Summary
aşağıdaki makale etkin bir limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) sürdürülebilir bir fare modeli oluşturmak için kolay, tekrarlanabilir teknik sağlar. Bu hayvan modeli test ve limbal kök hücre hastalıkları için tedavi etkinliğini karşılaştıran yararlıdır.
Abstract
Limbal kök hücre eksikliği (LSCD) arıza veya kornea epitel konjonktiva ile değiştirilir sonra limbal epitel kök hücrelerin, kaybı durumudur. Hastalar tekrarlayan kornea defektleri, ağrı, enflamasyon ve görme kaybı muzdarip.
Daha önce, LSCD bir fare modeli tarif ve diğer iki model ile karşılaştırılmıştır. amaç hem taklit insanlarda fenotip ve hastalık patofizyolojisini incelemek için ve yeni tedaviler değerlendirmek mümkün kılmak için yeterince uzun sürer LSCD tutarlı bir fare modeli üretmek oldu. Burada, tekniğin daha ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.
Dönen bir çapak ile bir motorlu araç kornea yüzeyinden pas halkaları çıkarmak için ya da hastaların pterjium yatak düzeltmek için tasarlanmıştır. İstenen LSCD model oluşturmak için uygun bir cihazdır. Sanki, küçük gözleri üzerinde çalışmak için uygun kılan bir ince ucu ile bir hazır, kolay kullanımlı bir araçtırFarelerde. Bu uygulama, göze gereksiz travma önler ve genellikle kimyasal yaralanma modellerinde olduğu gibi, istenmeyen yaralanmalara neden olmaz. künt kazıyıcı aksine, bu bazal membran ile epitel kaldırır. Bu protokolde, limbal alan iki kez aşınmış ve daha sonra bütün kornea epitel limbustan limbusa tıraş edildi. Stroma yaralanmasını önlemek için, bakım epiteli zaten kaldırıldı kez kornea yüzeyi fırça değil alındı.
Introduction
kornea epitel kornea netlik ve bütünlüğünü korumak için gereklidir. Sürekli kornea ve konjonktiva kavşağında Limbustan-dar bir bölgede yaşayan epitel kök hücreleri tarafından yaşamı boyunca yenilenir. Bunlar kendini sürekli yenileyen limbal kök hücreler hem normal ve yaralanma sonrası, kornea epitel rejenere önemli bir rol oynamaktadır. Bu kök hücrelerin kısmen ya da tamamen tükenmesi tekrarlayan kornea erozyonlar, ağrı, kornea yara ve neovaskülarizasyon, goblet hücre görünümü neden olacak ve tedavi edilmezse, korneal körlük bırakılırsa. Bu durum limbal kök hücre eksikliği (LSCD) olarak da bilinir ve idiyopatik olabilir; kalıtsal; veya bağlı kimyasal veya termal yaralanmalar, uzun süreli kontak lens takmak ve kronik inflamasyon 1-6 kazandı.
LSCD üzerine yapılan araştırmalar, uygun bir hayvan modeli gerektirir, sadece taklit insanlarda hastalık, ancak en az olan, tekrarlanabilir ve sürdürülebilirdiğer kornea ve oküler yapıların yaralanma montaj. Bu model tedavileri değerlendirmek ve moleküler ve hücresel düzeyde hastalık mekanizmalarını açıklamak gereklidir. Dönen bir çapak kullanımı ile, 1 Daha önce anlatıldığı gibi, kolayca bahsedilen avantajlara sahiptir ve en az üç ay boyunca devam LSCD bir fare modeli geliştirebilir. Bu çalışmanın amacı LSCD basit, tekrarlanabilir ve sürdürülebilir fare modeli sunmaktır.
Dönen çapak eşit altta yatan stroma 1 zarar vermeden epitel kaldıran bir araçtır. Yara iyileştirici çalışmalarda kornea erozyon 7, 8 uyarılması için kullanılmıştır. Bir fare LSCD oluşturmak için vesile-sunulan teknik daha önce rapor edilmemiştir. Daha önce daha fazla restorasyon o ile, daha az homojen yaralanma-özellikle limbus-ve daha değişken bir fenotip 1, 9 bir künt spatula sonucu epitel kazıma yöntemleri tanıttıf Normal kornea epitel 1. Kör kazıyıcı farklı olarak, döner çapak oyuk 7, 8, 10 gibi epitelyal bazal membran kaldırır. kök hücreleri ayırmak için bildirilen diğer metotlar, altta yatan göz yapılarına istenmeyen yaralanmalara neden olabilir, aynı zamanda önemli enflamasyon ve daha sonra kornea opasitesi ya yol açabilir, sadece sodyum hidroksit, n-heptanol, ve benzalkonyum klorür gibi kimyasal kullanılmasını içerir epitel skuamöz metaplazi 11-15. Dönen çapak bu ciddi komplikasyonlar ile ilişkili değildir. Cerrahi, tek başına ya da kimyasal maddelerin 10, 11, 16 kullanımı ile, limbal epitel kaldırma gerçekleştirmek için daha zordur ve küçük gözler ve (fare gibi) ince limbal epitel hayvanlarda en iyi seçenek değildir. Buna ek olarak, şaşırtıcı, limbectomy hala 10 gerisinde limbal epitel bazı bırakabilir.
Aşağıda tarif edilen teknik, neovaskülarizasyon AN LSCD neden olurhastada tam LSCD sunumunu taklit ve en az üç ay 1 sürer D konjonktiva. Bu farelerde LSCD veya yara iyileşmesi patofizyolojisi, immünoloji ve potansiyel tedavi çalışma amacı olanlar için uygundur. Muhtemelen, bazı değişikliklerle, bu prosedür sıçan ya da tavşan 10 gerçekleştirilebilir. Dönen çapak verimli epitel kaldırır gibi, korneal epitel aşınma / yaralama ve herhangi bir ilgili tedavi ya da moleküler biyoloji çalışmalarında ilgili herhangi bir araştırma kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler vizyon araştırma hayvan kullanım için Vizyon ve Oftalmoloji tablolarında Araştırma Derneği ile uyumludur. Altı aylık erkek / kadın C57BL / 6J vahşi tip farelere Ondört dört kullanıldı: on yaralanma modeli için fareler ve kontrol hayvanlarına olarak dört (yaralı olmayan korneası).
1. Hayvan hazırlanması
- Bir 100 mg / kg ketamin intraperitonal enjeksiyon ve 5 mg / kg ksilazin karışımı ile bir fare anestezisi. Anestezi etkisi almıştır sonra, anestezi derinliği onaylamak için ayak tutam; Hayvan tepkimeye girmemelidir.
- herhangi bir önceki kornea hasarı yokluğunu doğrulamak için deneylerini önce bir yarık lamba altında göz kontrol edin.
- gözün üzerine% 1 tetracaine hidroklorür bir damla aşılamak. 60 Sonra - 90 saniye, duyu yokluğunu doğrulamak için kornea refleksi test edin. Proparakain hidroklorür% 0.5 yerine kullanılabilir.
- Ne zaman kornea duyu kaybıBelirli nazikçe göz ve göz çevresinde saç% 5 povidon-iyot bir damla yerleştirin. 1 dakika sonra damla silin ya da araç ipucu müdahale saç önlemek için göz çevresinde saç üzerine yayılır.
2. Kornea epiteli zımpara
- cerrahi eldivenleri ve bir önlük giyin. Steril dönen çapak ve steril bir cımbız: gerekli araçları hazırlayın. Daha iyi kontrol için, bükülmüş cımbız kullanın. İşlem sırasında steril bir kağıda araçları yerleştirin.
- bükülmüş cımbız kullanarak, burun tarafında kapaklarını kapma ve yavaşça göz proptosing ile göz stabilize. Çok fazla baskı kullanmaktan kaçının.
- Cerrahi mikroskop altında, iki kez steril dönen çapak kullanarak limbal alanı çevresinde 360 ° tıraş. Tur başına 6 sn - 5 hızında limbusta etrafında gidin.
NOT: çapak bir sabit hıza sahip. Ancak, kurulan hızda döndürmek için, "son fındık" tamamen sıkılmalıdır. - Dönen çapak ile limbusa limbustan bütün kornea epiteli çıkarın. Daha iyi sonuçlar için, dairesel bir şekilde aracı hareket ettirmek ve kornea yüzeyinin biraz paralel olarak ucunun yan tarafına çalışmak tutun. re-fırçalama tarafından değil epiteli zaten kaldırılmış alanları stroma kesmemeye dikkat edin. göz üzerinde herhangi bir baskı uygulamayın. gerektiği gibi fırça ucu temizleyin.
- korneada steril fosfat tamponlu bir damla serum fizyolojik aşılamak ve yumuşak bir temizlik dokusu ile herhangi bir müstakil epitel sayfaları silin.
- varsa kalan epitel tıraş.
- Ameliyat sırasında fare kuyruğu dikkat edin.
NOT: herhangi bir hareket oluşursa, anestezi derinliği soluk ve daha fazla enjeksiyon gereklidir. Birincil enjekte hacminin üçte ikisine üçte biri yeterli olmalıdır. anestetik ilaç ile hayvan aşırı doz etmeyin. - Başka bir göz bunları kullanmadan önce tüm araçları sterilize edin.
3. Onayla Komple epitel Kaldırma
- kornea olarak 1 mg / ml floresein sodyum bir damla uygulanır. 30 saniye sonra kornea temizleyin ve epitel tümüyle kaldırılmasını doğrulamak için bir kobalt mavisi filtreli bir mikroskop altında incelemek.
NOT: epitel defekti ile Kornea alanlar yeşil görünür hale gelir.
4. Post-işlem Bakımı
- Bir ısıtma battaniye hayvan koyun ve kurtarma altında iken (kendi kafeste, örneğin) güvenli bir yerde saklayın. bilinçli olanların şirket bilinçsiz bir hayvan tutmayın.
- % 1 eritromisin oftalmik merhem sürün. Bu aynı zamanda göz kuruluğu engelleyecektir. Uygulamayı bir hafta boyunca antibiyotik gazetesine devam edin.
- kg buprenorfin subkutan işlemden sonra tekrar 12 saat sonra / 0.1 mg enjekte edilir. İki gün süre ile günde iki defa enjeksiyon devam edin.
- anesteziden tam iyileşme kadar, 45 dakika - 30 hayvan gözlemleyin.
NOT: Ventral yüzeyinde solunum kaslarının hafif hareket kurtarma altında iken hayvan welness gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniği gerçekleştirdikten sonra bir ay içinde, kornealar% 100 yüzeyel neovaskülarizasyon gelişti (Şekil 1A. Fotoğraflar parlak alan ve kobalt mavisi filtrenin altına bir yarık lamba bağlı bir kamera ile çekildi). Gözün 18/20 (% 90) 'de, yeni damar oluşumu, kornea bütün yüzeyi (Şekil 1A) içeriyordu. 2/20 (% 10), neovaskülarizasyon üç dört kornea kadranlarda gözlendi, ama yine de kornea merkezine ulaştı.
LSCD gelişimini doğrulamak için, tüm montaj immün 1 gerçekleştirildi. Bu adım protokolünün bir parçası değildir ve hedefleri ve çıkarları bağlı değiştirilebilir. Üç varyasyon LSCD göstergesi olarak kabul edildi: sitokeratin (CK) yokluğu 12 normal kornea epitel hücreleri 17, 18 özel bir ara filament; CK8 görünümü, basit bir epitel işaretleyici
Bu, tüm montaj örnekleri kornea parçası hücreleri (MUC5AC) bir CK8 yoksun ya da goblet ekspres CK12-olgun bir kornea epitel hücreleri, 17, kornea yüzeyinin -throughout 18 özel markör ancak normal, yaralanmamış korneanın (Şekil 1B) . Normal gözlere kıyasla, CK12 sentezleme olduğa neredeyse yoktur y modeli kornealar, önemli ölçüde CK8 için pozitif boyanma gösterir ve (Şekil 1B) goblet hücreleri ise. Bu gözlemler, LSCD gelişimini gösterir.
Immün sonuçları miktarının ilgilenen varsa, Resim-J ayrı ayrı aynı ayarları altında mikroskop tarafından çekilen orijinal, değiştirilmemiş görüntülerde 20 immün yoğunlukları ölçmek için kullanın. Kısaca, bütün montaj numune kornea bölümünü seçmek o bölge için entegre yoğunluğu ve alan ölçmek ve arka plan 20 düzeltilmiş yoğunluğunu hesaplamak. CK8 yoğunluklarına CK12 oranı, daha önce örnek 1 daha büyük bir sayıda sunulmuştur. kontrollere kıyasla daha düşük bir orana (normal kornea) ve korneal yüzeyi üzerinde goblet hücrelerinin görünümü LSCD gelişimini göstermektedir.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Şekil 1: Farelerde LSCD oluşturma sonra Kornea Fenotip. Yarık lamba muayenesi tüm kornealar bir ay (: 0.5 mm A, Ölçek çubuğu) ile neovaskülarizasyon bir dereceye geliştirmek olduğunu göstermektedir. Normal bir kornea her korneaya CK12 ekspresyonunu gerçekleştirir ve ancak herhangi bir CK8 ya da goblet hücreleri (MUC5AC) yoksundur. CK8 ve goblet hücreleri kornea (: 200 mikron B, Ölçek çubuğunda) görünür iken CK12, LSCD modelinde yoktur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, LSCD olan bir fare modeli oluşturmak için yeniden üretilebilir ve nispeten basit bir teknik açıklanmaktadır. fazlalaştı olan bu modelin bazı önemli yönleri vardır. İlk olarak, kimyasal madde 11, 12 kullanımı farklı modeller, yaralanma esas olarak altta yatan kornea stroma veya başka göz içi yapıların en az zararla yüzey epiteli (ve bazal zar) içerir. Böylece, prosedürü komplike ve daha zor limbal kök hücrelerin yönelik herhangi bir müdahalelerin sonucunu değerlendirmek için yapabileceğiniz her ikisi de sadece sınırlı inflamasyon ve yara izi vardır. Li ve arkadaşları tarafından ilginç bir yeni bir çalışma. Cerrahi ve kimyasal tedavilerin farklı kombinasyonları ile döner çapak kullanımını karşılaştırır 10, aynı zamanda daha güvenli ve tavşanlarda LSCD oluşturmada daha etkili olduğu bulundu çapak. İkinci olarak, model, en azından üç aya kadar 1 stabil gibi görünüyor. Bu modeli oluştururken kullanımını gerektirirDönen çapak, fare yaralama çalışmaları yapanlara yanı sıra, kornea ile çalışmak klinisyenler tanıdık bir enstrüman. Kör bir spatula kullanılarak göre yararı, yaralanma fazla tek tip ve yeniden üretilebilir 1 olmasıdır.
daha limbal kök hücrelerini yok etmek için, limbal alan iki kez tedavi edildi. fare gözlerine çalışan deneyimlerine dayanarak, ikiden fazla mermi tedavi genellikle limbal kan damarlarını aşındıran ve kanamaya neden olmaktadır. durumunda teknik diğer hayvanlarda, bu adım, kornea epitel kalınlığına bağlı olarak değiştirilebilir. Bu çalışmada, bir 0.5 mm çapak ucuyla motorlu bir araç kullanılmıştır; Diğer şekillerde ve boyutlarda çapak ipuçları da mevcuttur ve kornea özelliklerine ve göz boyutuna bağlı olarak, bunun yerine kullanılabilir. Li ve diğ. 10 sürekli tavşan kornea ve limbal epitel kaldırmak için uygun olduğu 2.5 mm çapak bildirdi.
Optimal edinmek içinSonuç, limbal ve kornea epitel dairesel bir şekilde tıraş edilmiş ve çapak yan tarafı kullanıldı. araç ipucu müdahale hayvan saç önlemek için, povidon-iyot damla yerine sildi olma, göz çevresinde saçta yayıldı. Bu perforasyona neden olabilir aracı, tek bir noktada statik ameliyat edilmemelidir. kanama neden olabilir, çok yavaş bir hızda limbus tedavisi; tur başına yaklaşık 6 saniyelik bir hızda, bir C57BL / 6J fare göz için uygundur. Bu daha çok inflamasyon ve stroma donuklaşmalarını neden olacaktır gibi, yeniden-fırçalama çıplak stroma önlemek için kritik öneme sahiptir. epitel aşındırma sırasında basınç göze uygulanmamalıdır. İşlem sonrası kornea epitel tam kaldırma emin olmak için fluoresein boyası ile boyandı. Hayvan kurtarma sırasında göz kuruluğu önlemek için önemlidir. Sınırlamalar bu tekniğin kök hücrelerin% 100 silemezsiniz vardır. Aynı zamanda biraz operatöre bağlıdır ve co vermek için pratik gerektirirnsistent sonuçlanır.
kornea epitel fenotip öğrenim görürken, tüm montaj boyama bu modelin sonuçlarını değerlendirmek için en iyi yoldur. o kesitler sadece her bir bölüm hakkında bilgi verecek, oysa bütün kornea epitel, bir kerede değerlendirilecek veriyor olmasıdır.
Bu kontrol tekniği yanı sıra diğer hayvanların muhtemelen farelerde LSCD neden ve olabilir. Bu LSCD uygun bir modeli yeni tedaviler incelemek ve hastalık patofizyolojisi daha geniş yönlerini keşfetmeye sağlar. Bazı değişiklikler ile, hem de kornea yara iyileşmesi, anjiogenezisi ve lenfanjiyogenezin okuyan yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar görüntülemede ona cömert yardım için, Ruth Zelkha, MS teşekkür ederim. Bu araştırma ME Klinik Scientist Kalkınma Programı Ödülü K12EY021475 tarafından desteklenen, ARD, Ulusal Göz Enstitüsü, NIH ve Körlük Önlemek için Araştırma sınırsız bağışı çekirdek hibe EY01792 için R01 EY024349-01A1 verin. ARD Araştırma engelle Körlük bir Kariyer Geliştirme Ödülü almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
