigtet endnu indpodning kan være opstået. I dette tilfælde ville ingen GFP + -celler detekteres, men indpodning af de transplanterede celler var vellykket.- Tag 10 pi perifert blod By punktering af vena benvene med en 21 G x 1 ½ "sprøjte og føje den til 100 mM EDTA i PBS for at hindre koagulation.
- Tilsæt 1 ml ACK til blod og lyserer på is i 10 min. Pellet cellerne ved centrifugering ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten i et vakuum kolbe og tilsættes 1 ml PBS suppleret med 2% FBS at stoppe lyse. Pellet cellerne ved centrifugering ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten i et vakuum kolbe og resuspender pellet i 100 pi PBS suppleret med 2% FBS.
- Køre prøver på et flowcytometer og indsamle 300.000 hændelser i levende celler gate (bestemt ved FSC versus SSC) og beregne den procentdel af GFP + og GFP - celler 9.
- Derudover ved en måned efter transplantation, udføre fuldstændig blodtælling (CBC) ved hjælp af en automatiseret veterinær hæmatologianalysator 18 for at overvåge sygdomsprogression.
BEMÆRK: Fortsæt med at overvåge sygdom ved%GFP i perifert blod og CBC månedligt. - For at afslutte eksperimentet, bedøver musen ved hjælp isofluran og knivspids fod til at vurdere lydhørhed. Sacrifice mus ved cervikal dislokation og høst milt og knoglemarv til histopatologi.
BEMÆRK: Længden af forsøget er subjektiv og opsigelsen dato bør vurderes på grundlag af sygdommen fænotype forventet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transduktionen-transplantation teknik resulterer i hæmatopoietisk rekonstruktion af de modtagende mus med celler, der udtrykker genet af interesse. Figur 1 viser en oversigt over den transduktion-transplantation musemodel af calreticulin muteret MPN. Kort fortalt retrovirus, der udtrykker CALRwt eller CALRdel52 anvendt til at inficere BM-celler fra en C57B / 6 donor mus. Transducerede celler transplanteres ind i bestrålede C57B / 6 modtager mus og donor celle transplantation opstår i den første måned efter transplantation. Bevis for en sygdom fænotype bliver tilsyneladende 3 måneder efter transplantationen, hvor mus udviser øget blodplader og megakaryocytter, efterfulgt af knoglemarvsfibrose på 6 - 10 måneder efter transplantationen. Hvis donorceller ikke indpodes, kan der forekomme muse død inden for de første 2 uger efter transplantation. Ud over dårlig injektion eller traumer under injektion, kan andre tekniske fejl forårsage dårlig engraftment af transducereD-celler eller muse død. Disse omfatter suboptimal bestråling af modtagende mus, hvis dette sker mest hæmatopoietiske celler vil være af modtager i stedet donor oprindelse. På den anden side kan overdreven bestråling af modtagere forårsage mus til at udvikle bestråling-induceret sygdom eller død. Lave virustitere vil resultere i lav infektionseffektivitet af donorceller. Som en konsekvens lavt antal donorceller vil udtrykke genet af interesse og så kan musene ikke påvise den ønskede fænotype. Af denne grund er det afgørende, at virus med høje titre anvendes til at transducere donorceller. Figur 2 illustrerer hvordan man beregner relativ virustiter hvor GFP% beregnes ud fra begivenheder indsamlet fra den levende celle gate. Figur 2B viser en titer med mere end en viruspartikel per celle (1: 3 fortynding) samt titere med enkelte viruspartikler per celle (1:30 1:10, og 1: 100 supernatant). Ideelt set ville mindst 50% GFP + celler være DETECted med 1:30 fortynding af viral supernatant. Figur 3 viser tegn på en vellykket transplantation recipient hvor CALRdel52 mus udviser en MPN fænotype med øgede blodplader, øget megakaryocytter i knoglemarven, og knoglemarv fibrose.
Figur 1: Oversigt over transduktion-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative neoplasmer. A) Retrovirus generering og bestemmelse af virustiter forekommer 1 - 2 uger før transplantationen. B) D (-8) (fem dage før knoglemarv høst), er donor mus behandlet med 5-FU at depletere linjeforpligtede celler og inducere hæmatopoietisk stamcelle cykling. C) Den D (-3), er knoglemarv høstet fra ben knogler og dyrket i 2 x pre-stim natten over for at inducere cellecyklus af hæmatopoietiske stamceller. D) Donor celler inficeres med viral supernatant på D (-2), og cellerne centrifugeres ved 400 x g ved 30 ° C i 1,5 timer for 1. spinoculation. E) Ved D (-1), er en 2. spinoculation udført på donor celler. Derudover mus er bestrålet at depletere celler i værten knoglemarven niche til at muliggøre donorcelle indpodning. F) Transducerede donorceller transplanteres ind bestrålede syngene modtagende mus på D0. G) Hvis donorceller ikke indpode derefter død vil ske ved dag 12-14 efter transplantation, hvis der er brugt dødelig dosis bestråling. H) Den MPN fænotype bliver tydeligt ved 3 måneder efter transplantationen. Klik her for at se en større version af dette tal.
jpg "/>
Figur 2: Bestemmelse af virustiteren ved flowcytometri. 3T3-celler transduceres med forskellige koncentrationer af virus og transduktion effektivitet overvåges via flowcytometri. A) Events indsamles i levende celler porten som visualiseres ved FSC versus SSC. Døde celler udelukket fra GFP-analyse. B) histogrammer viser% GFP for hver volumen af viral supernatant testet. Den virale titer er acceptabelt, når mindst 50% af 3T3 celler er GFP + når de er inficeret med 1:30 fortynding af viral supernatant. Anvendelse af ligningen fra trin 2.11.6, blev den virale titer beregnet på baggrund af en celletælling på 400.000 celler. Beregningen for viral titer ved en 1:30 fortynding følger: [(400.000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 PFU / ml. Per trin 3.7, inficerer 4 x 10 6 celler med 2 ml viral supernatant ville resultere i hver celle modtager 3 viruspartikler.Iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dokumentation for vellykket Donor Cell Anslag af transplantatet og MPN Fænotype. Bestrålede modtagende mus overlevende ud over 2 uger efter transplantationen indikerer vellykket transplantation af injicerede celler. A) Transplanterede donorceller kan overvåges ved% GFP i perifert blod. B) Endvidere bør der tages CBC tællinger for at overvåge sygdommens progression. Øget blodplader opdages så tidligt som 2 måneder efter transplantationen i CALRdel52 forhold til CALRwt og tomme vektor kontrol. C) På tidspunktet for opsigelsen, CALRdel52 mus udviser klassiske funktioner i MPN fænotype herunder splenomegali (ikke vist), knoglemarv hypercellularitet, udvidelse af megakaryocytes i knoglemarven, og knoglemarvsfibrose. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Teknisk fejl | Årsager | Resultat |
| Dårlig Injection eller Trauma | transplantatafstødning | Transplant Manglende |
| Dårlig kvalitet donorceller | transplantatafstødning | Transplant Fejl eller død |
| Lav virustiteren | Dårlig transduktion af HSC | Transplant Manglende |
| Høj strålingsdosis | Bestråling induceret sygdom | Død |
| Lav Bestråling Dose | transplantatafstødning | Transplant Manglende |
| Gamle donormus (+12 uger) | Lav HSC Input | Transplant Manglende |
Tabel 1: Tekniske Fejl, der kan resultere i Mouse Død eller Transplant Manglende. Denne tabel viser eksempler på tekniske fejl og deres tilknyttede årsager, der kan opstå med knoglemarvstransplantation protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører knoglemarvstransplantationer i mus til at rekapitulere en væsentlig thrombocythemi-lignende sygdom med progression til myelofibrose med CALRdel52 mutation som føreren af sygdom. Vellykket transplantation af celler, der udtrykker CALRdel52 resultater i øget blodplader, udvidelse af megakaryocytter og knoglemarvsfibrose. Som knoglemarvstransplantation er en flertrinsproces, er det vigtigt at erkende trin, hvor der kan undgås teknisk fejl at forhindre dårlig indpodning af celler, der udtrykker genet af interesse eller endda muse død.
En kritisk faktor for en vellykket transduktion-transplantation model, der ofte overses er kvaliteten af virus. Virus med høje titre letter god transduktionseffektivitet og dermed et solidt grundlag for sygdommen, hvorimod anvendelse af et virus associeret med lav titer vil resultere i færre celler, der udtrykker genet af interesse. transduktion efficitighed kan forbedres ved reagenser, der øger kontakten mellem virus og celler, såsom polybren og retronectin. Transduktion af HSC'er vides at være vanskelig, selv med høje koncentrationer af virus, kun økotropiske retrovirus inficerer delende celler. Formålet med "pre-stim" media (indeholdende SCF, IL-3 og IL-6) er at inducere cykling af hvilende HSC'er. Den lentivirale Systemet kan anvendes som en alternativ metode, hvis infektion af ikke-delende celler er nødvendig.
En anden faktor, der kan have en effekt på virus generation er den type transfektionsreagens anvendes. Optimale transfektionsreagenser bør bestemmes empirisk som er blevet observeret markante forskelle i celle toksicitet mellem forskergrupper. Den transfektionsreagens anvendt her har resulteret i god viral udbytte med lav celletoksicitet. Andre almindelige transfektionsreagenser omfatter calciumphosphat 11 og nonliposomal transfektionsreagens, såsom Fugene. Denne protokol anvender plasmid somemballagen vektoren med specifikke væv trophisms for mus og rotter. Hvis overvejer andre dyremodeller for transduktion-transplantation, kan andre pakkevektorer med bredere trophisms også anvendes til at generere amfotrop (mus, rotter, mennesker) eller pantrophic (bredspektrede trophisms) retrovirus.
En ekstra fordel til knoglemarven transduktion-transplantation model er evnen undersøge den konkurrencemæssige fordel af to forskellige donorer populationer eller til at udtrykke flere gener af interesse samtidig ved hjælp af unikke markører til at udpege hver population af interesse. Sådanne transplantater udnytte ofte kongene C57BL / 6-mus til at spore donorceller ud over anvendelsen af en integreret GFP markør. Fordi kongene C57BL / 6-mus kan udtrykke leukocyt markører for enten CD45,1 eller CD45,2, kan donorceller opnås fra en baggrund og transplanteres ind i den anden. Endvidere kan en hybrid F1 stamme genereres til at producere afkom udtrykkende både CD45,1 og CD45,2markører. Alternativt MSCV retroviral vektor fås med flere forskellige mærker, herunder unicistronic (f.eks FLAG HA) eller bicistronisk (f.eks GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) konstruktioner. Disse konstruktioner kan anvendes samtidig i konkurrencedygtige transplantationer for at muliggøre diskrimination blandt donor befolkninger og kan især være nyttigt i situationer, hvor differentiering via CD45,1 / CD45,2 udtryk ikke er tilgængelig, såsom BALB / c mus stamme.
En anden fordel ved transduktion-transplantation er evnen til at undersøge bidragene fra specifikke celletyper til sygdom initiering. Mens denne protokol beskriver kun transduktion-transplantation af hele knoglemarv, kan andre forsøgsdesign nødvendiggøre berigelse eller isolation af forskellige HSC rum. I disse tilfælde vil antallet af donorceller variere afhængigt af den særlige donorpopulationen anvendes. Derudover redning celler fra en naiv donor børanvendes som et supplement til støtte musen, indtil HSC indpodning og ekspansion kan forekomme. Tabel 2 skitserer det anbefalede antal donorceller til transplantation af de forskellige knoglemarv segmenter 12-15.
| # Celler / Transplant Modtager | # Af støtteceller / Transplant Modtager | |
| Hele Bone Marrow | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1.000-10.000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10.000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Tabel 2. Antal donorceller til transplantation.
Endvidere kan sekundær transplantation også udføres for at vurdere evnen af transducerede celler til serielt transplantere sygdom.
Transduktion-transplantation er en meget alsidig metode, der er meget hurtigere og signifikant mere omkostningseffektiv sammenlignet med transgene, knock-in, eller xenograftmodeller. Det tillader en at hurtigt afgøre, om genet af interesse er tilstrækkelig til at inducere en hæmatologisk malignitet, og kan anvendes som et in vivo præklinisk model til at teste lægemidler. Andre fordele ved transduktionen-transplantation teknik er at den undgår ekspression i ikke-hæmatopoietiske celler, og at den retrovirale insertionssted tjener som en klonal markør. Begrænsninger af denne teknik herunde non-fysiologiske niveauer af transducerede gen og forskelle i integrationsstedet af genet 16,17. Tager alle de ovennævnte fordele og begrænsninger i betragtning, transduktion-transplantation er det oplagte valg til indledende in vivo modellering af formodede bloddannende onkogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
