Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Abstract

Auto-immuunziekten worden veroorzaakt door het verlies van immunologische zelftolerantie. Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn belangrijke mediatoren van immunologische zelf-tolerantie. Tregs voor ongeveer 5-10% van de volwassen CD4 + T-cel subpopulaties in muis en mens, met ongeveer 1-2% van de Tregs circuleren in het perifere bloed. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gedifferentieerd in functionele Tregs, die een potentieel om te worden gebruikt voor celtherapie van auto-immuunziekten. Hier presenteren we een methode voor antigeen (Ag) -specifieke Tregs van iPSCs (dwz iPSC-Tregs) ontwikkelen. De werkwijze is gebaseerd op het opnemen van de transcriptiefactor Foxp3 en een Ag-specifieke T-celreceptor (TCR) in iPSCs en vervolgens differentiëren naar OP9 stromale cellen die Notch liganden delta-achtige (DL) en 1 DL4. Naar aanleiding van in vitro differentiatie, de iPSC-Tregs uiten CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 en Ag-specifieke TCR en zijn in staat om te reageren op Ag stimulatie.Deze werkwijze is met succes toegepast op cellen gebaseerde behandeling van autoimmune artritis in een muizenmodel. Adoptieve overdracht van deze Ag-specifieke iPSC-Tregs in Ag-geïnduceerde artritis (AIA) dragende muizen heeft het vermogen om gewrichtsontsteking te verminderen en zwelling en botverlies voorkomen.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care Committee (IACUC protocol # 45470) en worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Incubeer een 10 cm schaal met 10 ml 0,1% gelatine gedurende tenminste 30 minuten bij 37 ° C (incubator) teneinde het bekleden van de plaat.
  2. Gelatine verwijderen uit het schaaltje en de plaat 3 x 10 6 bestraalde SNL76 / 7 cellen en incubeer gedurende één dag bij 37 ° C (incubator) middels 10% DMEM medium (10% FBS en 1% penicilline streptomycine).
  3. Verwijder het medium uit de plaat en cultuur ontdooid iPSCs via SNL76 / 7 cell voedingslaag behulp iPSC media (DMEM medium dat 15% foetaal kalfsserum, 0,1 mmol / l niet-essentiële aminozuren, 1 mmol / L L-glutamine, en 0,1 mmol / l β-mercaptoethanol) 9. De muis iPS-MEF-Ng-20D-17 cell Line, die werd opgewekt uit muis embryonale fibroblasten door retro virale transfectie van Oct3 / 4, Sox2, Klf4, en c-Myc, werd verkregen van Dr. Shinya Yamanaka (Institute for Frontier Medische Wetenschappen, Universiteit van Kyoto, Kyoto, Japan).
  4. Wijzig de media op dag 3 met verse media en observeren iPSC kolonies onder de microscoop.
    LET OP: Deze kolonies zijn klein, glanzend clusters of rond cellen met een duidelijke afbakening zien GFP expressie onder een fluorescentiemicroscoop.

2. In vitro differentiatie van Ag-specifieke iPSC-Tregs

  1. Het genereren van retrovirale constructen transductie te gebruiken door sub-kloneren van de OT-II en TCR genen Foxp3 in de MIDR plasmide 10 verbonden met zelf-splitsende peptide 2A de MIDR-TCRα-2A-TcR-2A-FoxP3 construct maken.
  2. Voer retrovirale transductie 9 van iPSCs gebruik Plat E cellen als de verpakking cellijn.
  3. Op dag 0, zaad OP9-DL1-DL4 IA-B-cellen eenta minimale dichtheid van 10 4 cellen / cm2 met OP-9 media (α-MEM medium dat 20% FCS en 2,2 g / l natriumbicarbonaat. Plaat 1 x 10 6 cellen per 10 cm schaal.
  4. Op dag 3, toen OP9-DL1-DL4-IA b cellen 80-90% confluent, verwijder de media en zaden 0,5-1 x 10 5 iPSCs dan OP9-DL1-DL4 - IA B-cellen in OP-9 media.
    LET OP: Dit stelt de co-cultuur van iPSCs op OP9-DL1-DL4-IA B-cellen en wordt beschouwd als dag 0 van de differentiatie 9 zijn.
  5. Op dag 5, verwijder de media uit de 10 cm schotel door aspiratie, was de cellen met 10 ml 1x PBS en zuig het PBS. Voeg 4 ml van 0,25% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voeg nog 8 ml iPSC medium aan de cellen resuspendeer hen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml iPSC media. Incubeer Deze opnieuw gesuspendeerde cellen op een nieuwe 10 cm schaalen terug naar de incubator gedurende 30 minuten.
      LET OP: Verwijder de OP9-DL1-DL4-IA b feeder cellen en houdt de differentiërende iPSCs drijvend in de media. 90% samenvloeiing voor verdere co-cultuur - te behouden OP9-DL1-DL4-IA B-cellen continu tot 80 te bereiken.
    2. Na 30 min, laat het drijvende cellen, filteren door een 70 um cel zeef en tel de cellen met een hemocytometer.
  6. Zaad 5 x 10 5 van iPSCs om een frisse 80 - 90% samenvloeiing van OP9-DL1-DL4-IA B-cellen in OP9 media. Vullen de media mFlt-3L in een eindconcentratie van 5 ng / ml.
  7. Op dag 8, het verzamelen van gedeeltelijk gedifferentieerde iPSCs door het wassen van de plaat met de media uit de schotel zelf met behulp van een 10 ml pipet. Met nog 5 ml OP-9 media in de schaal voorzichtig wassen semi-hechtende cellen door voorzichtig krachtig pipetteren om te voorkomen dat het breken OP9 monolaag op de bodem van de schaal. Herhaal het wassen met 10 ml PBS om alle semi-ad oogstenherent differentiërende cellen.
    1. Combineer wast, centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, resuspendeer in 10 ml OP9 medium dat mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml) en filtreer door een 70 um cel zeef.
  8. Overdracht van de cellen in een 6-well cultuur plaat met 80-90% confluent OP9-DL1-DL4-IA B-cellen, zoals in stap 1.1. Transfer cellen geoogst van een 10 cm schaal in één putje van de 6-well plaat.
  9. Op dag 10, veranderen de helft van de inhoud van cellen in open OP9 media waaraan mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml). Herhaal deze stap om de twee dagen.
  10. Elke 4-6 dagen, afhankelijk van de groei, re-zaad de differentiërende iPSCs op platen met een verse laag OP9-DL1-DL4 IA-B-cellen, zoals beschreven in stap 1.1.

3. Evaluatie van In Vitro Treg differentiatie en rijping

  1. Morfologische veranderingen differentiëren iPSCs.
    1. MoNitor de co-cultuur van iPSC met OP9-DL1-DL4 IA-B-cellen elke dag door het observeren van levende cellen onder een conventionele helderveld microscoop (20X). Per dag 5, observeert de kolonies met mesoderm-achtige kenmerken, zoals afgeplatte cellen. Per dag 8, acht kleine, ronde clusters van cellen, die differentiërende cellen vertegenwoordigen.
    2. Gebruik de trypanblauwexclusie Methode om de cellen te tellen om het aantal en percentage levende cellen te detecteren. Bereken cellevensvatbaarheid het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de vier rasters op de hemocytometer. Als cellen nemen trypan blauw, overwegen ze dood of niet-levensvatbaar. Noteer het aantal levende cellen geoogst uit de kweek.
  2. Flowcytometrieanalyse differentiëren iPSCs.
    1. Op dag 5, 7, 11, 15, 19, 21 en 28 van co-cultuur verwijderen van de cellen met 0,25% trypsine zoals in stap 25.
    2. Voorafgaand aan het oppervlak kleuring met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen incubate 1 x 10 6 cellen met 100 pl Fc blokker 2.4G2 verdund in PBS (eindconcentratie 10 ug / ml) bij 4 ° C gedurende 20 minuten om de binding van antilichaam voorkomen dat de Fc receptor op het celoppervlak.
    3. Op dag 5, 7, 11, 15, 19, 21 en 28, gebruik 1 x 10 6 cellen voor flowcytometrie met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen aan het celoppervlak markers, zoals CD3, TcR, CD4, CD8, CD25 te detecteren, en CTLA4.
    4. Na Fc blok, wassen cellen met 10 ml PBS en vlekken met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen gedurende 20 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de flowcytometrische analyse met de 15-kleuren flowcytometer. Met 0,200 ug antilichaam per 10 6 cellen verdund in 100 pl PBS.
    5. Op dag 28, analyseren de cellen door flowcytometrie 11 en poort op CD4 + CD8 + cellen middels CD4 en CD8 fluorochroom-geconjugeerd kleuring; analyse voor de expressie van TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, En FoxP3 (figuur 1). Voor FoxP3 kleuring, bevestig de cellen en permealize hen en voer vervolgens antilichaam kleuring 11.
  3. In vitro stimulatie van antigeen iPSCs.
    1. Op dag 28 van co-cultuur, oogst iPSC-Tregs uit culturen door het verzamelen van de drijvende cellen. Trypsinize de rest van de cellen met 0,25% trypsine (zoals in stap 2,5) en resuspendeer de cellen in 8 ml iPSC media. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 xg bij kamertemperatuur, zuig de media, en opnieuw resuspendeer de cellen in 10 ml medium.
      1. Incubeer de opnieuw gesuspendeerde cellen op een nieuwe 10 cm schaal bij 37 ° C gedurende 30 minuten en verzamel de drijvende cellen. Was de cellen met koude PBS.
    2. Incubeer 3 x 10 6 splenocyten uit milt van C57BL / 6 RAG1 - / - muizen met 5 uM ovalbumine peptide in 200 ul medium (OVA 323-339) bij 4 ° C gedurende 30 min in een 96 wells plaat 11.
    3. Meng Tregs met OVA 323-339 splenocyten bij een 1: 4 verhouding (gebruik 0,75 x 10 6 Tregs). Incubeer bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 40 uur. In de afgelopen 4 uur, voeg 4 ul van verdund Brefeldine A in de cultuur (feitelijke concentratie 1000x, verdund in 1x cultuur media).
    4. Oogst cellen met 0,25% trypsine (zoals in stap 2,5), was met 10% NaN3 en 0,5 M EDTA-oplossing (FACS-buffer), blok met 100 pl verdund (eindconcentratie 10 gg / ml) Fc blokker 2.4G2, en vlek voor oppervlaktemerkers, CD4, CD8, TCRVα2 en TCRVβ5 zoals in stappen 3.2.3-3.2.4.
    5. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde oplossing in PBS en doorlaatbaar met 100 pl 1x permeabilisatie buffer na celoppervlak kleuring. Opgelet! Paraformaldehyde is allergeen, carcinogeen en toxisch.
    6. Vlekken op de cellen met fluorochroom geconjugeerde TGF-β en IL-10 gedurende 20 minuten in het donker. Gebruik 0,200 ug antilichaam / 10 6 cellen diluted in 100 pl PBS. Detecteren intracellulaire productie van TGF-β en IL-10 met de 15-color flow cytometer (figuur 2).
    7. Was de cellen drie maal met koude FACS-buffer vóór de flowcytometrische analyse 11.
  4. In vivo persistentie van Ag-specifieke iPSC-Tregs.
    1. Na 8 dagen van de co-cultuur op de OP9-DL1-DL4-IA B-cellen, transfer iPSC-afgeleide pre-Tregs (Thy1.2) als in stap 3.3.1 in Uw 1.1 congenic muizen (4-6 weken oud) via een staartader injectie zonder verdoving. Voor het uitvoeren van de staartader injectie, verwijden de staartader onder toepassing van een infraroodlamp gedurende 5 min. Na staartader dilatatie, plaatst u de muis in een restrainer en adoptief-overdracht 3 x 10 6 cellen opnieuw gesuspendeerd in 200 pl PBS door het injecteren via de staartader.
    2. Zes weken na de Treg overdracht, euthanaseren muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. Zorg ervoor dat de mice worden niet ademen. Open de peritoneale holte door het snijden van de buitenhuid van het peritoneum met een schaar en forceps en zachtjes trekken naar de binnenlaag langs de buikholte bloot. Isoleer de milt en perifere lymfeknopen geïnjecteerd Thy 1,1 congene muizen.
    3. Verzamel de cellen van de milt en lymfeknopen mechanisch breken van een enkele celsuspensie werd verkregen. Incubeer de cellen met 5 ml ACK lysisbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren. Verzamelen en wassen resterende splenocyten of lymfocyten met 10 ml koude FACS-buffer.
    4. Na het wassen, behandelen cellen met Fc blokker 2.4G2 bij 4 ° C gedurende 20 min volgens stap 3.2.2 en vlek met 100 gl verdunde fluorochroom-geconjugeerd anti-Thy 1,2 antilichamen.
    5. Was de cellen met 10 ml FACS buffer en ga verder met cytometrische analyse 11 stromen.

4. In vivo rijping en onderdrukking van auto-immune artritis

  • Genereren van de constructen volgens stap 2,1.
  • Voer retrovirale transductie 9 zoals in stap 2.2.
  • In vivo differentiatie en inductie van artritis bij muizen.
    1. Differentiëren OT-II TCR /-FoxP3 getransduceerde iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs)-FoxP3 getransduceerde iPSCs en DsRed getransduceerd iPSCs de OP9-DL1-DL4-IA b stromale cellen in de aanwezigheid van cytokinen mFlt-3L en mIL-7 voor 8 dagen overeenkomstig stappen 2,1-2,6.
    2. Trypisinize alle drie soorten cellen van de 10 cm plaat en hersuspenderen cellen van elke plaat van 10 cm in 10 ml vers medium. Voeg de cellen een nieuwe 10 cm plaat en opnieuw incubator gedurende 30 minuten. Na 30 min, verzamel drijvende cellen.
    3. Passeren cellen door een 70 um cel zeef naar cel clusters te verwijderen en te tellen met behulp van een hemocytometer. Stel de cellen tot een concentratie van 1,5 x 10 7 cellen / ml in koude PBS en opnieuw filtreren als nodig. Houd cellen op ijs tot adoptieve cel overdracht in muizen. Injecteer 200 ui van de celsuspensie (3 x 10 6 cellen) in drie verschillende groepen van 4-6 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen door de staartader zoals beschreven in 3.4.1
    4. Op dag 10 na de celoverdracht, injecteren muizen met 100 ug MBSA geëmulgeerd in volledig Freund adjuvans bij de basis van de staart met behulp van een 1 ml spuit.
    5. Op dag 17, verdoven muizen met een isofluraan vaporizer (volgens richtlijnen IACUC). Maak gebruik van 4-5% isofluraan voor de inductie en 1-2% voor onderhoud. Induceren arthritis door intra-articulaire injectie van 20 gg MBSA in 10 ul PBS in de linker kniegewricht en 20 ug en 100 ug MBSA hele OVA in 10 ul PBS in de rechter kniegewricht. Eten en een gelpack kan op de aanwezige vloer worden geplaatst nadat artritis heeft ontwikkeld. Muizen zullen worden gedood: Body Condition Score (BCS) van 2/5 of stervende, ernstige cachexia en / of aanhoudende decubitus (een periode van 24 uur), en ernst score 4. score4, erythema en ernstige zwelling omvatten de enkel, voet en cijfers, of ankyloses van de ledemaat.
  • Karakterisering van de OT-II TCR /-FoxP3 getransduceerde iPSCs.
    1. Gebruik een fluorescentiemicroscoop (20X) aan gefixeerde live-DsRed + GFP + cellen te visualiseren.
    2. Onderzoek gen-integratie en expressie door zowel Western blot en flowcytometrie 11.
  • Treg ontwikkeling en rijping.
    1. In week 2, 4 en 6 na de celoverdracht, euthanaseren de muizen. Om euthanasie, in elke kooi gebruiken 1-2 L van CO 2 in de eerste fase. Zodra het dier het bewustzijn heeft verloren, verhoging van de stroomsnelheid van CO2 4 - 5 l / min. Euthanaseren muizen door CO 2 inhalatie. Isoleer de milt en tap de lymfeknopen door het snijden van de buitenhuid van het peritoneum met een schaar en forceps en zachtjes trekken naar de binnenlaag langs de buikholte bloot.
    2. Verzamel de enkele celsuspensie from de milt en lymfeknopen door een mechanisch defect met behulp van een cel zeef en een 1 ml spuit in 1% iPSC media. Centrifugeer de conische buis met het medium bij 400 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de celpellet in 5 ml ACK lysisbuffer om rode bloedcellen te lyseren. Re-centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer de cel pellet en was de resterende splenocyten of lymfocyten met koud FACS buffer. Volg de stappen 3.4.4 - 3.4.5 en ga verder met cytometrische analyse stromen.
  • Intracellulaire kleuring.
    1. Op dag 50 na de uitdaging, isoleer de milt en afvoer van de lymfeknopen van de muizen (als in stap 4.5.1) na euthanization door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Verzamel de enkele celsuspensie van de milt en lymfeknopen door mechanische analyse met behulp van een cel zeef en een 1 ml injectiespuit. Incubeer de splenocyten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 5 ml ACK lysisbuffer om rode bloedcellen te lyseren. Verzamel en was de resterende splenocytes of lymfocyten met koud FACS buffer. Volg de stappen 3.2.3 - 3.2.4, maar vlek met oppervlak merkers CD4, CD8, CD25 en TCRVβ5.
    3. Overgaan tot cellen vast voor intracellulaire kleuring zoals beschreven in 3.3.5 - 3.3.7 en analyseren intracellulaire cytokine productie (TGF-β en IL-10) van iPSC-afgeleide Tregs en poort voor levende CD4 + CD25 + cellen.
  • Infiltratie van Ag-specifieke Tregs in de knieën en onderdrukking van artritis.
    1. Volgende stappen (4.3 - 4.3.6) op dag 7-14 na de inductie van artritis, euthanaseren muizen door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie (volgens IACUC richtlijnen). Verwijder haar van de knieën met een elektrische tondeuse en accijnzen de knieën door de chirurgische ingreep.
    2. Verwijder het vel van de benen door een incisie in de achterpoot met stompe uiteinden schaar en snijd de huid in de dij en naar de enkel. Haal voorzichtig de huid over het been en voet naar de spier bloot te leggen. Verwijderende spieren van het been voorzichtig zonder beschadiging het kniegewricht.
      1. Snijd het achterbeen net boven het bekken / heupgewricht en snijd de tibia met behulp van scherpe ontleden schaar.
    3. Bevestig de knieën in 4% formaline voor 48 uur. Ontkalken knieën met 2,5 M mierezuur; driemaal spoelen in xyleen gedurende 3 minuten, spoel tweemaal in 100% ethanol, tweemaal spoelen in 95% ethanol, tweemaal spoelen met gedemineraliseerd water gedurende 2 min, en ontkalkt in 1 mM EDTA. Behandel een sub-kookpunt (90 ° C) gedurende 20 min.
    4. Koel het vaste weefsel voor 30 min. Spoel het met 1x PBS gedurende 4 min en insluiten in paraffine. Dehydrateer de weefsels door een reeks ethanol baden het water verplaatsen en vervolgens te infiltreren met was. Dan insluiten het geïnfiltreerde weefsels in wax blokken. Voeren zowel verticale als horizontale snijden voor kleuring. Bereid 4 micrometer secties met een sledemicrotoom.
    5. Voer immunofluorescentiekleuring op de onderdelen na standaardprocedures van deparaffinisatie en rehydratie met xyleen en ethanol 12.
    6. Endogene peroxidase activiteit te blokkeren door onderdompeling van de schuif in een voldoende hoeveelheid van 3% waterstofperoxideoplossing 3 minuten na Ag ophalen. Blok dia voor niet-specifieke binding in 3% BSA in PBS bij kamertemperatuur in een vochtige kamer gedurende 60 minuten.
    7. Vlek secties met 200 pi fluorochroom-geconjugeerd TCRVβ5 antilichaam verdund 1: 100 in blokkeeroplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een 75-100% bevochtigde kamer, en was 5 keer in 1x PBS gedurende 5 minuten.
    8. Tegenkleuring dia nucleaire kleuring met DAPI reagens dat antifade. Voeg ongeveer 300 ul van de verdunde DAPI kleuroplossing (300 nM in 1 x PBS) aan de dekglaasje door te controleren gehele dekglaasje bedekt. Bewaar de objectglaasjes in het donker bij 4 ° C tot analyse onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 3).
  • Artritis onderdrukking assay
    1. Meet de zwelling van de knieën van muizen vóór inductie van artritis door een dial gauge remklauw op een uitgangswaarde.
    2. Volg de stappen (4.3 - 4.3.6) voor artritis inductie en Treg-overdracht. Meet muis knieën met een dial-gauge remklauw post-Treg overdracht.
    3. Bereken de procentuele stijging in de knie diameter: procent stijging = (Knee diameter op dag 1 - Knee diameter op dag 0) / Knie diameter op dag 0.
  • Meting van gewrichtsvernietiging en infiltratie van ontstekingscellen in de knieën door histologie (figuur 4).
    1. Op dag 7 na de inductie van artritis, euthanaseren de muizen zoals eerder beschreven en Accijnzen de knieën door de chirurgische ingreep. Zie stap 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Bevestig de knieën in 4% formaline, ontkalken in EDTA en insluiten in paraffine. Zie stap 4.7.3
    3. Verwijder beide knieën, vast te stellen in 10% formaline en verkalken in Formical-4. Insluiten de weefsels in paraffine, paragraaf 4 urn en vlek met hematoxylin en eosine (H & E) kleuring of safranine O (volgens stap 4.7.7) en waarnemen onder een microscoop.
    4. Met H & E kleuring boterosie evalueren met een semi-kwantitatieve scoringssysteem (0: geen erosie; 4: uitgebreide erosies en botafbraak). Gebruik Safranine O kleuring om het verlies van proteoglycanen evalueren en te scoren met een semi-kwantitatieve scoringssysteem (0: geen verlies van proteoglycanen; 3: volledig verlies van kleuring voor proteoglycanen).
      1. Gebruik een semi-kwantitatieve scoringssysteem om te scoren infiltratie van ontstekingscellen op H & E gekleurde dia's (0: geen cel infiltratie; 4: overvloedig cel infiltratie). Evalueer scores door het onderzoeken van beide knieën in een geblindeerde wijze.

    • 5. Meting van botverlies in de knieën met de hoge-resolutie Micro-computertomografie (micro-CT) System

    1. Op dag 10 na de inductie van artritis, verdoven muizen met 2% isofluraan en voor te bereiden voor de beeldvorming.
    2. positie mice met de knieën naar boven in de kamer.
    3. Met een hoge-resolutie micro-CT-systeem te verwerven in vivo beeldvorming van het bot architectuur rond de knieën van de muizen.
    4. Voer micro-CT scans met een lengte van 2,2 mm, zoals muis kniegewrichten met de volgende parameters: 10,5 um voxelafmeting bij 55 kv, 145 uA 200 ms integratietijd, 211 beelden.
    5. Import micro-CT-beelden en vastleggen frontale vlak beelden na verdere beeldverwerking (volume rendering en transformatie) (Figuur 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Zoals hier getoond, op dag 28, Ag-specifieke Tregs zakelijk weergegeven CD3 en Ag-specifieke TCR, twee T-cel markers. De CD3 + TCRVβ5 + populatie CD4 tot expressie. De meeste van de CD3 + CD4 + TCRVβ5 + cellen ook tot expressie CD25, CD127, en CTLA-4, die typisch bij verhoogde hoeveelheden worden uitgedrukt in natuurlijk voorkomende T regs (nTregs) en T-cellen die ectopisch Foxp3. Foxp3 expressie in iPSC-afgeleide cellen bleef zelfs na langdurige in vitro stimulatie met de Notch ligand, zoals gedetecteerd door intracellulaire kleuring met flowcytometrie (Figuur 1) geanalyseerd. Bovendien, de Ag-specifieke iPSC-Tregs geproduceerd suppressieve cytokinen, zoals TGF-β en IL-10, wanneer gestimuleerd in vitro met Ag-gepulste splenocyten (figuur 2) waarin de iPSC-Tregs had potentieel onderdrukkende activiteiten. Fluorescentie microscopie onthulde dat meer FoxP3 + cellen aanwezig in waren de OVA-behandeling krijgen dan de PBS-behandelde knieën; er waren geen FoxP3 + cellen bestaande in de knieën bij muizen die de DsRed +-vector getransduceerde iPSCs. Veel meer CD4 + Foxp3 + TCRVβ5 + cellen gepresenteerd in de knieën van muizen die iPSC getransduceerd met de MIDR-TCR-FoxP3 dan MIDR-Foxp3 (figuur 3). Deze waarnemingen suggereren dat Ag-specifieke iPSC-Tregs migreren naar de AIA knie na de adoptieve overdracht in de ontvangende muizen. De overgedragen iPSC-afgeleide cellen aanzienlijk verminderd de knie inflammatoire zwelling wanneer OVA aanwezig was, maar had geen effect op de bestrijding knie die alleen MBSA geïnjecteerd in het muizenmodel (figuur 4); verminderd botverlies in de celoverdracht knie gevisualiseerd door de hoge-resolutie micro-CT (zie figuur 5).

    tp_upload / 54720 / 54720fig1.jpg "/>
    Figuur 1:. Differentiatie van Ag-specifieke iPSC-Tregs Murine iPSCs werden getransduceerd met een construct: MIDR-TCRα-2A-2A-TcR-genen Foxp3 die van OVA-specifieke TCR en Foxp3. Het gen getransduceerde cellen (DsRed +) werden samen gekweekt op OP9-DL1-DL4-IA B-cellen in de aanwezigheid van mFlt3L en mIL-7. (A) Morfologie van T Regs celdifferentiatie op dag 0, 7, 14 en 22. (B) Flow cytometrische analyse van de eiwitexpressie van iPSC-afgeleide cellen op dag 28. CD3 + TCRVβ5 + cellen werden gated zoals aangegeven (R1) en geanalyseerd op de expressie van CD4 en CD8, met CD25, CD127, CTLA- 4, en FoxP3 getoond voor cellen gated als CD4 + CD8 - cellen (R2). (donkere lijnen; gearceerde gebieden aan isotype controles) klik hier om een larg bekijkenER versie van deze figuur.

    Figuur 2
    Figuur 2: Functionele analyse van I n vitro gedifferentieerde Ag-specifieke Tregs Murine iPSC-Tregs werden gestimuleerd door splenocyten. (APC, T regs / APC = 1: 4) en gepulst met OVA peptide 323-339. Intracellulaire cytokine productie (TGF-β en IL-10) werd geanalyseerd door middel van flowcytometrie na gating op levende CD4 + CD25 + cellen. (Donkere lijnen; gearceerde gebieden aan isotype controles) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3: EenG-specifieke iPSC-Tregs infiltreren in de kniegewrichten. Ag-specifieke iPSC-Tregs werden adoptief overgebracht naar C57BL / 6 muizen. Kort na inductie van artritis (dagen 7-14) werden de knieën verwijderd en gekleurd voor immunohistologie (schaalbalken: 20 pm). Muizen die OVA-specifieke iPSC-Tregs hebben grote aantallen TCRVβ5 + cellen in de knieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    Figuur 4: adoptieve overdracht van Ag-specifieke iPSC-Tregs verbetert AIA in Muizen muizen iPSCs werden getransduceerd met de retrovirale construct MIDR, MIDR-FoxP3 of MIDR-TCR-FoxP3 en werden co-gekweekt op de OP9-DL1 / DL4 /. IA b cellen. Op dag 7, de gen-getransduceerde cellen (3 x 10 6 / muis) eendoptively overgebracht in vrouwelijke C57BL / 6 muizen die werden geïnduceerd met AIA twee weken na de celoverdracht. De dag na inductie van artritis, werd de artritis ernst gecontroleerd door het meten van de knie diameter. (AC) Procent toename knie diameter. Toename knie diameter berekend op basis van preinjection knie diameter voor elke muis vóór injectie op dag 0. artritisscore werd geëvalueerd door het onderzoeken van beide knieën op een blinde wijze; elke knie werd een score toegekend (0: geen zichtbare zwelling of verkleuring; 1: zichtbare zwelling met of zonder verkleuring; 2: matige zwelling met verkleuring; 3: ernstige zwelling met verkleuring). In elke groep werden vijf muizen gebruikt, en gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. (D) De gemiddelde maken op dag 7 voor beide knieën van vijf muizen. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten (** p <0,01, *** p <0,001, two-way ANOVA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 5
    Figuur 5:. Ag-specifieke iPSC-Tregs migreren naar de OVA Injected knie en vermindering van de Bone Loss iPSC-Tregs werden adoptief overgebracht naar C57BL / 6 muizen. Binnen 21 dagen na inductie van artritis, werden muizen verdoofd en botarchitectuur rond de muis knieën werd afgebeeld door de micro-CT-systeem. Muizen die OT-II TCR / Foxp3 gen-getransduceerde muizen iPSC-Tregs significante vermindering van botverlies vertonen in vergelijking met muizen die-vector getransduceerde iPSCs regelen. (A) De scans werden uitgevoerd met een lengte van 2,2 mm en afbeeldingen werden gemaakt nadat verdere beeldverwerking (volume rendering en transformatie;schaalbalken:. 1 mm) (B) Bone volume rond kniegewricht werd geëvalueerd met behulp van drie-dimensionale reconstructie van micro-CT-beelden, en bot volume binnen het volume van de rente werd berekend (schaal bars. 1 mm) Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    In dit protocol, een cruciale stap is in vitro differentiatie van TCR / Foxp3-gen getransduceerd iPSCs. In vitro Notch signalering induceert ontwikkeling is in de T-cellijn. Om iPSCs differentiëren in CD4 + Foxp3 + Tregs, gebruikten we de OP9-DL1 / DL4 / IA B-cellen, die zeer express MHC II (IA b) moleculen. De meeste iPSCs differentiëren in CD4 + cellen. Na de oppervlak TCR-expressie vele gedifferentieerde pre-T-cellen verliezen het vermogen om te differentiëren en uiteindelijk sterven. Dientengevolge, het aantal cellen van de iPSC-afgeleide functionele Tregs reduceert na vier weken in vitro differentiatie. Om dit te voorkomen, kan de toevoeging van IL-2 cel overleving op die tijdstippen te verbeteren. Een alternatieve methode voor de rijping en overleving van Ag-specifieke pre-Tregs rijden is om overdracht van de pre-Tregs die in vitro gedifferentieerd voor een week in muizen. Deze pre-Tregs kan samenwerkenntinue differentiatie en rijping in vivo voor nog eens drie weken. Met deze methode kan een functionele Ag-specifieke Treg populatie worden gegenereerd uit iPSCs die nTregs-achtige zijn en hebben de mogelijkheid om autoimmune artritis onderdrukken in het muizenmodel.

    Om de werkzaamheid in vivo ontwikkeling van Ag-specifieke iPSC-Tregs verbeteren, verschillende verbindingen (bijvoorbeeld retinoïnezuur, gelectin) 13,14 of suppressieve cytokinen (bijvoorbeeld TGF-β, IL-10) kan worden gebruikt na de adoptieve overdracht van de pre-Tregs. Naast het vergroten van de overleving cel, kan deze gecombineerde aanpak FoxP3 meningsuiting 14,15 handhaven en verbeteren van de kwaliteit van de Ag-specifieke iPSC-Tregs.

    Een potentieel probleem dat kan ontstaan in vivo Treg ontwikkeling algehele immunosuppressie, waardoor complicaties bij infecties of na gewichtsverlies. Een groot aantal van de Ag-specifieke Tregs ontwikkelen in vivo kunnen infecties verergeren. In dit geval, een zelfmoordgen, de induceerbare caspase 9 (ICasp9) 15,16, kan in het TCR / FoxP3 vector worden geïncorporeerd. Deze aanpak maakt het verwijderen van de stamcel-afgeleide Tregs door de injectie van een bioinert kleine moleculen dimeriseren middel (AP1903) naar "uitgeschakeld" de productie van stamcellen afgeleide Tregs, die dit mogelijke probleem overwinnen.

    Een self-Ag is een typisch eiwit herkend door het immuunsysteem systemen lijden aan een individuele auto-immuunziekte. Deze zelf-Ag is het doel van het immuunsysteem, en de gecorreleerde T-cellen worden niet verwijderd. Generatie zelf Ag specifieke Tregs, het gebruik van TCR transductie is een goede keuze. Een zelf-Ag (bv, hitteshockeiwit) specifieke TCR kunnen worden getransduceerd in volwassen CD4 + CD25 + Tregs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's), en deze aanpak is gebruikt in klinische studies. Subsidiair, described in dit protocol, met behulp van het gen transductie van self-Ag specifieke TCR met FoxP3 en stimulatie met Notch signalering, stamcel-afgeleide Tregs kan zelf-Ag specifieke Tregs.

    -Cellen gebaseerde therapieën voor auto-immuunziekten met behulp van gemanipuleerde Tregs kan nuttig 17 zijn. Hoewel TCR transductie in T-cellen bewezen veilig, uitvoerbaar en in klinische studies te kunnen toepassen, nog belangrijke veiligheidsproblemen als gevolg van de autoimmuniteit veroorzaakt door kruisreactiviteit met 18 gezonde weefsels. Verder met de huidige werkwijzen, genetisch gemodificeerde Tregs hebben meestal een korte termijn persistentie in vivo 19. Als alternatief kan een veelbelovende bron voor het ontwikkelen van grote aantallen monoklonaal Ag-specifieke Tregs is stamcellen. Embryonale stamcellen (SER) de beste pluripotentie en zelfvernieuwing, maar het is niet mogelijk om ze te verkrijgen van patiënten. Hoewel gemakkelijk geïsoleerd uit het perifere bloed, hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn multi-potente stamcellen en kan worden uitgebreid in celkweek vergelijkbaar met SER 20. IPSC onderhavige techniek is gevorderd tot een efficiëntere generatie PSC van somatische cellen van patiënten door transductie van verschillende transcriptiefactoren. Een aantal methodologische verbeteringen ontwikkeld in de afgelopen jaren iPSCs genereren door maximaal mogelijke gevaren zoals immunogeniteit en tumorigeniciteit verminderen. Vergeleken met de SER, iPSCs identieke pluripotentie en zelf-vernieuwing. Hierdoor kan iPSC technologie een voordeel bij het ontwikkelen van patiënt- en / of ziektespecifieke PSC. Het gebruik van iPSCs te ontwikkelen Ag-specifieke Tregs kunnen het gebied van cellen gebaseerde therapieën voor auto-immuunziekten 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Dit project werd gefinancierd, voor een deel, in het kader van subsidies van de National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 en K18CA151798), de American Diabetes Association (1-16-IBS-281), en de Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) aan JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Tags

    Immunologie van regulatoire T cellen pluripotente stamcellen celdifferentiatie-antigeen-geïnduceerde artritis muis autoimmuunziekten
    Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P.,… More

    Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter