Summary
Følgende artikel giver en nem, reproducerbar teknik til effektivt at skabe et bæredygtigt musemodel af limbal stamcelle-mangel (LSCD). Denne dyremodel er nyttig til at teste og sammenligne effektiviteten af behandlinger for limbale stamcellelinjer sygdomme.
Abstract
Limbal stamcelle-mangel (LSCD) er en tilstand af fejlfunktion eller tab af limbale epiteliale stamceller, hvorefter hornhindens epitel er erstattet med bindehinde. Patienterne lider af tilbagevendende hornhindedefekter, smerte, inflammation og tab af synet.
Tidligere blev en murin model for LSCD beskrevet og sammenlignet med to andre modeller. Målet var at producere en konsistent musemodel for LSCD at begge efterligner fænotype hos mennesker og varer længe nok til at gøre det muligt at undersøge sygdommens patofysiologi og evaluere nye behandlinger. Her er teknikken beskrevet mere detaljeret.
En motoriseret værktøj med en roterende grat er designet til at fjerne rust ringe fra hornhindens overflade eller til at udjævne pterygium seng i patienter. Det er en egnet anordning til at skabe den ønskede LSCD model. Det er en let tilgængelig, let at bruge værktøj med en fin spids, der gør det egnet til at arbejde på små øjne, somi mus. Dens anvendelse forhindrer unødige trauma for øjet og det resulterer ikke i uønskede skader, som det ofte er tilfældet med kemisk skade modeller. I modsætning til en stump skraber, det fjerner epithelet med basalmembranen. I denne protokol, blev limbale område slibes to gange, og så er hele hornhindens epitel blev barberet fra limbus til limbus. For at undgå stroma skade, blev der draget omsorg for ikke at børste hornhindeoverfladen når epithelet allerede var fjernet.
Introduction
Hornhindens epitel er nødvendig for at opretholde klarhed og integritet af hornhinden. Det er hele tiden fornyes gennem hele livet af de epiteliale stamceller bosiddende i limbus-en smal zone ved krydset af hornhinden og bindehinden. Disse selv-fornyende limbale stamceller spiller en afgørende rolle i at regenerere hornhindeepitelet, både normalt og efter skaden. Delvis eller fuldstændig udtømning af disse stamceller vil resultere i tilbagevendende hornhinde erosioner, smerter, hornhinde ardannelse og neovaskularisering, udseende slimceller, og hvis venstre ubehandlet, hornhinde blindhed. Denne betingelse er kendt som limbal stamcelle-mangel (LSCD) og kan være idiopatisk; arvelig; eller erhvervet som følge af kemiske eller termiske skader, langsigtede kontaktlinser slid, og kronisk inflammation 1-6.
Forskning i LSCD kræver en passende dyremodel, at ikke kun efterligner sygdom hos mennesker, men er reproducerbar og bæredygtig, med mindst enmount af skade på andre hornhinde og okulære strukturer. Denne model er nødvendigt at vurdere behandlinger, og at klarlægge de sygdomsmekanismer på molekylære og cellulære niveauer. Som beskrevet før 1, med anvendelse af en roterende Burr, kan man let udvikle en musemodel for LSCD der indeholder de førnævnte fordele og vedvarer i mindst tre måneder. Målet med denne undersøgelse er at præsentere en enkel, reproducerbar, og bæredygtig musemodel af LSCD.
Den roterende Burr er et praktisk værktøj, der jævnt fjerner epitel uden at skade den underliggende stroma en. Det er blevet anvendt til at inducere centrale hornhinde erosion 7, 8 ved sårheling undersøgelser. Den hermed præsenteret teknik til at skabe LSCD i en mus er ikke blevet rapporteret før. Tidligere indførte fremgangsmåder til skrabning epithelet med en stump spatel resultat i en mindre ensartet skade-især ved limbus-og en mere variabel fænotype 1, 9, med mere restaurering of normal hornhindeepitel 1. I modsætning til den stumpe skraber, den roterende grat fjerner epitelbasalmembranen samt 7, 8, 10. Andre rapporterede fremgangsmåder til at udsondre stamceller indebærer brug af kemikalier, såsom natriumhydroxid, n-heptanol, og benzalkoniumchlorid, som ikke kun kan inducere uønsket skade på underliggende øjet strukturer, men også kan føre til betydelig inflammation og efterfølgende corneal uigennemsigtighed eller epithelial squamous metaplasi 11-15. Den roterende burr er ikke forbundet med disse alvorlige komplikationer. Kirurgisk fjernelse af limbale epitel, alene eller med anvendelsen af kemikalier 10, 11, 16, er mere vanskelig at udføre og er ikke den bedste løsning i dyr med små øjne og en tynd limbal epitel (som mus). Desuden overraskende limbectomy kan stadig lade nogle af de limbale epitel bag 10.
Den nedenfor beskrevne teknik vil resultere i LSCD med neovaskularisering end conjunctivalization der efterligner præsentationen af komplette LSCD hos patienter og varer i mindst tre måneder 1. Den er velegnet til dem, der har til formål at studere LSCD eller sårheling patofysiologi, immunologi, og potentielle behandlinger i mus. Muligvis, med nogle ændringer, denne procedure kan udføres på rotter eller kaniner 10. Som det roterende burr effektivt fjerner epithelet, kan det anvendes i en hvilken som helst forskning vedrørende hornhindeepithelets abrasion / sårdannelse og i enhver tilknyttet behandling eller molekylærbiologiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udføres på dyrene opfylder Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi erklæringer til dyr brug i synet forskning. Fjorten fire til seks måneder gamle mandlige / kvindelige C57BL / 6J vildtypemus blev anvendt: ti mus for skaden model og fire som kontroldyr (læderet hornhinder).
1. Dyrepræparation
- Bedøver en mus med en intraperitoneal injektion af en 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin-blanding. Efter bedøvelsen har fået virkning, klemmes tå for at bekræfte anæstesi dybde; Dyret bør ikke reagere.
- Undersøg øjet under en spaltelampe før udførelse af forsøg for at kontrollere, ikke foreligger nogen tidligere hornhinden.
- Instill en dråbe 1% tetracainhydrochlorid til øjet. Efter 60 - 90 sek, teste hornhinderefleks at bekræfte fravær af sensation. Proparacainhydrochlorid 0,5% kan anvendes i stedet.
- Når tabet af hornhinde fornemmelse ervis, forsigtigt placere en dråbe 5% povidon-iod på øjet og på håret omkring øjet. Tør drop efter 1 min eller sprede det på håret omkring øjet for at forhindre håret i at forstyrre værktøjsspidsen.
2. slibe hornhindeepitelet
- Bær kirurgiske handsker og en kjole. Forbered de nødvendige værktøjer: en steril roterende grat og et par sterile pincetter. For bedre kontrol, bruge bøjede pincet. Placer værktøjer på en steril ark under proceduren.
- Under anvendelse af de bøjede pincet, stabilisere øjet ved at gribe lågene fra den nasale side og forsigtigt proptosing øjet. Undgå at bruge for meget pres.
- Under et kirurgisk mikroskop, barbere 360 ° omkring limbale område to gange under anvendelse af den sterile roterende grat. Gå rundt limbus med en hastighed på 5 - 6 sekunder pr runde.
BEMÆRK: Burr har en fast hastighed. Men for det at rotere med den etablerede hastighed, "ende møtrikken" bør helt strammet. - Fjerne hele hornhindens epitel fra limbus til limbus med den roterende grat. For bedre resultater, flytte værktøjet i en cirkulær måde, og hold det lidt parallelt med hornhindens overflade at arbejde med den laterale side af spidsen. Pas på ikke at skade stroma ved ikke re-børste de områder, hvor epitelet allerede er fjernet. Må ikke anvendes nogen form for pres på øjet. Rengør penselspids efter behov.
- Instill en dråbe steril phosphatpufret saltvand på hornhinden og tørre eventuelle fritliggende epithelflader med en blød renseserviet.
- Barbere det resterende epithel, hvis nogen.
- Vær opmærksom på musen halen under operationen.
BEMÆRK: Hvis der opstår enhver bevægelse, har anæstesi dybde falmet og yderligere injektion er påkrævet. En tredjedel til to tredjedele af den primære injicerede volumen skulle være tilstrækkeligt. Må ikke overdosis dyret med den bedøvende medicin. - Sterilisere alle de værktøjer, før du bruger dem på en anden øjet.
3. Bekræft Komplet Epithelial Removal
- En dråbe 1 mg / ml fluorescein-natrium på hornhinden. Rengør hornhinden efter 30 sek og undersøger det under et mikroskop med en kobolt blå filter for at verificere fuldstændig fjernelse af epitelet.
BEMÆRK: Corneal områder med epiteldefekter visualiseres i grønt.
4. Post-operation Care
- Sæt dyret på en varmetæppe og holde det på et sikkert sted (fx i sit bur), mens under genopretning. Må ikke holde en bevidstløs dyr i selskab med bevidste dem.
- Påfør 1% erythromycin oftalmisk salve. Dette vil også forhindre øjet tørhed. Fortsæt ansøgningen antibiotika dagligt i en uge.
- Injicer 0,1 mg / kg buprenorphin subkutant efter indgrebet og igen efter 12 timer. Fortsæt injektionen to gange dagligt i to dage.
- Overhold dyret i 30 - 45 minutter, indtil fuldstændig helbredelse fra anæstesi.
NOTE: Mild bevægelse af respiratoriske muskler på den ventrale overflade indikerer dyr wellness mens under genopretning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inden for en måned efter at have udført denne teknik, 100% af hornhinderne udviklede overfladisk neovaskularisering (figur 1A. Billeder blev taget med et kamera forbundet til en spaltelampe under et lyst felt og kobolt blåt filter). I 18/20 (90%) af øjnene, neovaskularisering involverede hele hornhindens overflade (figur 1A). I 2/20 (10%) blev neovaskularisering observeret i tre ud af fire hornhinde kvadranter, men det stadig nået hornhindens centrum.
For at validere udviklingen af LSCD blev hele mount immunfarvning udført en. Dette trin er ikke en del af protokollen og kan ændres afhængig af mål og interesser. Tre variationer ansås som indikatorer for LSCD: fravær af cytokeratin (CK) 12, en mellemliggende filament specifik for normale hornhindeepitelceller 17, 18; udseende Ck8, en simpel epitel markør
Normale, uskadte hornhinder express CK12-en specifik markør af modne hornhindeepitelceller 17, 18 -throughout hornhindens overflade, men de mangler fornødent Ck8 eller bæger celler (MUC5AC) på hornhinde del af hele mount prøver (figur 1B) . I sammenligning med normale øjne, CK12 ekspression er næsten fraværende på injur y model hornhinder, mens de viser signifikant positiv farvning for Ck8 og bæger celler (figur 1B). Disse observationer indikerer udviklingen af LSCD.
Hvis du er interesseret i at kvantificere Immunofarvningen resultater ved at bruge Image-J til separat kvantificere 20 immunfarvning tætheder på de oprindelige, uændrede billeder taget af mikroskop under de samme indstillinger. Kort fortalt skal du vælge hornhindens del af hele mount prøve, måle integrerede tæthed og areal for denne region, og beregne den korrigerede tæthed til baggrunden 20. Forholdet mellem CK12 til Ck8 tætheder blev tidligere præsenteret på et større antal prøver 1. Den reducerede forhold i sammenligning med kontroller (normale hornhinder) og fremkomsten af slimceller på hornhindens overflade påvise udviklingen af LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Figur 1: Hornhinde Fænotype Efter Oprettelse LSCD i mus. Spaltelampe undersøgelse viser, at alle hornhinder udvikle en vis grad af neovaskularisering med en måned (A, Scale bar: 0,5 mm). En normal hornhinde udtrykker CK12 over hornhinden, men er blottet for enhver Ck8 eller bæger celler (MUC5AC). CK12 er fraværende i LSCD modellen, mens Ck8 og slimceller vises på hornhinden (B, Scale bar: 200 pm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en reproducerbar og forholdsvis simpel teknik til at skabe en musemodel for LSCD. Der er flere vigtige aspekter af denne model, der er værd at bemærke. Først, i modsætning modeller, der bruger kemikalier 11, 12, skaden involverer primært overfladen epitel (og basalmembran), med minimal skade på det underliggende corneale stroma eller andre intraokulære strukturer. Således er der kun begrænset betændelse og ardannelse, som begge kan komplicere proceduren og gøre det vanskeligere at vurdere resultatet af eventuelle indgreb rettet mod limbale stamceller. En interessant nyere undersøgelse af Li et al. 10, som sammenligner brugen af roterende grat med forskellige kombinationer af kirurgiske og kemiske behandlinger, fandt også burr at være sikrere og mere effektive til at skabe LSCD i kaniner. For det andet, den model synes at være stabil i mindst op til tre måneder 1. Skabe denne model involverer anvendelsen afden roterende Burr, et instrument, der er velkendt for klinikere, der arbejder med hornhinden, samt til dem, der gør musen sårende studier. Dens fordel i forhold bruge en stump spatel er, at skaden er mere ensartet og reproducerbar 1.
For bedre at ødelægge limbale stamceller, blev limbale område behandles to gange. Baseret på erfaring med at arbejde på musen øjne, behandling af mere end to runder ofte abrades limbale blodkar og forårsager blødning. I tilfælde af teknik bruges i andre dyr, kan dette trin modificeres afhængig af hornhindens epitel tykkelse. I denne undersøgelse blev en motoriseret værktøj med en 0,5-mm grat spids udnyttes; burr tip i andre former og størrelser er også tilgængelige og kan anvendes i stedet afhængig af hornhinde specifikationer og på øjet størrelse. Li et al. 10 rapporterede 2,5-mm grat at være egnet til konsekvent fjerne kanin cornea og limbal epithel.
For at opnå den optimaleDerfor limbale og corneale epithel blev barberet på en cirkulær måde og den laterale side af burr blev anvendt. At forhindre dyrehår i at forstyrre værktøjsspidsen blev povidon-iod dråbe spredes på håret omkring øjet, i stedet for at blive tørret af. Værktøjet bør ikke anvendes statisk på ét sted, da det kan forårsage perforering. Behandling limbus i et meget langsomt tempo kan resultere i blødning; en hastighed på næsten 6 sek per runde er egnet til en C57BL / 6J mus øje. Det er afgørende for at undgå re-børste den nøgne stroma, da dette vil fremkalde mere inflammation og stroma røntgentæthed. Trykket bør ikke anvendes på øjet, mens slibning epitelet. Efter proceduren blev hornhinden farvet med fluorescein farvestof for at sikre fuldstændig epitelial fjernelse. Det er vigtigt at forhindre øjet tørhed under animalsk recovery. Begrænsninger er, at denne teknik ikke kan fjerne 100% af stamcellerne. Det er også noget operatørafhængigt og kræver øvelse at give consistent resultater.
Når man studerer hornhindens epitel fænotype, hel mount farvning er den bedste måde at vurdere resultaterne af denne model. Dette er fordi det tillader hele hornhindens epitel, der skal evalueres på en gang, hvorimod tværsnit kun ville give oplysninger om hver bestemt afsnit.
Denne styrbar teknik kan inducere LSCD i mus, og sandsynligvis i andre dyr også. Det giver en passende model for LSCD at studere nye behandlinger og at opdage bredere aspekter af sygdommen patofysiologi. Med nogle ændringer, kan det være nyttigt i at studere corneal sårheling, angiogenese, og lymfangiogenese samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ruth Zelkha, MS, for hendes generøse bistand i billeddannelse. Denne forskning blev støttet af Clinical Scientist Development Program Award K12EY021475 til ME, give R01 EY024349-01A1 til ARD, core tilskud EY01792 fra National Eye Institute, NIH, og en ubegrænset bevilling fra Research for at forebygge blindhed. ARD er modtageren af en Career Development Award fra Research for at forebygge blindhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
