Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling stivheden af Published: October 19, 2016 doi: 10.3791/54630
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 1,2
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

Abstract

Arteriel afstivning er en betydelig risikofaktor og biomarkør for hjerte-kar-sygdomme og et kendetegn for aldring. Atomic force mikroskopi (AFM) er et alsidigt analytisk redskab til at karakterisere viskoelastiske mekaniske egenskaber for en række forskellige materialer lige fra hårdt (plast, glas, metal osv) overflader til celler på alle underlag. Det har været meget anvendt til at måle stivheden af ​​celler, men mindre hyppigt anvendes til at måle stivheden af ​​aorta. I dette papir vil vi beskrive procedurerne for hjælp AFM i kontakt tilstand for at måle ex vivo elasticitetsmodul af ubelastede mus arterier. Vi beskriver vores procedure for isolering af mus aorta, og derefter give detaljerede oplysninger om AFM analyse. Dette omfatter trin-for-trin instruktioner til justering af laserstrålen, kalibrering af fjederkonstanten og afbøjning følsomhed AFM probe, og erhvervelse af kraft kurver. Vi tilbyder også en detaljeret protokol for data anasis af kraft kurver.

Protocol

Animal arbejde i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg fra University of Pennsylvania. Metoderne blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.

1. Forberedelse af Mouse og Isolering af aorta

  1. Bedøver en mus med ketamin (80 - 100 mg / kg), xylazin (8 - 10 mg / kg) og acepromazin (1 - 2 mg / kg) intraperitonealt. Bekræft anæstesi med en hale knivspids test. Når musen er fuldt bedøvet, aflive musen ved cervikal dislokation.
  2. Placer musen på ryggen og pin musen til en dissektion bord. Rens maven område med 70% (v / v) ethanol vådservietter.
  3. Klem huden på midterlinjen og lave en lille indledende snit med mellemstore mikrokirurgi saks på maven. Mens du holder huden med en pincet, bruge mellemstore mikrokirurgi saks til at klippe huden og bughinden fra maven til brystbenet.
  4. Skær væk ribbenene på be to sider med mellemstore mikrokirurgi saks. Fjern forsigtigt de lunger og lever med små mellemstore mikrokirurgi saks, og lade hjertet og aorta. Overfør musen og dissektion bord til et dissektionsmikroskop.
  5. Tag fat fedtet omkring aorta med små pincet og bruge en lille saks til omhyggeligt skåret væk fedt omkring aorta.
  6. grab forsigtigt aorta med pincet, lave et snit med lille størrelse mikrokirurgi saks ved begyndelsen af ​​aorta ascendens og et andet snit ved enden af ​​aorta descendens, lige over den abdominale aorta.
  7. Overfør det dissekerede aorta til en 60 mm skål indeholdende 1 X phosphatpufret saltvand (PBS; uden calcium og magnesium).
  8. Fortsæt med at dissekere væk eventuelt resterende fedtvæv fra aorta ved hjælp af små og mellemstore mikrokirurgi saks. Brug en lille saks til at åbne aorta på langs.
  9. Anvendelse af små mikrokirurgi saks til at klippe et lille stykke (~ 2 x 4 mm) i aorta descendens og aortic arch for AFM-analyse (figur 1). Placer vævet i en 60-mm plastik skål og holde det fugtigt i en dråbe PBS.

figur 1
Figur 1:. Et billede der viser placeringen af de forskellige Aorta Segmenter i en mus Aorta blev isoleret fra hjertet til membranen, og en lille del af den nedadgående aorta og aortabuen blev anvendt til at bestemme de elastiske moduli. Scale bar, 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Forberedelse vævsprøver for AFM Målinger

  1. Fjern forsigtigt PBS ved hjælp af en professionel tørre uden at røre aorta. Vær sikker på, at den luminale side af vævet vender opad.
  2. Forsigtigt lim hver ende af den åbnede aorta til pladen ved add ing 5 - 10 pi cyanoacrylatklæbestof med en gel-loading spids (Figur 2).
    BEMÆRK: Mængden af lim er nødvendig for at fast fastgøre vævet ved hver ende skal bestemmes empirisk. Det er kritisk, at aorta ikke strækkes under denne proces.
  3. Kontroller den limet aorta at gøre visse at det ikke er foldet eller flydende. Efter lufttørring limen på aorta (30 - 60 sek), forsigtigt tilføje PBS og nedsænke prøven.
    BEMÆRK: Forberedelse AFM (trin 3 - 5) kan udføres, mens vævet forberedes til analyse.

