Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måle Stivhet Published: October 19, 2016 doi: 10.3791/54630
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 1,2
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

Abstract

Arteriell avstiving er en betydelig risikofaktor og biomarkør for kardiovaskulær sykdom og et kjennetegn på aldring. Atomkraftmikroskopi (AFM) er et allsidig analytisk verktøy for å karakterisere viskoelastiske mekaniske egenskaper for en rekke materialer som strekker seg fra hard (plast, glass, metall, etc.) overflater til celler på en hvilken som helst substrat. Det har blitt mye brukt for å måle stivheten av celler, men mindre hyppig benyttet for å måle stivheten av aortaer. I denne artikkelen vil vi beskrive prosedyrene for bruk av AFM i kontakt modus for å måle ex vivo elastisitetsmodul ubelastede muse arterier. Vi beskriver vår prosedyre for isolering av mus Aorta, og deretter gi detaljert informasjon AFM analyse. Dette inkluderer steg-for-trinn-instruksjoner for justering av laserstrålen, kalibrering av fjærkonstanten og nedbøyning følsomheten til AFM sonde, og kjøp av kraft kurver. Vi tilbyr også en detaljert protokoll for data analysis av kraftkurvene.

Protocol

Animal arbeid i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer ved University of Pennsylvania. Metodene ble utført i samsvar med vedtatte retningslinjer.

1. Klargjøring av mus og isolering av Aorta

  1. Bedøve en mus med ketamin (80-100 mg / kg), xylazin (8 - 10 mg / kg) og acepromazin (1 - 2 mg / kg) intraperitonealt. Bekreft anestesi med en haleklypetesten. Når musen er fullt bedøvet, avlive mus ved halshugging.
  2. Plasser musen på ryggen og pin musen til en disseksjon bord. Rengjør magen området med 70% (v / v) etanol våtservietter.
  3. Knip huden på midtlinjen og lage en liten innledende snitt med mellomstore mikrokirurgi saks på magen. Mens du holder huden med tang, bruke mellomstore mikrokirurgi saks til å klippe i huden og bukhinnen fra magen til brystbenet.
  4. Skjær bort ribbeina på bklien sider med mellomstore mikrokirurgi saks. Fjern forsiktig lungene og leveren med liten størrelse mikrokirurgi saks, og la hjerte og aorta. Overfør musen og disseksjon bord til en dissekere mikroskop.
  5. Ta tak i fettet rundt aorta med små pinsett og bruke små saks til å nøye klippe bort fett rundt aorta.
  6. Forsiktig ta tak i aorta med pinsett, lage en klippe med liten størrelse mikrokirurgi saks ved begynnelsen av den oppstigende aorta og annet kutt på slutten av den synkende aorta, like ovenfor abdominal aorta.
  7. Overfør dissekert aorta til en 60 mm skål inneholdende 1 x fosfatbufret saltvann (PBS; uten kalsium og magnesium).
  8. Fortsett å dissekere vekk eventuelle gjenværende fettvev fra aorta ved hjelp av små størrelser mikrokirurgi saks. Bruk liten saks for å åpne hovedpulsåren i lengderetningen.
  9. Bruk små størrelser mikrokirurgi saks for å klippe et lite stykke (~ 2 x 4 mm) i synkende aorta og aortic bue for AFM analyse (figur 1). Plasser vevet i en 60-mm plastskål og holde det fuktig i en dråpe PBS.

Figur 1
Fig. 1: Et bilde som viser plasseringen av de ulike Aorta segmenter i en mus Aorta ble isolert fra hjertet til membranen, og en liten del av den nedadgående aorta, og aortabuen ble anvendt for å bestemme elastisitetsmodulene. Scale bar, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Å vevsprøver for AFM Målinger

  1. Fjern PBS forsiktig med en lab-tørke uten å berøre aorta. Vær sikker på at den luminal siden av vev vender opp.
  2. Forsiktig lim hver ende av den åpnede aorta til platen ved add ing 5 - 10 mL av cyanoacrylate lim med en gel-lasting spissen (figur 2).
    MERK: Mengden av lim for å fast feste vev i hver ende må bestemmes empirisk. Det er viktig at aorta ikke strekkes under denne prosessen.
  3. Sjekk limt aorta for å være sikker på at det ikke er brettet eller flytende. Etter lufttørking limet på aorta (30-60 sek), tilsett PBS og senk prøven.
    MERK: Forberedelse AFM (trinn 3-5) kan utføres mens vevet blir klargjort for analyse.

Figur 2
Figur 2: Cartoon av en aortic Segment limt på en 60-mm Kultur oppvask hjelp Cyanoakrylat-lim Den cyanoacrylate lim blir brukt til kanten av en aorta prøve i forberedelse til AFM målinger..com / filer / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Sette i Probe

  1. Monter en væske probeholder på sonden last stand.
  2. Ved hjelp av pinsett, skyver et silisiumnitrid AFM-probe (0,06 N / m cantilever) med en sfærisk spiss (vi har brukt en 1-mikrometer diameter SiO2 partikkel men større størrelser kan også benyttes) på sonden holder. Kontroller at AFM sonden er godt festet til probeholder.
  3. Skyv probeholder på Z-skanner montere av AFM hodet, og sørge for at probeholder er godt festet.

4. Justere Laser på Probe

  1. Åpne AFM programvare. Velg forsøket typen på programvare; Experiment Kategori til Kontakt Mode, Experiment Group Kontakt Mode til Kontakt Mode i væske i væske og Experiment. Klikk Load experiment i programvaren; dette vil slå på laseren.
  2. Tilsett 3 ml destillert vann til en 50-mm glassbunn fatet og sett formen på scenen av laser justering enhet. Denne enheten forenkler prosessen med å fokusere laserstrålen på baksiden av cantilever.
  3. Monter AFM hodet i oppreist stilling på laser justering enheten og slå på laser justering enhet. Tilsett ca. 50 mL destillert vann for å danne en dråpe på AFM spissen.
  4. Ved hjelp av styrespaken, senk AFM hodet slik AFM spissen kommer i kontakt med vann i fatet. Hvis kontakten ikke er gjort mellom AFM spissen og vann i fatet, forsiktig heve retten til kontakt. Juster fokus, lysstyrke og XY posisjon slik at AFM spissen er i visningen på LCD-skjermen på justeringen enheten.
  5. Plasser laser spot på tuppen av AFM sonde ved å justere laser posisjonering knottene av AFM hodet. Bruke detektor posisjonerings knottene på AFM hodet, justere position av fotodioden til verdier mellom 0 og -1 V erholdes for den vertikale avbøyning og ~ 0 V oppnås for horisontal avbøyning.
  6. Sjekk for å sikre at lasers sumsignalet blir maksimalisert. Hvis det er nødvendig, gjenta trinn 4.5 for å etterjustere den stilling av laserstrålen på AFM spissen og posisjonen til fotodioden for å oppnå den maksimale sum-signalet.
    NB: Det kan være nødvendig å omplassere AFM sonde på sonden holder for å oppnå et maksimalt sumsignal selv om trinn 4.5 blir gjentatt.

5. Kalibrering av Deflection følsomhet og Spring Konstant av AFM Probe

  1. Lag en ripe på en 60-mm kultur parabolen med en forcep og fylle tallerken med destillert vann. Plasser kulturen fatet på prøveholderen plate. I dette tilfellet, montere parabolen på motoriserte XY skanning stadium av en invertert mikroskop.
  2. Plasser en magnetisk plate holder på toppen av platen for å holde det trygt under bildebehandling.
  3. Klikk MERK: Dette trinnet er svært viktig fordi det unngår å bryte AFM spissen.
  4. Plasser AFM hodet på mikroskopet scenen.
  5. Bruk mikroskop for å fokusere på scratch på tallerkenen. Bruk styrespaken, eller klikk på 'Down' pilen i navigasjonsmenyen, sakte og senk AFM sonde inn i PBS. Plasser hodet litt over ripe i platen.
    MERK: Hvis utgangsstillingen av AFM hodet er nærmere prøven, den engasjere tid vil bli betydelig redusert.
  6. Før inngrep, gjen justere plasseringen av laserstrålen på AFM spissen og posisjonen til fotodioden for å oppnå maksimal sumsignalet som er nødvendig.
  7. Velg et tips type ved å klikke Endre Probe i oppsettmenyen. Klikk Kontroller Parametere og sette parametre: Scan Size til 0, Scan Rate til en Hz, Sample / linje til 256 og Nedbøyning Setpoint til 20 nm. Klikk Engage. Statusvinduet Engage vil forbli åpen til sonden kommer i kontakt med overflaten av platen. Etter engasjerende sonden, klikk Ramp.
  8. Klikk Utvidet modus i menyen Scan Toolbar og sette parametre: Ramp størrelse til mellom 500 nm og en mikrometer, Ramp Frekvens til 2 Hz, antall prøver som 256, Tips Radius til 500 nm, Sample Poissons tall til 0,5 (forutsetter materialet som skal måles er helt inkompressibel), Tip Half Angle til 0, Trigger Mode til relativ og Trigger Terskel til mellom 20 og 100 nm.
  9. Klikk Ramp Kontinuerlig i menyen Ramp-verktøylinjen for å obtai en kraft kurve på platen (figur 3A). I denne kraften kurven, setter kanal 1 til nedbøyning feil.
    MERK: Dette vil tillate programvaren til å tegne resultatene som vertikal avbøyning vs z posisjon.
    1. Klikk på venstre eller høyre ende av kraft kurven og dra markøren til å omfatte en lineær region av kraften kurven (figur 3A, stiplede røde linjer). Bruk disse to linjene for å markere grensene for skrå regionen til å være passe med en rett linje.
  10. Velg Ramp i verktøylinjen, og klikk på Oppdater sensitivitet. Spill verdien og gjenta dette trinnet fire ganger. Velg Kalibrer i verktøylinjen, og klikk deretter Detector. Input en gjennomsnittsverdi fra de fem målinger i avbøyning Sensitivity boksen.
  11. Klikk Trekk 2 - 3 ganger for å heve AFM hodet. Dette trinn er viktig for å forebyggeSamspillet mellom AFM spiss og plate under den termiske melodi prosessen. Klikk Termisk Tune i verktøylinjen.
  12. Sett Termisk Tune Utvalg av 1-100 kHz (Denne informasjon kan fås fra produsentens katalog) og avbøyning Følsomhet Rettelse til 1,144 for v-formet bommer og 1,106 for rektangulære bom.
  13. I Thermal Tune-menyen klikker innhente data for å få en termisk tune kurve (figur 3B). Ved hjelp av AFM programvare, sted stiplede røde linjer på hver side av kurven (som vist i figur 3B) ved å dra musen i fra kanten av grafen for å definere grensene for montering. Velg enten Lorentzian (luft) eller Simple Harmonic oscillator (Fluid) modell avhengig av hvilken bedre passer dataene.
  14. Klikk Fit data, deretter Beregn Spring K og lagre denne verdien. Retorv fjærkonstanten kalibreringer flere ganger og bruker gjennomsnittsverdien. Klikk Trekk flere ganger.
  15. Fjern AFM hodet fra mikroskopet scenen og plassere den på justeringsenheten. Fjern fatet fra mikroskopet scenen.

Figur 3
Figur 3: AFM Force Curves brukes i kalibrerings av AFM sonder. (A) En representativ AFM kraft kurve (en kalibreringskurve). Forlengelsen del av kraften kurven mellom den vertikale stiplede røde linjer ble anvendt for å bestemme cantilever nedbøyning følsomhet. (B) En enkel harmonisk oscillator skikket kurve som brukes til å beregne den fjærkonstant av braket som tidligere beskrevet 20. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Ex Vivo

  1. Plasser 60-mm kulturskål inneholdende aortavev på mikroskopet scenen, og å feste platen med magnetplaten holderen.
  2. Plasser AFM hodet på mikroskopet scenen. Vær sikker på at AFM sonde gjør ikke kontakt med aorta, men forsiktig kommer i kontakt med PBS og danner en menisk. Om nødvendig, plasser AFM hodet på justeringen enheten og klikk Uttak til det er nok klaring for å forhindre kontakt, og deretter plassere AFM hodet på mikroskopet scenen.
  3. Klikk på Naviger. Ved hjelp av joysticken eller klikke "ned" pil, sakte lavere AFM sonde for å finne cantilever over aorta. Juster fotodioden posisjon ved hjelp av detektoren posisjonerings nupper på AFM hodet om nødvendig.
  4. Klikk på Aktiver for å tillate cantilever å få kontakt med aorta.
  5. Først nåraorta er engasjert, sikre at piezo sentrum er stabil og klikk Ramp. Dersom det piezo sentrum er varierende, kan dette være et resultat av en falsk inngrep. Trekke tilbake sonden og øke den vertikale forskyvning av laseren på fotodioden ved små trinn (~ 0,5 V) og re-inngrep.
    1. Likeledes, hvis sonden er langt over prøvens overflate, manuelt senke sonden nærmere prøvens overflate før fornyet inngrep. Hvis de foregående trinnene ikke eliminere svingninger, prøve å bytte sonden.
  6. Sett Ramp størrelse til 3 mikrometer, Trigger Mode til relativ og Trigger Threshold til 100 nm og klikk Ramp kontinuerlig. Legg merke til at kontaktpunktet mellom sonden og prøven forekommer omtrent ved sentrum til den nedre ¾ av Z rampen syklus. Hvis dette ikke følges, frigjøres fra prøven, justere Ramp størrelse etter behov, og re-engasjere prøven.
  7. Klikk Microscope i menylinjen og deretter engasjere Innstillinger. Endre SPM Uttak med 30 mikrometer. Klikk Ramp Kontinuerlig i menyen Ramp-verktøylinjen.
  8. Etter å observere styrken kurven, klikk Capture i menylinjen og deretter Capture filnavn. Skriv inn ønsket filnavn med avslutningen "0,000" (dette vil tillate ytterligere lagrede filene å øke i antall etter en). Velg en utpekt-mappe og lagre dataene.
  9. Klikk Capture i Capture Toolbar menyen. Klikk på Uttak og deretter navigere. Bruk Joystick eller programvarekontroller for å plassere cantilever over et annet område av aorta (ved siden av opprinnelig målt punkt, se figur 4).
  10. Klikk Engage, Ramp, og Ramp Kontinuerlig, henholdsvis. Etter å observere styrken kurven, klikker du Stopp Capture.
  11. Gjenta trinn 06.09 til 06.10. Capture minst 5 målinger pr område som vist i figur 4 MERK: Vi innhenter vanligvis 15 - 25 styrkekurvene fra 3 - 5 forskjellige steder i hvert vev, som vist i figur 4, respektivt..

Figur 4
. Figur 4: Cartoon av en Cantilever Nærmer og innrykk vevet (Area 1) Denne AFM målingen gjentas opptil 15 - 25 ganger fra 3 - 5 forskjellige steder (Areas 1 - 5) i hver arterie å erverve stivhet av den samlede vevsprøve. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

7. Data Analysis

  1. Åpne kraft kurve analyse programvare.
  2. Click Finn og Open i menylinjen, og dobbeltklikk på en fil som skal analyseres.
  3. Klikk Endre Force Parametere i verktøymenyen for å kontrollere nedbøyning følsomhet, Spring Constant, Tip Radius, Tip Half Vinkel og Poissons tall. For å endre parametrene av i boksen ved siden av den og skriv inn de riktige verdiene i den nye verdien kolonnen. Klikk deretter på Utfør.
  4. Dersom force kurver er bråkete, klikk Boxcar Filter og sette innganger for Direction å forlenge, Gjennomsnittlig poeng til 3 og Filter Rekkefølge til 0 th. Klikk Utfør for å jevne ut data.
  5. Klikk Baseline Korreksjon i menylinjen, og still innganger for Direction å utvide, Plot Units til Force, Type til separasjon, Korreksjon for å 1. og Extend Baseline Source Kjør.
  6. Klikk Innrykk i verktøymenyen og angi innganger for Active Curve i Extended, Fit Metode til kontaktpunkt Basert, Contact Point algoritme for å behandle som Fit Variable, Inkluder Adhesjon Force til Nei, Max Force Fit Boundary til 30%, Min Force Fit Boundary til 0% og Fit modell til Hertzian (sfæriske).
    MERK: I våre målinger, ble signifikant adhesjonen mellom spissen og prøven (en negativ bøyning av cantilever i tilbaketrekkings kurve) sjelden observert. I tilfeller der slik malingen sitter, bør den aktuelle modellen (DMT eller JKR) brukes til analyse 18,19.
  7. Lagre verdiene av Youngs modul. Analyser Youngs (elastisk) modul av hver av de tre- 5 soner (5 styrkekurvene per areal) tatt innenfor en liten avstand fra hverandre, som vist i figur 4.
    MERK: For å fjerne gjenstander, utelukker Youngs moduler> 100 kPa (vanligvis ~ 10% av totale målinger) fra analysen.
  8. Beregne en midlere elastisitetsmodul verdi for hver av de 3 - 5 områder (som blir målt), og bruke disse verdiene til å beregne en midlere elastisitetsmodul for aorta som en helhet.
    MERK: Minst tre og oftere 4 - 6 individuelle Aorta er vant til å få en nøyaktig vurdering av arteriell stivhet. De endelige resultatene er plottet som gjennomsnitt + SEM av "n" uavhengige eksperimenter. Det nøyaktige antallet Aorta nødvendig vil selvfølgelig avhenge av den grad av nøyaktighet som kreves.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5A viser en fasekontrast bilde av synkende (thorax) aorta fra en seks måneder gammel, mannlig C57BL / 6 mus. AFM cantilever er på plass rett over vev og klar for innrykk. Tall 5B og 5C viser representative kraftkurver innhentet av AFM innrykk i kontakt modus. Grønne linjer er vist på figurene 5B og 5C representerer de best tilpassede kurver som oppnås ved hjelp av Hertzian modell for en sfære. På figur 5D, ble den midlere stivhet i synkende Aorta og aorta buer bestemt fra tre individuelle mus som beskrevet i teksten. Merk at synkende aorta og aortabuen representerer regioner i laminær og forstyrret flyten, henholdsvis. Ikke desto mindre, deres (mekanisk losses) elastisitetsmoduler er tilsvarende som bestemmes av AFM.

0 / 54630fig5.jpg "/>
Figur 5: analysert Force-innrykk Curves og Stivhet Data (A) Fase kontrast micrograph viser en AFM cantilever over en mus synkende aorta ex vivo.. Scale bar, 100 mikrometer. (BC) Et sett med to representative kraft-skår kurver ervervet for (B) den synkende aorta og (C) aortabuen. (D) Mean stivhet av musen synkende aorta og aortabuen ble bestemt som beskrevet ovenfor. Feilsøylene viser gjennomsnittet + SEM; n = 3 uavhengige biologiske replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM skår kan brukes til å karakterisere stivhet (elastisitetsmodul) av celler og vev. I denne artikkelen gir vi detaljerte steg-for-trinn-protokoller for å isolere den synkende aorta og aortabuen i musen og bestemme elastisitetsmodulene av disse arterielle regioner ex vivo. Vi oppsummerer nå og diskutere tekniske problemer og begrensninger ved metoden beskrevet i denne artikkelen.

Flere tekniske problemer kan oppstå ved isolering og analyse av mus Aorta gitt sin lille og tynne natur. Når de rensede blodårene blir åpnet i lengderetningen, må man passe på ikke å forstyrre intima (luminal overflate) hvor elastisitetsmodulen data samles inn. Overflødig PBS i den endelige prøven fatet forhindrer riktig liming av arteriene på fatet, og dette må fjernes forsiktig ved hjelp av et papirlommetørkle uten å berøre arterie før liming. Vær imidlertid oppmerksom på at det isolerte arterie kan holde seg til silkepapir WHIle forsøk på å fjerne overdreven PBS, og dette kan skade prøven. Selv om liming arteriene til kulturskålen, er det svært viktig at arterien ikke strekkes, og at bare en liten mengde av klebemiddel påføres bit-for-bit til hver ende av arterien. Når du utfører AFM-innrykk, er det avgjørende å unngå sondering i endene av arterien der limet er påført. Til slutt, fordi nylig isolerte arterier er brukt til målinger av elastisitetsmodulen, den tiden som har gått fra fangst til måling bør minimaliseres.

Siden de sfæriske tips brukt i denne studien har en radius på 500 nm, kan en fordypning dybde på opp til 500 nm være nøyaktig analysert ved hjelp av Hertz modell. Dette innrykk dybde ville korrelere med det øverste laget av endotelceller som ligger i intima 21. Å sondere mekanikken i sub-endothelial lag av arterielle prøver, større kolloidale sonder (10 - 20 mikrometer i diameter) kan brukesfor innrykk og endringer i beregnede stivhet med innrykk dybde kunne bestemmes 22,23. Også, siden biologiske prøver er vanligvis viskoelastisk i stedet for rent elastisk, stress avspennings målinger (som overvåker råte hos påførte kraften ved en konstant dybde innrykk) kunne brukes til å bestemme den viskøse komponenten av arterielle mekaniske egenskaper 24,25.

En potensiell begrensning av AFM analyse er skanne størrelse, som bare måler et lite område av vev. De fleste biologiske prøver, inkludert arterier og celler, er ikke topografisk og biomekanisk homogen, og denne heterogeniteten kan potensielt resultere i artifactually store variasjoner i elastisitetsmodulen avhengig av glattheten til innrykk området, hakk dybde, og mengden av kraft som påføres prøven flate. For å oppnå et representativt midlere verdi av den totale elastisitetsmodul, er det viktig å utføre gjentatte AFM-skår ent flere tilfeldige steder gjennom arteriene, som vist i Figur 4. Videre bruker vi en passende størrelse sfærisk spissen, som tidligere studier har vist at AFM-innrykk med en skarp pyramide tips førte til høyere estimater av elastisitetsmodul og skadet myk biologiske prøver 26,27.

Selv om våre ex vivo AFM målinger av arteriell stivhet ser ut til å være enig godt med molekylære markører for glattmuskelcelle avstivning 2, er det viktig å innse at disse arterielle prøvene ikke er mekanisk lastet, og mekanisk belastning er sannsynlig å spille en viktig rolle i den samlede arterielle mekanikk. Sammenligninger av arteriell stivhet som fastsatt av AFM, myography (en ex vivo metode som er kompatibel med mekanisk belastning) 28 og puls-bølgehastighet (en in vivo måling av arteriell stivhet) 29 vil trolig gi den mest omfattende forståelse av arterial mekanikk.

Vi har beskrevet AFM i kontakt modus for å måle ex vivo stivhet i mus arterier. Denne metoden beregner den gjennomsnittlige vev stivhet ved tilfeldig å rykke inn på flere regioner av aorta. For å undersøke den romlige fordelingen av stivhet fra større regioner av vev, har en nyere artikkel som brukes AFM i kraft volum modus 30. Denne tilnærmingen samtidig fått et kart over stivhet variasjoner og et høyoppløselig bilde av topografiske overflaten av vevet. I tillegg til å måle stivheten av vevsprøver, kan AFM i kraft-volum-modus brukes i celler for å overvåke den romlige fordelinger av intracellulær stivhet 10,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Tags

Biofysikk elastisitet Youngs modulus kraft AFM hjerte- og mekanikk mechanobiology ekstracellulære matrise
Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F.… More

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter