Abstract
自己免疫疾患は、免疫学的自己寛容の損失に起因し発生します。制御性T細胞（Treg）免疫学的自己寛容の重要なメディエーターです。末梢血中を循環するものTregの2％ -約1で、マウスおよびヒトにおける成熟したCD4 + T細胞亜集団の10％ - Tregは約5を表します。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、自己免疫疾患の細胞ベースの治療のために使用される可能性を持っている機能のTregへ分化させることができます。ここでは、iPS細胞からの抗原（Ag）から固有のTreg（ すなわち 、IPSC-のTreg）を開発するための方法を提示します。この方法は、iPS細胞への転写因子のFoxP3及びAg特異的T細胞受容体（TCR）を組み込み、次いでノッチを発現OP9間質細胞上で分化に基づいてデルタ様（DL）1とDL4のリガンド。 in vitroでの分化に続いて、IPSC-Tregは、CD4、CD8、CD3、CD25、FoxP3の、およびAg特異的TCRを発現し、Agの刺激に応答することができます。この方法は、正常マウスモデルにおいて自己免疫性関節炎の細胞ベースの治療に適用されています。マウス-bearingのAg誘導関節炎（AIA）にこれらのAg特異的IPSC - Tregの養子移入は、関節の炎症および腫脹を軽減し、骨損失を防止する能力を有します。
Protocol
全ての動物実験は医学動物実験委員会（IACUCプロトコル＃45470）のペンシルベニア州立大学によって承認されており、実験動物管理の評価と認定協会のガイドラインに準拠して行われています。
1.幹細胞培養
- 被覆するためのプレートで37°C（インキュベーター）で少なくとも30分間、0.1％ゼラチン、10 mlの10cmの皿をインキュベートします。
- 皿からゼラチンを除去し、プレート3×10 6 SNL76 / 7細胞を照射し、10％DMEM培地（10％FBSおよび1％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて37°C（インキュベーター）で1日インキュベートします。
- IPSCのメディアを使用してSNL76 / 7細胞フィーダー層上に平板培養解凍iPS細胞から培地を除去（15％ウシ胎児血清、0.1ミリモル/ L非必須アミノ酸、1ミリモル/ LのL-グルタミンを含有するDMEM培地、および0.1ミリモル/ Lのβメルカプトエタノール）9。マウスのiPS-MEF-NG-20D-17セルのLiOct3 / 4、Sox2の、Klf4及びc-Mycのレトロウイルストランスフェクションによるマウス胚線維芽細胞から誘導された、ね、博士山中伸弥（、京都大学再生医科学研究所、京都、日本）から入手しました。
- 新鮮な培地で3日目に培地を変更して、顕微鏡下でIPSCのコロニーを観察します。
注：これらのコロニーは小さく、光沢のあるクラスタまたは蛍光顕微鏡下でGFP発現を示す明確な境界を持つ円形細胞です。
Ag特異的IPSC-Tregのインビトロ分化2.
- 構築物を作製するMIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3の構築物を作製するために自己切断ペプチド2AとリンクMIDRプラスミド10にサブクローン化OT-II TCR遺伝子とのFoxP3によってレトロウイルス形質導入に使用されます。
- パッケージング細胞株としてのPlat E細胞を用いてiPS細胞のレトロウイルス形質導入9を実行します 。
- 0日目に、シードOP9-DL1〜DL4-IA B細胞A20％FCSと2.2グラム/ L重炭酸ナトリウム。プレート10cmディッシュあたり1×10 6個の細胞を含むOP-9培地（α-MEM培地を用いて10 4細胞/ cm 2のTA最小濃度。
- OP9-DL1〜DL4を超える1×10 5 iPS細胞- - OP-9メディアでのIA B細胞OP9-DL1〜DL4-IA B細胞は、メディアを取り出し、0.5をシード、80〜90％のコンフルエントになる3日目、上。
注：これは、OP9-DL1、DL4-IA B細胞上のiPS細胞の共培養を確立し、分化9の0日であると考えられます。 - 5日目に、吸引により10cmディッシュからメディアを削除する1×PBS 10mlで細胞を洗浄し、PBSを吸引。 0.25％トリプシンを4mlを加え、37℃で10分間インキュベートします。室温で5分間、400×gで、細胞にIPSCメディアの別の8ミリリットルを追加し、それらを再懸濁、遠心操作します。
- 吸引した上清とIPSCメディアの10ミリリットルで再懸濁細胞。新鮮な10cmの皿に、これらの再懸濁した細胞をインキュベート30分間インキュベーターに戻します。
注：OP9-DL1〜DL4-IA Bのフィーダー細胞を取り外し、メディアに浮かんで差別性IPSCを保ちます。さらに、共培養のために90％の密集度-維持OP9-DL1、DL4-IA B細胞は、連続的に80を達成します。 - 30分後、浮遊細胞を収集70μmのセルストレーナーを介してそれらをフィルタリングし、血球計数器で細胞を数えます。
- 吸引した上清とIPSCメディアの10ミリリットルで再懸濁細胞。新鮮な10cmの皿に、これらの再懸濁した細胞をインキュベート30分間インキュベーターに戻します。
- OP9培地中のOP9-DL1〜DL4-IA B細胞の90％コンフルエント-新鮮な80シードiPS細胞の5×10 5。 5 ngの/ mlの最終濃度でMFLT-3Lでメディアを補完します。
- 8日目に、10ミリリットルのピペットを用いて、皿自体からメディアでプレートを洗浄することにより、部分的に分化したiPS細胞を収集します。皿の底にOP9単層を破壊しないように静かに慎重に、力強いピペットで半付着細胞を洗い流すために皿にOP-9メディアの別の5ミリリットルを使用してください。すべての半広告を収穫するために10mlのPBSで洗浄を繰り返し、エラン細胞を分化させます。
- MFLT-3L（5ng / ml）およびMIL-7（1 ngの/ ml）を含むOP9培地10mlに再懸濁、室温で5分間、400×gでの洗浄、遠心分離の両方を組み合わせ、および70を介してフィルタμmのセルストレーナー。
- ステップ1.1のように、90％コンフルエントOP9-DL1〜DL4-IA B細胞- 80を含む6ウェル培養プレートに細胞を移します。移動細胞は、6ウェルプレートの1ウェル〜に10cmディッシュから回収します。
- 10日目に、MFLT-3L（5ng / ml）およびMIL-7（1ng / ml）を用いて補足し、新鮮なOP9培地に細胞からの培地の変化分。 2日ごとに、この手順を繰り返します。
- ステップ1.1で説明したように、OP9-DL1〜DL4-IA B細胞の新鮮な層を有するプレート上に成長、再シード差別性IPSCに応じて、すべての4-6日、。
インビトロ Tregの分化および成熟の3評価
- iPS細胞を分化の形態学的変化。
- モーnitor日常従来の明視野顕微鏡（20X）の下で生きた細胞を観察することにより、OP9-DL1〜DL4-IAのB細胞とiPS細胞の共培養。 5日目までに、このような平坦化細胞などの中胚葉のような特性を持つコロニーを観察します。 8日目では、分化する細胞を表す細胞の小さな丸い塊を、観察します。
- 生細胞の数と割合を検出するために、細胞をカウントするためにトリパンブルー排除法を使用してください。血球計数器上の4つのグリッド内のセルの合計数で割った生細胞の数と細胞生存率を計算します。細胞は、トリパンブルーを取る場合は、それらが死亡または非生存を検討してください。培養物から採取した生細胞の数を記録します。
- iPS細胞を分化するフローサイトメトリー分析。
- 日5、7、11、15、19、21、および共培養の28日に、ステップ25のように、0.25％トリプシンで細胞を除去します。
- 異なる蛍光標識抗体を用いた表面染色に先立ち、incubatE 20分間4℃でPBS（最終濃度は10μg/ ml）に希釈したFcブロッカー2.4G2100μlの1×10 6個の細胞は、細胞表面上のFc受容体への抗体の結合を防止します。
- 日5、7、11、15、19、21、及び28に、CD3、TCRβ、CD4、CD8、CD25などの細胞表面マーカーを検出するために、異なる蛍光色素結合抗体でフローサイトメトリーのために1×10 6個の細胞を使用し、およびCTLA4。
- Fcをブロックに続いて、フローサイトメータ15の色とフローサイトメトリー分析を行った後、4℃で20分間、異なる蛍光色素結合抗体で10 mlのPBSと染色で細胞を洗浄し、。 100μlのPBS中に希釈した10 6個の細胞当たりの抗体の0.200μgのを使用してください。
- 28日目に、CD4とCD8蛍光色素結合染色を用いてCD4 + CD8 +細胞上に11とゲートフローサイトメトリーによって細胞を分析します。 TCRVα2、TCRVβ5、CD25、CTLAの発現について分析します-4、およびFoxP3の（ 図1）。 FoxP3の染色のために、細胞を固定し、それらをpermealizeした後、抗体染色11を行います。
- iPS細胞のin vitroでの抗原刺激で 。
- 浮遊細胞を収集することにより培養物からの共培養、収穫IPSC-Tregの28日目。 （ステップ2.5のように）0.25％トリプシンでの細胞の残りの部分をトリプシン処理し、IPSC培地8mlに細胞を再懸濁。室温で400×gで5分間遠心操作し、メディアを吸引し、再びメディアの10ミリリットルで再懸濁細胞。
- 37℃で30分間、新しい10cmディッシュで再懸濁した細胞を培養し、浮遊細胞を収集します。冷PBSで細胞を洗浄。
- 96ウェルプレート11で30分間、4℃で200μlの培地で5μMのオボアルブミンペプチドを用いたマウス（OVA 323-339） - / - C57BL / 6 RAG1の脾臓から3×10 6脾細胞をインキュベートします。
- OVA 323-339でのTregを混ぜます 1での脾細胞：4の比率（0.75×10 6のTregを使用します）。 40時間、CO 2インキュベーター中で37℃でインキュベートします。最後の4時間で、文化（1×培養培地で希釈した実際の濃度の1,000倍）に希釈しブレフェルジンAの4μlを添加します。
- （ステップ2.5のように）0.25％トリプシンで収穫細胞は、希釈した（最終濃度10μg/ ml）のFcブロッカー2.4G2、及び汚れの100μlで10％のNaN 3と0.5 M EDTA溶液（FACS緩衝液）、ブロックで洗浄します表面マーカーのための、CD4、CD8、TCRVα2、およびTCRVβ5ステップのように3.2.3-3.2.4。
- PBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、細胞表面染色した後、1xの透過化緩衝液100μlで透過性。 注意！パラホルムアルデヒドは、アレルギー性の発癌性、及び有毒です。
- 暗所で20分間、蛍光標識TGF-βおよびIL-10で細胞を染色します。抗体の0.200μgの/ 10 6個の細胞を使用しdilut100μlのPBSでエド。 15色フローサイトメーター（ 図2）で、TGF-βおよびIL-10の細胞内産生を検出します。
- フローサイトメトリー分析11の前に、冷FACS緩衝液で細胞を3回洗浄します。
- 浮遊細胞を収集することにより培養物からの共培養、収穫IPSC-Tregの28日目。 （ステップ2.5のように）0.25％トリプシンでの細胞の残りの部分をトリプシン処理し、IPSC培地8mlに細胞を再懸濁。室温で400×gで5分間遠心操作し、メディアを吸引し、再びメディアの10ミリリットルで再懸濁細胞。
- Ag特異的IPSC-Tregの生体内持続性で 。
- OP9-DL1〜DL4-IA B細胞上の共培養の8日後、転送IPSC由来の前のTregを経由してステップのThy 1.1コンジェニックマウスに3.3.1（4-6週齢）のように（Thy1.2）麻酔なしの尾静脈注射。尾静脈注射を行う前に、5分間赤外線ランプを用いて尾静脈を拡張させます。尾静脈拡張した後、拘束中のマウスと養子移入尾静脈から注入することにより、200μlのPBSに再懸濁し、3×10 6個の細胞を配置します。
- 6週間のTreg転送後、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを安楽死させます。マイルことを確認してくださいceが呼吸していないされています。ハサミやピンセットを用いて腹膜の外皮を切断し、静かに腹腔の内側を覆う内側の皮膚を露出するために、それを引き戻すことにより、腹腔を開きます。注入のThy 1.1コンジェニックマウスの脾臓および末梢リンパ節を分離します。
- 単一細胞懸濁液を得るために、機械的破壊を使用して、脾臓およびリンパ節からの細胞を収集します。赤血球を溶解し、室温で5分間ACK溶解緩衝液5mlで細胞をインキュベートします。収集し、冷FACS緩衝液10mlで残りの脾細胞またはリンパ球を洗います。
- 洗浄後、希釈された蛍光色素結合抗Thyの100μlの1.2抗体を用いてステップ3.2.2と汚れのように4℃で20分間のFcブロッカー2.4G2で細胞を扱います。
- FACS緩衝液10mlで細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析11を流れるように進みます。
インビボでの成熟と自己免疫性関節炎の抑制4.
- サイトカインMFLT-3Lの存在下で、OT-II TCR / FoxP3の形質導入iPS細胞（OT-II-のFoxP3 /性IPSC）、FoxP3の形質導入性IPSC、およびOP9-DL1〜DL4-IA B間質細胞上のDsRed形質導入されたiPS細胞を分化し、 MIL-7のステップ2.1で説明したように8日間 - 2.6。
- Trypisinize 10cmプレートからの細胞の3つのすべての種類の新鮮な培地10mlに各10cmプレートから細胞を再懸濁します。新鮮な10cmプレートに細胞を加え、30分間インキュベーターに戻します。 30分後、浮遊細胞を収集します。
- 細胞塊を除去し、血球計数器を用いてカウントするように70μmのセルストレーナーを介して細胞を渡します。冷PBSで1.5×10 7細胞/ mlの濃度に細胞を調整し、必要に応じて再びフィルタリングします。マウスへの養子細胞移入するまで氷上で細胞を保管してください。 3.4.1で説明したように尾静脈から6週齢の雌C57BL / 6マウス- 4の三つの異なるグループに細胞懸濁液200μl（3×10 6細胞）を注射
- 細胞移入後10日目の、mBSAを100μgをマウスに注射1mlシリンジを用いて、尾の基部にフロイント完全アジュバント中に乳化。
- 17日目には、（IACUCガイドラインに従って）イソフルラン気化器を使用して、マウスを麻酔。誘導のための5％イソフルランと1 - - 保守のための2％4を利用しています。関節および20μgのmBSAと右膝関節内の10μlのPBS中の100μgの全OVAの左膝に10μlのPBS中20μgのmBSAをの関節内注射により関節炎を誘発します。関節炎が開発した後に食品やgelpackは寝具の床の上に配置することができます。 2/5または瀕死、重度の悪液質および/または持続性の横臥（24時間周期）のボディコンディションスコア（BCS）、および重症度スコアで4スコア：マウスは安楽死させます4、紅斑及び重度の腫れが足首、足と数字、または手足のankylosesを包含する。
- 未定着のライブのDsRed + GFP +細胞を可視化する蛍光顕微鏡（20X）を使用します。
- 両方のウエスタンブロットによる遺伝子組込みおよび発現を調べ、11フローサイトメトリー。
- 週2,4および細胞移入後6で、マウスを安楽死させます。第一段階でのCO 2の2 L -安楽死のために、各ケージに1を使用します。 5L /分-動物が意識を失った後、4にCO 2の流量を増加させます。 CO 2吸入によりマウスを安楽死させます。脾臓を分離し、ハサミやピンセットを用いて腹膜の外皮を切断し、静かに腹腔の内側を覆う内側の皮膚を露出するために、それを引き戻すことにより、リンパ節を排出。
- 単一細胞懸濁液Fを集めますROMセルストレーナー1％IPSC培地1 mlシリンジを用いて、機械的な故障による脾臓およびリンパ節。遠心機で5分間400gでメディアを含むコニカルチューブ。赤血球を溶解するために、ACK溶解緩衝液5mlで細胞ペレットを再懸濁します。再遠心分離機5分間1,000rpmで。細胞ペレットを再懸濁し、冷FACS緩衝液で残りの脾細胞またはリンパ球を洗います。手順を3.4.4に従い - 3.4.5をし、フローサイトメトリー分析に進みます。
- 50日目、攻撃後に、脾臓を分離し、頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によって安楽死した後（ステップ4.5.1のように）マウスのリンパ節を排出。
- セルストレーナーと1ミリリットル注射器を用いて機械的な故障により脾臓およびリンパ節からの単一細胞懸濁液を収集します。赤血球を溶解するために、ACK溶解緩衝液5mlで5分間室温で脾細胞をインキュベートします。残りの秒を収集し、洗浄冷たいFACS緩衝液でplenocytesまたはリンパ球。表面マーカーCD4、CD8、CD25、およびTCRVβ5と3.2.4が、ステイン - 手順3.2.3に従ってください。
- 3.3.7ライブCD4 + CD25 +細胞の細胞内サイトカイン産生（TGF-βおよびIL-10）IPSC由来のTregのゲートを分析- 3.3.5で説明したように細胞内染色のために細胞を固定するために進んでください。
- 日7上-手順（4.3.6 4.3） -次の14ポスト関節炎の誘導を、頸椎脱臼（IACUCガイドラインに従って）、続いてCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。電気バリカンで膝から髪を削除し、外科的手順によって膝を切り出します。
- 平滑末端ハサミで後肢の切開を行うことで、足から皮膚を削除し、足首に太ももを横断し、ダウン状態のスキンをカット。静かに筋肉を露出させるために、脚と足の上の皮膚の皮をむきます。削除します慎重に膝関節にダメージを与えることなく、脚の筋肉。
- ちょうど骨盤/股関節の上に後肢をカットし、シャープな解剖ハサミを使用して脛骨を切りました。
- 48時間、4％ホルマリンで膝を修正しました。 2.5 Mギ酸を使用して膝を脱灰。 、100％エタノールで二回すすぎ、95％エタノールで二回すすぎ、2分間、脱イオン水で二度すすぎ、及び1mM EDTAで脱灰、3分間キシレンで三度すすぎます。 20分間のサブ沸点（90℃）で治療します。
- 30分間固定した組織を冷却します。 4分間、1×PBSでそれを洗浄し、パラフィンに埋め込みます。水を置換するためにエタノール浴の一連の組織を脱水し、その後ワックスでそれらを浸透させます。そして、ワックスブロックに潜入した組織を埋め込みます。染色のための垂直方向と水平方向の切片の両方を実行します。スライディングミクロトームで4μmの切片を準備します。
- deparaffiの標準的な手順の後のセクションに免疫蛍光染色を行いますキシレンとエタノール12を使用してnizationし、再水和。
- 銀に検索した後3分間、3％過酸化水素水の十分な量のスライドを浸漬することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。 60分間加湿チャンバー内で室温にてPBS中の3％BSAで非特異的結合のブロックスライド。
- ブロッキング溶液中で1：100に希釈した蛍光標識TCRVβ5抗体200μlで染色切片。 75で、室温で2時間インキュベート - 100％加湿チャンバー、5分間1×PBSで5回洗浄します。
- DAPIを含む抗退色試薬を用いて核染色用のスライドを対比染色。全体のカバースリップがカバーされていることを特定すること、カバースリップに希釈DAPI染色溶液（1×PBS中に300 nM）を約300μLを加えます。蛍光顕微鏡（ 図3）で分析するまで4℃で暗所でスライドを保管してください。
- ベースラインを確立するために、ダイヤルゲージキャリパーを使用して関節炎誘導前のマウスの両膝の腫れを測定します。
- 関節炎の誘導およびTregの転送のために - 手順（4.3.6 4.3）に従います。ダイヤルゲージキャリパー後のTreg転送にマウスの膝を測定します。
- - / 0日目に膝直径％増=（0日目に膝直径1日目の膝の直径）：膝の直径増加パーセントを計算します。
- 7日後に関節炎の誘導で、前述したように、マウスを安楽死させると、外科的処置によって膝を切り出します。 4.7.2 - ステップ4.7.1を参照してください。
- 、4％ホルマリン中に膝を修正EDTAで脱灰し、パラフィンに埋め込みます。ステップ4.7.3を参照してください。
- 10％ホルマリンで固定し、両膝を外し、Formical-4に石灰化。パラフィン、4ミクロンでのセクションで組織を埋め込み、hematoxylと染色およびエオシン（H＆E）または（ステップ4.7.7のように）サフラニンO染色し、顕微鏡下で観察します。
- 半定量的スコアリングシステムを用いて骨侵食を評価するために、H＆E染色を使用します（0：なしびらん; 4：拡張びらんや骨の破壊を）。プロテオグリカンの損失を評価し、半定量的スコアリングシステムとスコアにサフラニンO染色を使用します（0：プロテオグリカンの損失なし; 3：プロテオグリカン染色の完全な喪失を）。
- H＆E染色スライド上の炎症性細胞浸潤得点を半定量的スコアリングシステムを使用します（0：なし細胞浸潤を、4：細胞浸潤を富ん）。盲検法で両膝を調べることによってスコアを評価します。
高解像度マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）システムと膝での骨量減少の5測定
- 10日後の関節炎の誘導で、2％イソフルランでマウスをanaesthetizeおよびイメージングのための準備。
- ポジションマイクチャンバー内に上向き膝と電子。
- マウスの膝の周りの骨アーキテクチャのin vivoイメージングで取得するために、高解像度マイクロCTシステムを使用してください。
- 55 KV、145μA200ミリ秒の積分時間、211画像で10.5ミクロンのボクセルサイズ：次のパラメータを使用して、マウスの膝関節を含む、2.2ミリメートルの長さのマイクロCTスキャンを実行します。
- インポートマイクロCT画像と、さらに画像処理（ボリュームレンダリングと変換）（ 図5）後前頭面画像をキャプチャします。
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Representative Results
28日目に、ここに示されるように、Ag特異的Tregは、実質的にCD3およびAg特異的TCR、2つのT細胞マーカーを発現しました。 CD3 +TCRVβ5+集団は、CD4を発現しました。 + CD3 +TCRVβ5+ CD4のほとんどの細胞はまた、CD25、CD127、およびCTLA-4、一般的に天然に存在するTのREGS（nTregs）および異所のFoxP3を発現するT細胞で上昇したレベルで発現される表現しました。フローサイトメトリー（図1）によって分析し、細胞内染色によって検出されるIPSC由来細胞中でFoxp3発現は、Notchリガンドでin vitro刺激後も長期間持続しました。 IPSC-Tregは潜在的な抑制活性を持っていた示し、Agをパルス脾細胞（図2） を用いてインビトロで刺激した場合また、Ag特異的IPSC-Tregは、そのようなTGF-βおよびIL-10などの抑制サイトカインを産生しました。蛍光顕微鏡は、明らかにより多くのFoxP3 +細胞は、PBS処置膝よりもOVA処理した中に存在していたこと。何のFoxP3 + DsRedを+ベクター形質導入iPS細胞を受けたマウスでは膝に存在する細胞が存在しませんでした。さらに多くのCD4 + MIDR-FoxP3のよりMIDR-TCR-のFoxP3で形質導入iPS細胞を受けたマウスの膝に提示のFoxP3 +TCRVβ5+細胞（図3）。これらの観察は、Ag特異的IPSC-Tregはレシピエントマウスに養子移入した後、AIAの膝に移行することを示唆しています。転送IPSC由来細胞は、実質的にOVAが存在したときに腫れ炎症性膝を減少させたが、唯一のマウスモデル（図4）でのmBSAを注射した対照膝に影響を及ぼしませんでした。高解像度のマイクロCTシステム（図5）によって可視化セル転送膝の骨の損失を減少させました。
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図1：Ag 特異的IPSC-Tregの分化マウスiPS細胞を構築物で形質導入した：MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-のFoxP3は、OVA特異的TCRとのFoxP3の遺伝子を含みます。遺伝子導入細胞（DsRedを+）は mFlt3LおよびMIL-7の存在下でOP9-DL1〜DL4-IAのB細胞で共培養した。0日目のT regsは細胞の分化、7、14の（A）モルフォロジーと当日のIPSC由来細胞のタンパク質発現のための22（B）フローサイトメトリー分析28. CD3 +TCRVβ5+細胞が示されているように（R1）ゲーティングおよびCD25、CD127、CTLA-で、CD4とCD8の発現について分析しました4、とのFoxP3は、CD4 + CD8としてゲート細胞に対して示さ-細胞（R2）（暗線;斜線部分はアイソタイプ対照を示している）。 ラーグを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のERバージョン。
図2：I nはインビトロ 分化したAg特異的Treg の機能解析マウスIPSC-のTregは、脾臓細胞によって刺激した。抗原提示細胞（APC; Tのregsは / APCに= 1：4）およびOVA 323-339ペプチドをパルス。細胞内サイトカイン産生（TGF-βおよびIL-10）は、細胞+ライブCD4 + CD25でゲーティングした後、フローサイトメトリーによって分析した（暗線;斜線部分はアイソタイプ対照を示している）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：グラム固有の膝関節へのIPSC-のTreg潜入。Ag特異的IPSC-Tregが養子C57BL / 6マウスに移しました。まもなく関節炎誘導（日7から14）の後、膝を除去し、免疫組織学のために染色された（スケールバー：20μm）を。 OVA特異的IPSC-のTregを受けたマウスは、膝でTCRVβ5+細胞の数が多い。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Ag 特異的IPSC-Tregの養子移入は、マウスにおけるAIAを改善するマウスiPS細胞は、レトロウイルス構築物MIDR、MIDR-のFoxP3、またはMIDR-TCR-のFoxP3としたOP9-DL1上の共培養/ DL4 /形質導入しました。 IA B細胞。 7日目に、遺伝子導入細胞（3×10 6 /マウス）となりましたdoptively 2週間細胞移入後AIAで誘導した雌のC57BL / 6マウスに移しました。関節炎の誘導後の日に、関節炎の重症度は、膝の直径を測定することによりモニターした。膝の直径（AC）％増加。膝の直径の増加0関節炎スコアは盲検様式で両膝を調べることにより評価した日に注射する前に、各マウスのためのパイロット噴射膝直径に基づいて計算しました。各膝はスコア割り当てられていた（0：目に見える腫れや変色を; 1：または変色することなく、腫れ目に見える; 2：変色して腫れ適度な; 3：重度の変色と腫れ）。各群において、5匹のマウスを使用し、データは3つの独立した実験の代表です。データは、平均±SDとして表される。（D）平均は5匹のマウスから両膝のための7日目に得点します。データは、3つの独立した実験（** はp <からの平均±SDとして表されます0.01、*** P <0.001、双方向ANOVA）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：OVA にAg特異的IPSC-Tregの移行が膝を注入し、骨損失を低減 IPSC-のTregが養子C57BL / 6マウスに移しました。 21日後、関節炎誘導の中では、マウスを麻酔し、マウスの膝の周りの骨のアーキテクチャは、マイクロCTシステムによって画像化しました。 OT-II TCR / FoxP3の遺伝子を形質導入したマウスIPSC-Tregは、ベクター形質導入iPS細胞を受けたマウスを制御するために比較して、骨損失の大幅な減少を示す受けたマウス。（A）スキャンが2.2ミリメートルの長さを用いて行った、と画像が後に捕獲されましたさらに、画像処理（ボリュームレンダリングと変換。スケールバー：。（スケールバー1ミリメートル）（B）膝関節の周りの骨量は、マイクロCT画像の3次元再構成を用いて評価し、関心ボリューム内部骨体積を計算した：1ミリメートル） にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
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Discussion
このプロトコルでは、重要なステップは、TCR / FoxP3の遺伝子形質iPS細胞のインビトロ分化である。 インビトロで Notchシグナル伝達は、T細胞系統に向けて開発を誘導します。 CD4 + FoxP3の+ TregのにiPS細胞を区別するために、我々は非常にMHC II（IA b）の分子を発現するOP9-DL1 / DL4 / IA B細胞を、使用していました。 iPS細胞の大部分は、CD4 +細胞に分化します。しかし、表面TCR発現の後、多くの分化プレT細胞が分化し、最終的には死ぬ能力を失います。その結果、IPSC由来の機能的Tregの細胞数は劇的インビトロ分化の4週間後に減少します。これを回避するために、IL-2の添加は、これらの時点での細胞生存率を向上させることができます。 Ag特異的プレTregの成熟および生存を駆動する別の方法は、マウスに一週間のために、in vitroで分化した前のTregを転送することです。これらの予備Tregは共存することができntinue差別と別の3週間のためにin vivoで成熟。この方法を使用して、機能的なAg特異的Treg細胞集団はnTregs状であり、マウスモデルにおいて自己免疫性関節炎を抑制する能力を有するiPS細胞から生成することができます。
Ag特異的IPSC - Tregのin vivoでの発達の効力を改善するために、別の化合物（ 例えば 、レチノイン酸、gelectin）13,14または抑制性サイトカイン（ 例えば 、TGF-β、IL-10）は、養子移入後に使用することができます前Tregの。細胞の生存を増加させることに加えて、この組み合わせアプローチは、Foxp3発現14,15を維持し、Ag特異的IPSC - Tregの品質を向上させることができます。
in vivoでのTreg開発のために生じ得る潜在的な問題は、感染またはその後の体重減少時の合併症で、その結果、全体的な免疫抑制です。 viの中で開発Ag特異的Tregの多数VOは、感染症を悪化させる可能性があります。この場合、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ9 （iCasp9）15,16は 、TCR / FoxP3のベクターに組み込むことができます。このアプローチは、生体不活性小分子二量体化剤（AP1903）の注射による幹細胞由来のTregの除去はこの潜在的な問題を克服します幹細胞由来のTregの生成を「遮断」することができます。
自己Agが、個々の自己免疫疾患を患っているホストの免疫系によって認識典型的なタンパク質です。この自己Agが免疫系の標的であり、相関T細胞が削除されません。自己のAg特異的Tregを生成するには、TCR伝達の使用は良い選択です。自己のAg（ 例えば 、熱ショックタンパク質）は、特定のTCRは、末梢血単核細胞（PBMC）から成熟したCD4 + CD25 + Tregsのに導入することができ、このアプローチは、臨床試験において利用されています。また、DESなど遺伝子のFoxP3と自己のAg特異的TCRの伝達およびNotchシグナル伝達による刺激を使用して、このプロトコルでcribed、細胞由来のTregをステムは、自己のAg特異的Tregすることができます。
工学のTregを利用し、自己免疫疾患のための細胞ベースの治療は、17有用である可能性があります。 T細胞におけるTCR形質導入は、安全な実行可能、及び臨床試験においても適用可能であることが判明しているが、原因で健康な組織18との交差反応性によって引き起こされる自己免疫の主要な安全性の問題は依然として存在します。さらに、現在の方法を用いて、遺伝的に改変されたTregは通常、 生体内 19 の短期的な持続性を持っています。あるいは、モノクローナルAg特異的Tregの多数を開発するための有望な供給源は、幹細胞です。胚性幹細胞（ESC）は、最高の多分化能および自己再生を持っているが、患者からそれらを得ることは不可能です。簡単に末梢血から単離したが、造血幹細胞（HSC）は、マルチです強力な幹細胞とESCの20と同様に、細胞培養物中で増殖することができます。本IPSC技術は、異なる転写因子の形質導入によって、患者の体細胞からPSCのより効率的な生成に進んでいます。方法論的な改良の数が最大にかかる免疫原性および腫瘍原性のような潜在的な危険を減少させることによりiPS細胞を生成するために、近年開発されてきました。 ESCのに比べ、性IPSCは、同一の多能性と自己複製を持っています。その結果、IPSC技術はpatient-および/または疾患特異のPSCを開発する利点を提供することができます。 Ag特異性Tregを開発するiPS細胞の使用は、自己免疫疾患10,11のための細胞ベースの治療の分野を進めることができます。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、健康（R01AI121180、R21AI109239とK18CA151798）、米国糖尿病協会の国立研究所からの助成金の下で、一部には、資金を供給された（1月16日 - IBS-281）、および健康のペンシルベニア州省（たばこ和解基金）へJS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6j mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| B6.129S7 Rag1tm1Mom/J | Jackson Laboratory | 2216 | |
| Anti-CD3 (2C11) antibody | BD Pharmingen | 553058 | |
| Anti-CD28 (37.51) antibody | BD Pharmingen | 553295 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100417 | |
| Anti-CD8 (53–6.7) antibody | Biolegend | 100714 | |
| Anti-CD25 (3C7) antibody | Biolegend | 101912 | |
| Anti-TCR-β (H57597) antibody | Biolegend | 109220 | |
| Anti-IL10 | Biolegend | 505010 | |
| Anti-TGFβ | Biolegend | 141402 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Genejammer | Integrated science | 204130 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | peprotech | 217-17 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| mBSA | Sigma | A7906 | |
| Ova albumin | Avantor | 0440-01 | |
| CFA | Difco | 2017014 | |
| Tailveiner restrainer | Braintree scientific | RTV 150-STD |
References
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