Figur 2
Figur 2: tegning af en aortasegment limet på en 60-mm dyrkningsskål under anvendelse Cyanoacrylat klæbestof Den cyanoacrylat klæbemiddel påføres på kanten af en aorta prøve som forberedelse til AFM målinger..dk / filer / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Ilægning af Probe

  1. Montere en probe holder væske på sondens belastning stativet.
  2. Med en pincet, glide et siliciumnitrid AFM probe (0,06 N / m cantilever) med en sfærisk spids (vi har brugt en 1-um diameter SiO2 partikel men større størrelser kan også anvendes) på holderen proben. Sørg for, at AFM sonden er solidt fastgjort til holderen sonden.
  3. Skub holderen sonden på Z-scanneren montere af AFM hovedet, og sikre, at indehaveren af ​​sonden er monteret korrekt.

4. Justering af Laser på Probe

  1. Åbn AFM software. Vælg eksperimentet type på software Eksperimenter Kategori at kontakte Mode Experiment koncernen Kontakt tilstand i væske og eksperiment at kontakte tilstand i væske. Klik på Indlæs experiment i softwaren; dette vil tænde laseren.
  2. Tilsæt 3 ml destilleret vand til en 50-mm glasbund fad og placer fadet på den fase af laser alignment enhed. Denne enhed forenkler processen med at fokusere laserstrålen på bagsiden af ​​cantilever.
  3. Monter AFM hovedet i opretstående stilling på laser alignment enhed og magt på laser alignment enhed. Der tilsættes ca. 50 pi destilleret vand til dannelse af en dråbe på AFM spids.
  4. Ved hjælp af joysticket, sænke AFM hovedet, så AFM spids kommer i kontakt med vand i fadet. Hvis kontakten ikke er lavet mellem AFM spids og vand i skålen, forsigtigt løfte fadet indtil kontakten er lavet. Juster fokus, lysstyrke og XY position, så AFM spidsen er i betragtning på LCD-skærmen af ​​tilpasningen enhed.
  5. Placer laserpunktet på spidsen af ​​AFM probe ved at justere laser positionering knopper af AFM hovedet. Brug af detektor positionering drejeknapper på AFM hovedet, justere position af fotodioden indtil værdier mellem 0 og -1 V er opnået for den lodrette udbøjning og ~ 0 V opnås for den horisontale afbøjning.
  6. Kontrollér laseren sumsignalet maksimeres. Gentag eventuelt trin 4,5 til re-justere placeringen af ​​laserstrålen på AFM spids og positionen af ​​fotodioden at opnå den maksimale sumsignalet.
    BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at flytte AFM probe på holderen proben for at opnå en maksimal sumsignal selvom trin 4.5 gentages.

5. Kalibrering af Nedbøjning Følsomhed og fjederkonstant af AFM Probe

  1. Lav en ridse på en 60-mm kultur skål med en forcep og fylde fadet med destilleret vand. Placer dyrkningsskålen på prøveholderen plade. I dette tilfælde, montere parabol på motoriserede XY scanning fase af et omvendt mikroskop.
  2. Placer en magnetisk plade holder oven på pladen for at holde det sikkert under billedbehandling.
  3. Klik BEMÆRK: Dette trin er meget vigtigt, da den undgår at bryde AFM spids.
  4. Placer AFM hovedet på objektbordet.
  5. Mikroskopet at fokusere på bunden på pladen. Brug joysticket, eller klik på 'Down' pil i navigationsmenuen til langsomt og forsigtigt sænke AFM sonden ind i PBS. Placer hovedet lidt over bunden i pladen.
    BEMÆRK: Hvis den indledende position AFM hoved er tættere på prøven, det engagere tid vil blive væsentligt reduceret.
  6. Før de binder, re-justere placeringen af ​​laserstrålen på AFM spids og positionen af ​​fotodioden at opnå den maksimale sumsignalet som nødvendigt.
  7. Vælg et tip ved at klikke Ændring Probe i opsætningsmenuen. Klik på Søg Parametre og indstille parametre: Scan Size til 0, Scan Rate til 1 Hz, Sample / line til 256 og Nedbøjning Setpunkt til 20 nm. Klik Engage. Vinduet Status Engage gælder indtil sonden kommer i kontakt med overfladen af ​​pladen. Efter engagere sonden, skal du klikke på rampe.
  8. Klik Udvidet tilstand i menuen Scan Toolbar og indstille parametre: Rampe Størrelse på mellem 500 nm og 1 um, Rampe Rate til 2 Hz, Antal prøver til 256, Tip Radius til 500 nm, Sample Poissons forhold til 0,5 (antager materialet der skal måles er helt inkompressibel), Tip Half Vinkel til 0, Trigger mode til Relativ og Trigger Threshold til mellem 20 og 100 nm.
  9. Klik Rampe Kontinuerlig i menuen Rampe Toolbar til SKAFFESi en kraft kurve på pladen (figur 3A). I denne kraftkurve, indstille kanal 1 til afbøjning fejl.
    BEMÆRK: Dette vil tillade softwaren til at tegne resultaterne som vertikal afbøjning vs. z position.
    1. Klik på venstre eller højre ender af kraft kurve og træk markøren til at omfatte en lineær region i kraft kurve (figur 3A, stiplede røde linjer). Brug disse to linjer til at markere grænserne for det skrånende område at være egnet med en lige linje.
  10. Vælg Rampe i Toolbar og klikke på Opdater følsomhed. Optag værdi og gentage dette trin fire gange. Vælg Kalibrer på værktøjslinjen og derefter klikke Detector. Input en gennemsnitlig værdi fra de fem målinger i Nedbøjning Følsomhed kassen.
  11. Klik Udbetaling 2 - 3 gange for at hæve AFM hovedet. Dette trin er vigtigt at forhindreinteraktion mellem AFM spids og pladen under den termiske tune processen. Klik Termisk Tune i Toolbar.
  12. Set Thermal Tune Range 1 - 100 kHz (Disse oplysninger kan fås fra producentens katalog) og Nedbøjning følsomhed Korrektion til 1,144 for v-formede støtteben og 1,106 for rektangulære udkragninger.
  13. I Thermal Tune menuen skal du klikke Acquire data for at opnå en termisk melodi kurve (figur 3B). Ved hjælp af AFM software, sted røde linjer på hver side af kurven (som vist i figur 3B) ved at trække musen i fra kanten af grafen for at definere grænserne for montering. Vælg enten Lorentzian (Air) eller den simple harmoniske oscillator (Fluid) model, afhængigt af hvilken bedre passer til data.
  14. Klik Fit data, så Beregn Spring K og gemme denne værdi. Retørv Fjederkonstanten kalibreringer flere gange og bruge den gennemsnitlige værdi. Klik Træk flere gange.
  15. Fjern AFM hoved fra mikroskopet scenen og placere den på tilpasning enhed. Fjern fadet fra mikroskopet scenen.

Figur 3
Figur 3: AFM Tving Kurver Brugt i Kalibrering af AFM Probes. (A) En repræsentativ AFM kraft kurve (en kalibreringskurve). Forlængelsen del af kraft kurve mellem den lodrette røde linjer blev anvendt til bestemmelse cantilever deformation følsomhed. (B) En simpel harmonisk oscillator fit graf anvendes til at beregne fjederkonstanten af cantilever som tidligere beskrevet 20. Venligst klik her for en større version af denne figur.

Ex Vivo

  1. Placer 60 mm dyrkningsskål indeholdende aortavæv på objektbordet, og fastgør pladen med pladen holder magnetisk.
  2. Placer AFM hovedet på objektbordet. Sørge for, at AFM probe ikke komme i kontakt med aorta men forsigtigt får kontakt med PBS og danner en menisk. Hvis det er nødvendigt, skal du placere AFM hovedet på tilpasningen enhed og klik Træk, indtil der er nok plads til at forhindre kontakt, og derefter placere AFM hovedet på mikroskopet scenen.
  3. Klik Naviger. Brug joysticket eller klikke på 'Down' pil, langsomt sænke AFM sonden at lokalisere cantilever over aorta. Juster fotodiode position ved hjælp af detektor positionering knopper på AFM hovedet, hvis det er nødvendigt.
  4. Klikke Engage at tillade udliggeren at få kontakt med aorta.
  5. Nåraorta er engageret, sikre, at piezo center er stabil og klik Rampe. Hvis piezo center er svingende, kan dette være resultatet af en falsk engagement. Trække sonden og øge den lodrette forskydning af laseren på fotodioden i små trin (~ 0,5 V) og re-engagere.
    1. Også, hvis sonden er langt over prøvens overflade, manuelt sænke sonden tættest på prøve overfladen før genbrug engagerende. Hvis de forrige trin ikke eliminere udsving, prøv at udveksle sonden.
  6. Indstil Rampe Size til 3 um, Trigger Mode til Relativ og Trigger Threshold til 100 nm, og klik Rampe Kontinuerlig. Bemærk at kontaktpunktet mellem proben og prøven ses cirka midten til den nedre ¾ af Z rampen cyklus. Hvis dette ikke overholdes, frigøre sig fra prøven, justere Ramp størrelse efter behov, og re-engagere prøven.
  7. Klik Mikroskop i menulinjen og derefter Engage Indstillinger. Skift SPM Træk til 30 um. Klik Rampe Kontinuerlig i menuen Rampe Toolbar.
  8. Efter at have observeret den kraft kurve, skal du klikke på Capture i menulinjen og derefter Capture Filnavn. Indtast det ønskede filnavn med slutningen "0,000" (dette vil give yderligere tilfangetagne filer at stige i antal ved 1). Vælg en udpeget-mappe og gemme dataene.
  9. Klik Capture i menuen Capture Toolbar. Klik Træk og derefter Naviger. Brug joysticket eller software kontrol for at placere cantilever over et andet område af aorta (ved siden af den oprindeligt målte punkt, se figur 4).
  10. Klik Engage, Ramp og Ramp Kontinuerlig hhv. Efter at have observeret den kraft kurve, skal du klikke på Stop Capture.
  11. Gentag trin 6.9 - 6.10. Capture mindst 5 målinger pr område som vist i figur 4 BEMÆRK: Vi typisk indsamler 15 - 25 kraft Kurverne fra 3 - 5 forskellige steder i hvert væv som vist i figur 4..

Figur 4
. Figur 4: tegning af en Cantilever Nærmer og indrykning af væv (område 1) Denne AFM målingen gentages op til 15 - 25 gange fra 3 - 5 forskellige steder (område 1 - 5) i hver arterie at erhverve stivheden af den samlede vævsprøve. klik her for at se en større version af dette tal.

7. Data Analysis

  1. Åben kraftkurve analyse software.
  2. Click Find og Åbn i menulinjen, og dobbeltklik på en fil, der skal analyseres.
  3. Klik på Rediger Tving Parametre i værktøjslinjen menuen for at kontrollere afbøjning følsomhed, Spring Constant, Tip Radius, Tip Half Angle og Poissons forhold. For at ændre parametrene markere feltet ved siden af ​​den og indtaste de korrekte værdier i den nye værdi kolonnen. Klik derefter på Udfør.
  4. Hvis force kurver er støjende, klik Boxcar Filter og sæt input til Retning at forlænge, Point i Gennemsnit til 3 og Filter Bestil til 0 th. Klik Udfør for at udjævne data.
  5. Klik Baseline Correction i menulinjen, og sæt indgange for Retning at forlænge, Plot Enheder til Force Type til Separation, Korrektion for at 1. og Extend Baseline Source Udfør.
  6. Klik Indrykning i værktøjslinjen menuen og sæt indgange for Aktiv Curve til Extended, Fit Metode til kontaktpunkt Based, kontaktpunkt Algoritme til Behandles som Fit Variabel, Medtag Vedhæftning Kraft til Nej, Max Kraft Fit Boundary til 30%, Min Kraft Fit Boundary til 0% og Fit Model til Hertz (Sfærisk).
    BEMÆRK: I vores målinger, blev betydelig vedhæftning mellem spidsen og prøve (en negativ afbøjning af cantilever i tilbagetrækning kurve) sjældent observeret. I tilfælde, hvor der er observeret en sådan vedhæftning, bør passende model (DMT eller JKR) bruges til analyse 18,19.
  7. Gemme værdierne af Youngs modul. Analysere Youngs (elastisk) modul for hver af de 3- 5 områder (5 force kurver per areal) taget inden for en lille afstand af hinanden som vist i figur 4.
    BEMÆRK: For at fjerne artefakter, udelukker Youngs moduli> 100 kPa (normalt ~ 10% af de samlede målinger) fra analysen.
  8. Beregne en gennemsnitlig Youngs modulus værdi for hver af de 3 - 5 områder (der er blevet målt) og bruge disse værdier til at beregne en gennemsnitlig elasticitetsmodul for aorta som helhed.
    BEMÆRK: Mindst 3 og oftere 4 - 6 individuelle aorta anvendes for at opnå en nøjagtig vurdering af arteriel stivhed. De endelige resultater er plottet som middeltal + SEM af "n" uafhængige forsøg. Det nøjagtige antal af aorta nødvendige vil naturligvis afhænge af niveauet af nøjagtighed, der kræves.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5A viser en fase kontrast billede af den nedadgående (thorax) aorta fra en 6-måneder gammel, C57BL / 6 mus. AFM cantilever er på plads direkte over vævet og klar til indrykning. Figur 5B og 5C demonstrere repræsentative kraft kurver opnået ved AFM fordybning i kontakt mode. Grønne linjer vist i fig 5B og 5C repræsenterer den bedste pasform kurver opnået under anvendelse af Hertz model for en kugle. I figur 5D blev den gennemsnitlige stivhed af den nedadgående aorta og aorta buer bestemt fra tre individuelle mus som beskrevet i teksten. Bemærk, at aorta descendens og aortabuen repræsenterer regioner af laminar og forstyrret flow hhv. Ikke desto mindre er deres (mekanisk losset) elastiske moduli ligner bestemt ved AFM.

0 / 54630fig5.jpg "/>
Figur 5: De analyserede Kraft-indrykning Curves og stivhed data (A) Fasekontrastmikrografi viser en AFM cantilever over en mus nedadgående aorta ex vivo.. Scale bar, 100 pm. (BC) Et sæt af to repræsentative kraft-indrykning kurver erhvervet til (B) aorta descendens og (C) aortabuen. (D) Mean stivhed af muse nedadgående aorta og aortabuen blev bestemt som beskrevet ovenfor. Fejl søjler viser middelværdi + SEM; n = 3 uafhængige biologiske gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM indrykning kan anvendes til at karakterisere stivhed (elasticitetsmodul) af celler og væv. I dette papir, giver vi detaljerede trin-for-trin-protokoller til at isolere den nedadgående aorta og aortabuen i musen og bestemmer elasticitetsmoduler af disse arterielle regioner ex vivo. Vi har nu sammenfatte og diskutere de tekniske problemer og begrænsninger er beskrevet i dette papir metode.

Flere tekniske problemer kan opstå i isolering og analyse af mus aorta givet deres små og tynde natur. Når de rengjorte arterier bliver åbnet på langs, skal man passe på ikke at forstyrre intima (luminale overflade), hvor den elastiske modulus data indsamles. Overskydende PBS i den endelige prøve parabol forhindrer korrekt limning af arterierne på fadet, og det skal fjernes forsigtigt ved hjælp af et papir væv uden at røre arterien før limning. Bemærk dog, at den isolerede arterie kan holde sig til det papir væv while forsøger at fjerne overskydende PBS, og dette kan beskadige prøven. Mens limning arterierne til dyrkningsskålen, er det yderst vigtigt, at arterien ikke strækkes, og at kun en lille mængde klæbemiddel påføres bit-for-bit til hver ende af arterien. Ved udførelse AFM-indrykning, er det afgørende at undgå sondering ved enderne af arterien, hvor klæbemidlet er blevet påført. Endelig fordi frisk isolerede arterier anvendes til målinger af elasticitetsmodul, forløbet tid fra høst til måling bør minimeres.

Da de sfæriske tips anvendt i denne undersøgelse har en radius på 500 nm, kan en fordybning dybde på op til 500 nm være nøjagtigt analyseret ved anvendelse af Hertz-modellen. Denne indrykning dybde ville korrelere med det øverste lag af endotelceller, beliggende i intima 21. For at undersøge mekanikken i sub-endotel lag af arterielle prøver, større kolloide prober (10 - 20 um i diameter) kan brugesfor indrykning og ændringer i den beregnede stivhed med indrykning dybde kunne bestemmes 22,23. Eftersom biologiske prøver er normalt viskoelastiske snarere end rent elastisk, stress afslapning målinger (overvågning henfaldet i påførte kraft ved en konstant indrykning dybde) kan anvendes til at bestemme den viskøse bestanddel af arterielle mekaniske egenskaber 24,25.

En potentiel begrænsning af AFM analyse er scanningen størrelse, som kun måler en lille region af vævet. De fleste biologiske prøver, herunder arterier og celler, kan ikke topografisk og biomekanisk homogen, og denne heterogenitet kan potentielt resultere i artifactually store variationer af elasticitetsmodulet afhængigt glathed indrykningen site, indrykning dybde, og den kraft, der påføres prøven overflade. At opnå en repræsentativ middelværdi af den samlede elasticitetsmodul, er det vigtigt at udføre gentagne AFM-indrykning at flere tilfældige steder gennem arterierne, som vist i figur 4. Ydermere benyttes en passende størrelse sfærisk spids, som tidligere undersøgelser har vist, at AFM-indrykning med en skarp pyramideformet spids resulterede i højere estimater af elasticitetsmodulet og beskadiget blødt biologiske prøver 26,27.

Selvom vores ex vivo AFM målinger af arteriel stivhed synes at stemme godt med molekylære markører for glatte muskelceller afstivning 2, er det vigtigt at indse, at disse arterielle prøver ikke er mekanisk belastet, og mekanisk belastning er sandsynligvis spiller en vigtig rolle i den samlede arterielle mekanik. Sammenligninger af arteriel stivhed som bestemt ved AFM, myography (en ex vivo fremgangsmåde kompatibel med mekanisk belastning) 28 og puls-bølgehastighed (en in vivo måling af arteriel stivhed) 29 vil sandsynligvis give den mest omfattende forståelse af Arterial mekanik.

Vi har beskrevet AFM i kontakt mode til at måle ex vivo stivhed mus arterier. Denne metode anslår den gennemsnitlige væv stivhed ved tilfældigt indrykning på flere områder af aorta. For at undersøge den rumlige fordeling af stivhed fra større områder af væv, har en nylig papir, der anvendes AFM gældende volumen tilstand 30. Denne fremgangsmåde samtidigt opnået et kort over stivhed variationer og en høj-opløsning billede af topografiske overflade af vævet. Ud over at måle stivheden af vævsprøver, kan AFM gældende volumen tilstand anvendes i celler til overvågning af rumlige fordelinger af intracellulær stivhed 10,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Tags

Biofysik elasticitet Youngs modul kraft AFM hjerte-kar-mekanik mechanobiology ekstracellulær matrix
Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F.… More

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter