Introduction
התמר-השתלה היא שיטה שימושית מודל ממאירויות המטולוגיות בעכברים. טכניקה זו כבר יקר במיוחד ללימוד ממאירויות מיאלואידית שראשיתה ההפגנה הראשונה כי ביטוי אקטופי של BCR-ABL1 יכול בנאמנות לשחזר לוקמיה מיאלואידית כרונית בעכברים 1. טכניקה זו לאחר מכן יש להקל את המחקר המקיף של JAK2 V617F ו MPL W515K / L מוטצית מחלה מיילופרוליפרטיבית (MPN).
MPN הוא קבוצה של ממאירויות המטולוגיות המאופיינת היתר של תאים מיאלואידית בוגרים סיסטיק מח עצם. מחלות אלה נובעים בדרך כלל מהרחבת המשובטים של תא גזע hematopoietic כי רכשה מוטציה סומטיים או Jak2, MPL, או CALR. התמרה-השתלת JAK2 V617F ו MPL W515K / מודלים L התערוכה המאפיינים הקליניים של פוליציטמיה ו מיילופיברוזיס ראשונית 2 - 5 </ Sup>. לאחרונה, במודל של עכברים של MPN calreticulin-מוטציה גם נוצר עם שיטת התמרה-השתלת 6. עכברים אלו לפתח מחלת thrombocythemia דמוי חיוני עם טסיות מוגבר, מספר גדל של megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. יחד, המודלים האלה לא רק ספקו את ההזדמנות כדי לקבל תובנה בפתוגנזה המולקולרית של MPN, אלא גם את היכולת לפתח וללמוד רפויים באווירה טרום קלינית.
כתב יד זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה התמר השתלה עם דגש על מוטצית CALRdel52. טכניקה זו כרוכה השתלה של תאים במח עצם transduced retrovirally להביע המוטציה לבנות לעכברי נמען syngeneic מוקרנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר ובוצע בהתאם להמלצות של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. כל הנהלים בוצעו בהרדמה isoflurane וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.
1. דור של רטרו-וירוס Ecotropic
- כן פלסמידים באיכות גבוהה עם ריכוז של לפחות 1 מיקרוגרם / μl או באמצעות טיהור כלוריד מסחרית maxi-prep ערכה או צזיום.
הערה: אלה כוללים וקטור השדרה MSCV קידוד הגן של עניין (במקרה זה CALR 7,8) ו סמן הבחירה (GFP, ניאו, וכו ') וכן פלסמיד אריזה ecotropic, קידוד איסור פרסום-Pol-env (המכונה כאן כמו פלסמיד). - הפשרה ולהרחיב תאי 293T נמוך מעבר DMEM בתוספת 10% FBS ו L- גלוטמין עם פניצילין / סטרפטומיצין (D10). פלייט 5 x 10 6 תאים בצלחת תרבות שטופלו רקמות 10 ס"מ בתוך humidifiedבתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- להרחיב תאי 293T בתרבות. ביום שלפני transfection, לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS ו supernatant לשאוב לתוך בקבוק ריק.
- כדי trypsinize תאים, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין דגירה מנות חממה בתרבית רקמה humidified עבור 2 - 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- כדי להפסיק trypsinization, להוסיף 3 מ"ל D10 צלחת ותאי והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין תאים ב 400 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant לתוך תא גלול בקבוק resuspend ואקום D10 2 מיליליטר.
- ספירת התאים על ידי הרחקה הכחולה trypan באמצעות hemocytometer.
- Seed 2 x 10 6 תאים לכל צלחת לתוך מנות רקמות שלוש 10 ס"מ שטופלו תרבות לכל וירוס שנוצר.
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, אינו מאפשר לתאים יעלו על 30 - 50% מפגש בשעת transfection או תשואת וירוס עניים ניתן לקבל. - מיד לפני transfection,תקשורת לשאוב לתוך בקבוק ריק ולהחליף עם 5 מיליליטר D10 טרי.
- על כל צלחת 10 ס"מ פטרי להיות transfected להכין צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge סטרילית הפרט.
- פיפטה 760 μl של התקשורת סרום מופחת לתוך כל צינור microcentrifuge, ואז מוסיפים בזהירות 40 μl של מגיב transfection ישירות לתוך התקשורת. דגירה צינורות ב למכסה המנוע בתרבית רקמה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף 30 מיקרוגרם של וקטור MSCV עם הגן של עניין (15 מיקרוגרם אם באמצעות וקטור ריק) וכן 5 מיקרוגרם של פלסמיד על צינור אחד בהתאמה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת חדר בשכונה בתרבית רקמה עבור 15 דקות נוספות.
הערה: וקטורים קטנים נוטים להיות בעלי תשואות ויראלי גבוהות. - בזהירות להוסיף את הנפח הכולל של כל תגובה (כ 800 μl) נפתח חכם לתוך צלחת שלה בהתאמה 10 ס"מ פטרי בעדינות להטות את צלחת מצד לצד כדי לערבב. חזרו תאי מ"ק הרקמה humidifiedחממת lture.
- בעקבות 8 שעות או דגירת לילה חממה בתרבית רקמה, תקשורת לשאוב לתוך בקבוק ריק ולהחליף בעדינות עם 10 מיליליטר של D10 הטרי.
- בשעה 48 שעות שלאחר transfection לאסוף supernatant לתוך מזרק 35 מ"ל ולסנן דרך קרום 0.45 מיקרומטר להסיר פסולת התא.
- אופציונלי: בחזרה D10 10 מ"ל מקום טרי על תאים 293T ווירוסים נוספים ניתן לקצור ב 72 hr-transfection פוסט.
- השלך תאי 293T ב פסול Biohazard כשאף וירוס נוסף נאסף.
- supernatant ויראלי Aliquot לתוך כרכים לשימוש חד (למשל 1 מ"ל עבור כייל הנגיף או 6.5 מ"ל לזיהום בע"מ). וירוס פלאש להקפיא בחנקן נוזל וירוס בחנות ב -80 ° C.
הערה: הימנע חזר להקפיא / מחזורי ההפשרה כפי שהם לצמצם במידה ניכרת כייל הנגיף.
2. קביעת כייל הנגיף יחסית על ידי cytometry זרימה
- הפשרת 3T3 תאים ולתחזק ב D10. תאי התרבות ב 10 סנטימטריםרקמות-תרבות שטופלו צלחת בתוך חממה בתרבית רקמה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- בצע כייל הנגיף בשלושה עותקים. כדי להכין תאים, לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS ו supernatant לשאוב לתוך בקבוק ריק.
- כדי trypsinize תאים, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין דגירה מנות חממה בתרבית רקמה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- כדי להפסיק trypsinization, להוסיף 3 מ"ל D10 צלחת ותאי והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין תאים ב 400 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant לתוך תא גלול בקבוק resuspend ואקום D10 2 מיליליטר.
- ספירת התאים על ידי הרחקה הכחולה trypan באמצעות hemocytometer.
- זרע 3T3 תאים בצפיפות של 1 x 10 5 תאים לתוך חמש עשר 60 מ"מ רקמת תרבות מנות שטופלה דגירת הלילה.
- הפוך 1: 3, 1:10, 1:30, ו 1: 100 דילולים של supernatant ויראלי מופשר באמצעות D10 בסך של 1 מ"ל. כמו כן כולל שליטה מוירוסים.
- לשאוב אותיdia מ 3T3 תאים לתוך תרמוס ולהחליף עם 4 מ"ל של D10.
- מכסים את 3T3 תאים עם דילולים של supernatant ויראלי ולהוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל כל מנה. דגירה במשך 48 שעות ב בתרבית רקמה חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לקבוע כייל הנגיף ביחס ידי cytometry זרימה:
- כדי לשטוף תאים, לשאוב את התקשורת לתוך בקבוק ואקום ולהוסיף 5 מ"ל PBS.
- לשאוב PBS לתוך בקבוק ריק. הוסף 1 מ"ל 0.05% טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות כדי לנתק את התאים מן המנה.
- הוסף 3 D10 מ"ל ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את כל התאים הנותרים מהצלחת. מעבירים את התאים צינור צנטריפוגות FACS ב 400 XG במשך 10 דקות.
- למזוג supernatant ולשטוף תאים עם 3 מ"ל PBS. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ו supernatant למזוג. Resuspend ב 200 μl PBS.
- תאים לרוץ על cytometer זרימה 9. אסוף בין 20,000 - 30,000 אירועים בתוך tהוא גר שער תא (נקבע על ידי FSC לעומת SSC) ולחשב את אחוז GFP + ו- GFP - התאים.
הערה: כייל הנגיף נחשב מקובל כאשר 1:30 דילול של תשואות supernatant ויראלי לפחות 50% GFP + 3T3 תאים. אם תוצאות דילול זה בפחות מ -50% GFP + תאים אז תוצאות התמרה הכי מוצלחות ניתן להשיג. החישוב לקביעת כייל הנגיף הותאם מתוך ואח לימון. דם, (1997) 9. - כדי לקבוע כייל הנגיף יחסית, השתמש המשוואה: כייל הנגיף = יחידות להרכיב החלקיקים (PFU) / מ"ל = [(מספר 3T3 תאים × תדירות GFP + תאים) / נפח של Supernatant (מ"ל)] × דילול פקטור.
3. תורם transduce תאים במח העצם
- כדי להכין עכברים תורמים עבור מח עצם (בע"מ) קציר, להרדים עכברים לראשונה על ידי אידוי isoflurane עם קצב זרימה של משלים 5% בשילובחמצן 1 ליטר / דקה. לצבוט רגל להעריך תגובה.
הערה: תורם עכברים (פחות מ -8 שבועות) צריכים להיות מוכנים 5 ימים לפני קציר מח עצם (8 ימים לפני השתלה). עכברים תורמים אחד יספקו מספיק תאים עבור 2 מקבלים לפחות. - להזריק 150 מ"ג / ק"ג 5-fluorouracil (5-FU) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית בעכברים מורדמים באמצעות מחט 27 G × ½ ".
זְהִירוּת! 5-FU סוכן כימותרפיות נגד סרטן. תמיד טפלו 5-FU בתוך במנדף כימי מוסמך או ארון בטיחות ביולוגית ducted. התייעץ עם ועדת הבטיחות במעבדה ובבעלי חיים של המוסד לקבוע תיוג מתאים של עכברים שטופלו 5-FU.- מקם את העכבר הרדים על צידו לרסן באמצעות הן האגודל והאצבע המורה כך העין הבולטת מעט מהראש.
- החל לרוחב המחט canthus המדיאלי עם שיפוע כלפי מעלה, הכנס את המחט בזווית של 45° זווית בכיוון המדיאלי ולהפסיק כאשר המחט מוחדרת באמצע הדרך. לאט לאט להזריק תאים ולהסיר להסיר מחט בזהירות.
הערה: אם טכניקה זו מבוצעת כראוי, העין צריכה להתקפל מעט ואין התנגדות צריכה להיות מורגשת על החדרת מחט. - בדוק עכבר עבור כל סימנים של פגיעה כגון נפיחות או דימום.
- קציר מוח העצם 5 ימים לאחר הטיפול 5-FU (3 ימים לפני ההשתלה).
- להרדים עכברים על ידי אידוי isoflurane עם קצב זרימה של חמצן בשילוב 5% ב 1 ליטר / דקה. לצבוט רגל להעריך תגובה.
- להקריב העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. לעקר עכבר על ידי ריסוס בנדיבות עם 70% EtOH עד הפרווה הופכת רטובה.
- באמצעות מספריים לנתח, לעשות חתך בעור לנתח את fascia מן שרירי הרגליים. בשלב הבא, לנתח את הרגל מן העכבר על ידי ניתוק הירך בירך ואת השוקה בקרסול.
- לְכּוֹפֵףהרגל לתוך צורה "L" ולהפריד בין עצם רגל על ידי חיתוך במפרק הברך עם מספריים לנתח.
- כדי להסיר סחוס בקצות הדיסטלי של כל עצם הרגל, להשתמש במספריים לנתח לגרד שריר בעדינות לכיוון קצה אחד של עצם הרגל עד סחוס מתנתק.
- באמצעות מזרק עם מחט 27 G x ½ אינץ ', סומק כל עצם הרגל עם PBS בתוספת 2 FBS% מעל קרום ניילון 100 מיקרומטר צינור חרוטי 50 מ"ל. עצם פלאש עד העצם הופך לבן על מנת למקסם את מספר התאים שנקטפו.
- השתמש הבוכנה של מזרק לכתוש התאים דרך קרום ניילון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לקבל השעיה תא בודד. חזור עם רגל עכבר אחרת.
- תאי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG וזורקים supernatant. Resuspend בע"מ ב 5 מ"ל אשלגן כלוריד אמוניום (ACK) חיץ כדי lyse כדוריות דם אדומות. דגירת תאים על קרח למשך 10 דקות.
- מלאו צינור עם PBS להפסיק תמוגה התא. Centriתאי fuge ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG וזורקים supernatant. חזור על שלב תמוגה אם גלולת BM יש צבע אדום.
- Resuspend ב 5 מ"ל PBS ו לספור תאים על ידי הרחקה כחול trypan באמצעות hemocytometer.
- תאים Resuspend ב 2 x 10 6 תאים לכל מטר עם קוקטייל מראש Stim 2x המכיל DMEM בתוספת FBS 20%, L- גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / מ"ל), ו SCF (112 ng / ml). פלייט 2 מ"ל לכל היטב 6 צלחות היטב.
- דגירת תאי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הוסף 2 מ"ל של supernatant ויראלי לכל התאים BM המכיל היטב ומוסיפים polybrene (8 מיקרוגרם / מ"ל). ספין צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ב 1500 XG ואז לחזור הצלחת אל האינקובטור בתרבית רקמה לילה.
- השעית תא פיפטה לתוך צינורות צנטריפוגות חרוטים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG, לא כדאי לזרוק את הצלחת. תאי Resuspend ב 2 מיליליטר טרי קוקטייל מראש Stim 2x לכל טוב ולחזור הבארות המקוריות. בצע spinoculation 2 nd על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9.
4. תאי תורם השתלה לעכברי נמען
- כן עכברי נמען syngeneic להשתלה עם הקרנת גוף הכולל מנה קטלנית <24 שעות לפני הזריקה של תאי בע"מ.
הערה: הקרנה במינון קטלנית עבור עכברי BALB / c היא בדרך כלל 800-900 cGy ו 1,000-1,200 cGy עבור C57B / 6 10. המינון מפוצל בדרך כלל לשתי פגישות של הקרנה במרווחים לפחות מזה 3-4 שעות. - המשך משלב 3.11, תאי תורם transduced אסיף 6 הצלחות היטב על ידי pipetting supernatant בעדינות לתוך צינורות חרוטים. לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של PBS לאיסוף תאים שיורית ולהוסיף צינורות חרוטי 50 מ"ל.
- הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין 0.05% לבארות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה בתרבית רקמה למשך 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל D10 לבארות לנתק את כל התאים הנותרים על ידי pipetting עדין. הוספת תאים אל הצינור בהתאמהים משלב 4.2 ו גלולה ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 x ז.
- שטפו תאים עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב g x 400. Resuspend ב 5 מ"ל PBS ו לספור תאים באמצעות hemocytometer על ידי הרחקה כחול trypan.
הערה: אם הווקטור יש תג GFP אז לכמת אחוז תאי ה- GFP החיובי עם cytometer זרימה. - Resuspend 5 x 10 5 - 2 x 10 6 תאים 50 - 100 μl PBS להזרקה לעכברים.
- להזריק תאים באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לעכברים מורדם באמצעות מחט סטרילית 27 G x ½ ".
הערה: טכניקות הזרקה אחרות כוללות זנב-וריד, טחול, או ירך.- להרדים עכבר באמצעות רגל isoflurane ולצבוט להעריך תגובה.
- מקם את העכבר על צידו לרסן באמצעות הן האגודל והאצבע המורה כך העין הבולטת מעט מהראש.
- עם פונה כלפי מעלה את זווית ההטיה, הכנס את needle לטרלית למרכז canthus המדיאלי בזווית של 45 מעלות.
הערה: אם טכניקה זו מבוצעת כראוי, העין צריכה להתקפל מעט ואין התנגדות צריכה להיות מורגשת על החדרת מחט. - בדוק עכבר עבור כל סימנים של פגיעה כגון נפיחות או דימום.
הערה: עכברים השתלה בעקבות יהיו ספירת דם נמוכה במשך מספר שבועות ולכן חשופים לסכנת הדבקה. טיפול מונע באנטיביוטיקה או שימוש במים acidified ניתן להשתמש.
- חודש לאחר השתלה, למדוד את GFP% בדם ההיקפי כאינדיקטור תאי תורם engrafted ידי cytometry זרימה.
הערה: GFP לבד לא יכול לקבוע את מידת ההצלחה של engraftment של התאים. תמרת ויראלי אולי נכשלה עדיין engraftment ייתכן שאירע. במקרה זה, לא תאי GFP + יהיו מזוהים, אבל engraftment של התאים המושתלים היה מוצלח.- קח 10 μl של b דם ההיקפיתy ניקוב וריד ברגל saphenous עם 21 G x ½ 1 "מזרק ולהוסיף אותו ל -100 מ"מ EDTA ב PBS כדי למנוע קרישה.
- הוסף 1 מ"ל ACK לדם lyse על קרח למשך 10 דקות. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant בבקבוק ואקום ולהוסיף 1 מ"ל PBS בתוספת 2% FBS להפסיק תמוגה. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant בבקבוק ואקום resuspend גלולה ב 100 μl PBS בתוספת 2% FBS.
- הפעל דגימות על cytometer זרימה ולאסוף 300,000 אירועים בתוך שער התא החי (נקבע על ידי FSC לעומת SSC) ולחשב את אחוז GFP + ו- GFP - התאים 9.
- בנוסף ב 1 לחודש השתלה פוסט, לבצע ספירת דם מלאה (CBC) באמצעות מנתח המטולוגיה וטרינרים אוטומטי 18 לעקוב אחר התקדמות מחלה.
הערה: המשך לעקוב אחר המחלה על ידי%GFP בדם היקפי ו CBC חודשי. - כדי לסיים את הניסוי, להרדים עכבר באמצעות רגל isoflurane ולצבוט להעריך תגובה. להקריב עכבר על ידי נקע בצוואר רחם וטחול קציר מח עצם עבור histopathology.
הערה: אורכו של הניסוי הוא סובייקטיבית לבין מועד הסיום צריך יוערך בהתבסס על פנוטיפ המחלה הצפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה התמר-השתלת תוצאת הכינון מחדש hematopoietic של עכברי הנמען עם תאים המבטאים את הגן של עניין. איור 1 מציג סקירה של מודל העכבר התמר-השתלת calreticulin מוטצית MPN. בקצרה, רטרו-וירוס להביע CALRwt או CALRdel52 משמש להדביק תאים BM מתוך עכבר התורם C57B / 6. תאי transduced מושתלים לתוך engraftment עכבר התא תורם למקבל C57B / 6 מוקרן מתרחש במשך החודש שלאחר ההשתלה הראשונה. עדות פנוטיפ המחלה הופכת 3 לכאורה חודשים לאחר ההשתלה שבו נמצאת תצוגת עכברים גדל טסיות megakaryocytes, ואחריו סיסטיק מח העצם 6 - 10 חודשים לאחר ההשתלה. אם תאי תורם אינם נקלטים, מות עכבר עלול להתרחש בתוך 2 השבועות הראשונים שלאחר השתלה. בנוסף הזרקת עניים או טראומה במהלך ההזרקה, טעויות טכניות אחרות יכול לגרום engraftment עניי transduceתאי ד או מות עכבר. אלה כוללים קרינה תת-אופטימלית של עכברים הנמען, אם זו מתרחשת תאים hematopoietic ביותר יהיה של הנמען ולא מוצא התורם. מצד השני, קרינה מוגזמת של נמענים יכולה לגרום לעכברים לפתח מחלה נגרמת הקרנה או אפילו מוות. titers ויראלי נמוך תגרום יעילות זיהום נמוכה של תאי התורם. כתוצאה מכך מספרים נמוכים של תאי תורם יבטאו את הגן של עניין ולכן עכברים לא יכולים להדגים את הפנוטיפ הרצוי. מסיבה זו, חשוב כי וירוס עם titers הגבוהה משמש transduce תאים תורמים. איור 2 מדגים כיצד לחשב כיילו נגיף יחסי שבו GFP% מחושב מאירועים שנאספו משער התא החי. איור 2B ממחיש כייל עם יותר חלקיקים נגיפיים אחד לכל תא (דילול 1: 3), כמו גם כותרות עם חלקיקים נגיפיים יחידים לכל תא (1:30, 1:10, ו 1: 100 supernatant). באופן אידיאלי, לפחות 50% GFP + תא יהיה detecטד עם 01:30 דילול של supernatant ויראלי. איור 3 מציג ראיות של אדם שעבר השתלה מוצלחת שבו עכברים CALRdel52 תערוכה פנוטיפ MPN עם טסיות מוגבר, גדל megakaryocytes במח העצם, סיסטיק מח עצם.
איור 1: סקירה כללית של במודל עכבר התמרה-השתלה של מחלה מיילופרוליפרטיבית. א) רטרווירוס הדור וקביעת כייל הנגיף מתרחשת 1 - 2 שבועות לפני ההשתלה. B) D (-8) (חמישה ימים לפני קציר מח עצם), עכברים תורמים מטופלים עם 5-FU כדי לרוקן תאים מחויבי שושלת לגרום אופניים תאים גזע hematopoietic. ג) ביום ד '(-3), מח עצם שנקטף מן העצמות ברגל בתרבית הלילה מראש Stim 2x לגרום תא רכיבה של תאי גזע hematopoietic. ד) תאים תורמים נגועים supernatant ויראלי על D (-2) ואת התאים centrifuged ב 400 XG ב 30 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות עבור spinoculation 1 st. ה) ביום ד '(-1) חברת spinoculation nd 2 מתבצעת על תאי תורם. בנוסף, עכברים הם מוקרנים כדי לרוקן תאים בגומחת מח עצם המארח כדי לאפשר engraftment תא תורם. F) transduced תאי תורם מושתל לעכברי נמען syngeneic מוקרנים על D0. G) אם תאי תורם אינם נקלטים אז מוות יתרחש ביום 12 - 14 לאחר השתלה אם הקרנת מנה קטלנית נוצלה. H) פנוטיפ MPN מתברר ידי 3 חודשים לאחר ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
jpg "/>
איור 2: קביעת כייל הנגיף על ידי cytometry זרימה. תאי 3T3 הם transduced עם ריכוזים שונים של יעילות וירוס התמרה מנוטר באמצעות cytometry הזרימה. א) אירועים נאספים בתוך שער התא החי כמו דמיינו ידי FSC לעומת SSC. תאים מתים אינם נכללים ניתוח GFP. B) היסטוגרמות להראות% GFP עבור כל כרך של supernatant ויראלי נבדק. כייל הנגיף מקובל כאשר לפחות 50% של 3T3 התאים + GFP כאשר נגוע 1:30 דילול של supernatant ויראלי. באמצעות המשוואה משלבת 2.11.6, כייל הנגיף חושב על בסיס ספירת תאים של 400,000 תאים. החישוב עבור כייל הנגיף בדילול 01:30 כדלקמן: [(400,000 x 0.56) / 1) x 30] = 6.72 x 10 6 PFU / ml. לכל שלב 3.7, מדביק 4 x 10 6 תאים עם 2 מ"ל של supernatant ויראלי יביא בכל תא מקבל 3 חלקיקים נגיפיים.Iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עדויות של engraftment תא תורם המוצלח הפנוטיפ MPN. עכברי נמען מוקרנים לשרוד מעבר 2 שבועות לאחר השתלה מציינים engraftment המוצלח של תאים מוזרקים. א) תאי תורם מושתלים ניתן לנטר באמצעות% GFP בדם היקפי. B) בנוסף, ספירות CBC יש לנקוט כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה. טסיות מוגבר מזוהים מוקדם ככל 2 חודשים לאחר ההשתלה ב CALRdel52 בהשוואה CALRwt ושליטה וקטור ריק. ג) בעת סיום, עכברים CALRdel52 להפגין מאפיינים קלאסיים של פנוטיפ MPN כולל splenomegaly (לא מוצג), מח עצם hypercellularity, הרחבת megakaryocytes במח העצם, סיסטיק מח עצם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שגיאה טכנית | גורם ל | תוֹצָאָה |
| הזרקה או טראומת Poor | דחיית שתל | אי להשתלות |
| איכות גרועה של תאים תורמים | דחיית שתל | אי להשתלות או מוות |
| כייל הנגיף נמוכה | תמרה ירודה של HSC | אי להשתלות |
| מנת הקרנה גבוהה | מחלה הנגרמת הקרנה | מוות |
| Do הקרנה הנמוכהse | דחיית שתל | אי להשתלות |
| עכברים תורמים ישנים (+12 שבועות) | קלט HSC נמוך | אי להשתלות |
טבלה 1: טעויות טכניות שיכול לגרום עכבר מוות או אי להשתלות. טבלה זו מפרטת דוגמאות של טעויות טכניות וסיבות הקשורים בהם שעלולה להתרחש עם פרוטוקול השתלת מח עצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך לבצע השתלות מח עצם בעכברים לשחזר מחל thrombocythemia דמוי חיונית עם התקדמות מיילופיברוזיס ראשונית עם מוטצית CALRdel52 כנהג מחלה. השתלה מוצלחת של תאי המבטאים תוצאות CALRdel52 במספר טסיות דם מוגברים, הרחבת megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. השתלת מח עצם היא תהליך רב שלבי, חשוב להכיר שלבים שבהם ניתן להימנע טעות טכנית למנוע engraftment עניים של תאים המבטאים את הגן של עניין או אפילו מוות העכבר.
גורם קריטי מודל התמרה-השתלה מוצלחת כי הוא לעתים קרובות התעלם הוא איכות וירוס. וירוס עם titers הגבוהה מקלת יעילות התמרה טובה ובכך בסיס חזק למחלות, ואילו באמצעות וירוס הקשורים כיילו נמוך יגרום פחות תאים המבטאים את הגן של עניין. התמרה efficiency ניתן לשפר על ידי ריאגנטים המגבירים קשר בין וירוס ותאים כגון polybrene ו retronectin. התמרה של HSCs ידוע להיות קשה אפילו עם ריכוזים גבוהים של וירוס, רטרו-וירוס ecotropic רק מדביק חלוקת תאים. מטרת התקשורת "טרום סטים" (המכיל SCF, IL-3, ו- IL-6) היא לגרום אופניים של HSCs שקט. מערכת lentiviral יכולה לשמש גישה חלופית אם הזיהום של תאים שאינם מתחלקים הכרחי.
גורם נוסף שיכול להשפיע על דור וירוס הוא הסוג של מגיב transfection בשימוש. ריאגנטים transfection אופטימלית צריכים להיקבע באופן אמפירי כמו הבדלים בולטים רעיל לתא נצפו בין קבוצות מחקר. מגיב transfection משמש כאן הביא תשואה ויראלי טוב עם רעילות לתא נמוך. ריאגנטים transfection נפוצים אחרים כוללים סידן פוספט 11 ו מגיב transfection nonliposomal כגון Fugene. פרוטוקול זה משתמש פלסמיד כמווקטור האריזה עם trophisms רקמות הספציפי לעכבר וחולדה. אם להתחשב במודלים של בעלי חיים אחרים עבור השתלת תמרה, וקטורי אריזה אחרים עם trophisms הרחב יכולים לשמש גם כדי ליצור (עכבר, חולדה, אדם) amphotrophic או pantrophic רטרו-וירוס (trophisms מגוון הרחב).
יתרון נוסף למודל תמרה-השתלת מח העצם הוא היכולת לחקור את היתרון התחרותי של שתי אוכלוסיות תורמות שונות או לבטא גנים מרובים של עניין בעת ובעונה אחת באמצעות סמנים ייחודיים לייעד כל אוכלוסייה של עניין. שתלים כאלו לעתים קרובות לנצל עכברי C57BL / 6 congenic לעקוב אחר תאי תורם מעבר לשימוש סמן GFP משולב. כי עכברי C57BL / 6 congenic יכולים להביע סמנים לויקוציטים לאף CD45.1 או CD45.2, תאי תורם ניתן לקבל רקע אחד המושתלים לתוך השני. יתר על כן, זן F1 היברידי ניתן להפיק לייצר צאצאים שמבטא CD45.1 ו CD45.2סמנים. לחלופין, וקטור retroviral MSCV זמין עם כמה תגים שונים, כולל unicistronic (למשל, FLAG HA) או bicistronic (למשל, ה- GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) בונה. שני המושגים הללו ניתן להשתמש במקביל בהשתלות תחרותיות לאפשר אפליה בין אוכלוסיות תורמות יכולים להיות שימושי במיוחד במצבים בם בידול באמצעות ביטוי CD45.1 / CD45.2 אינו זמין, כגון זן עכבר BALB / ג.
יתרון נוסף של השתלת תמרה הוא היכולת לחקור את תרומתם של סוגי תאים מסוימים כדי חניכת מחלה. בעוד פרוטוקול זה מתאר רק את השתלת התמרה של מח עצם כולו, עיצובים ניסיוניים אחרים עשויים להצריך להעשרה או בידוד של תאי HSC שונים. במקרים אלה, מספר תאי תורם ישתנה בהתאם האוכלוסייה התורמת הספציפית בשימוש. בנוסף, תאי הצלה מתורם נאיבי צריכיםלשמש כתוספת לתמיכה העכבר עד engraftment והרחבת מרכז העזרה והתמיכה יכול להתרחש. טבלה 2 מפרטת את המספר המומלץ של תאים תורמים להשתלה של מח העצם השונה מלתחות 12 - 15.
| # של תאים / מושתל | # של תאי תמיכה / מושתל | |
| מח עצם פריטים | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1,000-10,000 | 200,000 |
| לין-ג-Kit + SCA-1 + (LKS) | 100-10,000 | 200,000 |
| + CD48 CD150 LKS - SP | 1-100 | 200,000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200,000 |
טבלה 2. מספר התאים תורמים להשתלה.
יתר על כן, השתלה משנייה עשויה גם להתבצע כדי להעריך את היכולת של תאי transduced להשתיל מחל סדרתי.
התמר-השתלה היא שיטה תכליתית מאוד כי הוא הרבה יותר מהר יותר באופן משמעותי עלות יעילה לעומת מהונדס, עקום, או מודלי xenograft. זה מאפשר לקבוע במהירות אם הגן של עניין הוא מספיק כדי לגרום ממאירות המטולוגית, והוא יכול לשמש מודל in vivo טרום קליני לבדיקת סמים. יתרונות נוספים של טכניקת תמרת ההשתלה הם שזה ימנע ביטוי בתאים שאינם hematopoietic וכי הכניסה לאתר retroviral משמש כסמן משובט. מגבלות includ טכניקה זודואר רמות הלא פיסיולוגיות של גני הבדלי transduced באתר האינטגרציה של גן 16,17. אם תיקח את כל היתרונות הנ"ל והמגבלות בחשבון, השתלת תמרה היא הבחירה הברורה עבור מודלים ראשוניים in vivo של אונקוגנים hematopoietic המשוערים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
