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Biochemistry

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드 Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.

Abstract

세로토닌 전달체는 세포로 세포 세로토닌 "펌프"는 나트륨과 염소 결합 수송된다. S의 시탈 로프 람은 세로토닌 재 흡수를 차단하는 고 친화력 세로토닌 운반체에 결합함으로써 우울증 및 불안증의 치료에 사용되는 약물이다. 여기에서 우리는 효율적인 절차 및 명시 적, 안정 정화 및 S의 시탈 로프 람과 다른 항우울제에 결합 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 구체화 할 수있는 도구 세트를보고한다. 세로토닌 전달체를 안정화 돌연변이는 결합 분석을 S - 시탈 로프 람을 사용하여 확인 하였다. 배큘로 바이러스 - 형질 감염된 HEK293S GnTI 발현 세로토닌 운반자 - 세포로 재구성 테오 높은 친 화성 항체를 발생하기 위해 사용되었다. 우리는 구조 연구를위한 유용한 항체를 발견하는 전략을 개발했습니다. Sf9 세포에서의 항체 단편의 발현을위한 직접적인 방법은 확립되어있다.이 절차를 사용하여 정제 수송 - 항체 복합체는 잘 행동하고 쉽게 3-4 Å 해상도에 X 선을 회절 S의 시탈 로프 람과 복합체를 생산, 결정화입니다. 여기서 개발 된 전략은 다른 도전 막 단백질의 구조를 결정하는데 이용 될 수있다.

Introduction

세로토닌 운반체 (SERT)는 세포막에 걸쳐 1 세로토닌의 수송을 용이하게하는 세포막 단백질이다. SERT 또한 도파민과 노르 에피네프린 수송 (2) 신경 전달 물질 나트륨 Symporters (NSSS)의 가족에 속한다. 세로토닌 SERT 경쟁적 수송층 (3)을 억제하는 작용을 널리 처방 우울 및 항 불안 약물의 분자 표적이다. SERT는 시냅스 틈새에서 신경 전달 물질을 제거하는 나트륨의 에너지 적으로 유리한 cotransport을 이용한다. 세로토닌 시스템의 광범위한 특성은 세로토닌 대사의 변화가 거의 기분, 수면, 통증,인지 등 모든 신경 프로세스에 영향을 미칠 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 침략은 4 행동들. SERT 함수 S의 시탈 로프 람과 같은 항우울제 및 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 (SSRI는)의 사용을 통해뿐만 아니라 psychostimula 의해 변형 될 수있다국세청 및 암페타민과 3,4- 메틸렌 디 옥시 N의 -methylamphetamine 또는 "엑스터시"1, 2 등의 중독의 약물.

SSRI는 기분 장애의 치료에 대단히 중요하다, 그러나 자신의 행동에 대한 정확한 구조적으로는 잘 이해되지 않습니다. WT SERT 따라서 SERT 5,6의 3 차원 구조의 진전을 저해 세제 미셀 불안정하다. 최근에는 세제의 넓은 범위에서 견고하게 안정하고 활성 6 바인딩 SSRI 유지 SERT의 변이체를 개발 하였다. 이 내열성 SERT의 변형은 섬광 근접 기반의 열 안정성 분석을 이용하여 선정되었다. 여기에서 우리는 항체 및 S의 시탈 로프 람 복잡한에, SERT을 결합 할 수있는 높은 친 화성 항체의 생성을위한 절차 및 내열성 SERT의 정제 및 결정화에 대해 설명합니다.

이 프로토콜은 SERT 및 8B6 유전자가 성공적인 된 것으로 가정Y는 각각 BacMam 7 및 곤충 발현 벡터에 클로닝. 항체를 생성하려면, cDNA를 코딩하는 잔류 WT SERT의 73-616은 C 말단 연쇄상 구균 II 태그 (SERT IC)와 BacMam 벡터에 클로닝 하였다. 열 안정성 화면 들어 SERT 잔기 C 말단 GFP와 73-616, 패 혈성 II 및 10 그의 태그 (SERT의 TC)를 사용 하였다. 개별 점 돌연변이는 SERT TC 배경에서 발생했다. 결정화 프로토콜의 경우, SERT-GFP 융합 단백질 표면 시스테인 C554A, C580A의 열 안정성 돌연변이, Y110A, I291A, 및 T439S 돌연변이를 들고, 트윈 연쇄상 구균 [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] 10-그의 태그 사용 및 C622A (SERT의 CC). 트롬빈 절단 서열 (LVPRGS)도 N- 제거 및 C 말단을 허용 Q76 및 T618 후 SERT의 CC에 삽입 하였다. 8B6 팹을 코딩하는 플라스미드는 무거운 빛을 모두 표현하기 위해 설계되었다두 개의 별도의 폴리 헤드린 프로모터의 조절하에 GP67 분비 서열과 항체의 사슬. 8B6 항체의 중쇄의 C- 말단 8 His 태그를 태그로하고, 트롬빈 ​​절단 부위는 중쇄 및 태그 사이에 삽입 하였다.

Protocol

자기편 감염된 HEK293S GnTI 1. 형질 - 열 안정성 화면에 대한 세포

  1. 폴리 D 라이신 (PDL)를 96 웰 플레이트를 준비 - 코팅. 멸균 층류 후드에서 모든 작업을 수행합니다.
    1. 0.2 μm의 살균 필터를 사용하여,의 25 μg의 / mL의 용액 (PDL), 분자량 70,000-150,000 다를 필터링합니다. 바닥이 고르게 도포 보장 96- 웰 조직 배양 (TC) 플레이트의 각 웰에 PDL의 50 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
    2. 기음 PDL 솔루션 및 멸균 물 200 μL 씻어.
    3. 허용 판 4 ℃에서 저장 전에 2 시간 동안 공기 건조를합니다. PDL 코팅 된 플레이트는 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 부착 감염된 HEK293S 세포의 트립신.
    1. 8 % CO 2와 37 ° C로 유지 된 10cm 접시에 80 % 컨 플루에 감염된 HEK293S 성장. 단일 10cm 접시는 약 1000 만 감염된 HEK293S 세포를해야한다. 30 구절 후 세포를 사용하지 마십시오! 기음 미디어와 인산염 완충 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 씻는다. 세포에 트립신 - EDTA 용액 (0.25 % 트립신, 0.02 % EDTA) 1 mL를 넣고 37 ℃에서 2 분 동안 품어.
    2. 반복적로 pipetting에 의해 및 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및에 resuspend 세포를 보충 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)의 10 ML을 추가합니다.
    3. 피펫 (10) 세포의 μL, 10 μL 트리 판 블루 용액 (0.4 %)로 혼합한다. 혈구와 광학 현미경을 사용하여 세포 밀도를 결정한다. 그들은 죽은 파란색으로 염색 세포를 계산하지 마십시오. 그 세포 생존율이 90 % 이상 확인합니다.
  3. 철저히 감염된 HEK293S GnTI를 트립신 재현 탁 - DMEM 셀 일회용 피펫 저장조에서 0.5 × 106 세포 / ㎖의 농도로 10 % FBS가 보충. 약 5 백만 감염된 HEK293S 세포는 각각의 판을 위해 필요합니다. (24) 구조의 총이 홍보를 사용하여 각 접시에 형질 전환 될 수있다otocol.
  4. 멀티 채널 피펫을 사용하여, PDL 코팅 플레이트의 각 웰에 세포 100 μL를 추가합니다. 각각의 판을 작성 후 피펫 저수지에 재현 탁 세포는 세포의 균일 한 분포를 보장합니다. 8 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 세포를 품어. 24 시간 후, 세포는 약 80 % 포화 상태에 도달한다.
  5. 이전에 형질 전환에 1 시간은 미디어를 교체합니다. 형질 전환을위한 DNA-형질 전환 시약 복합체를 준비합니다.
    1. 각각 상영 될 SERT의 TC 배경에 구성의 경우, 무 혈청 DMEM 45 μL와 450 ng의 DNA를 혼합하고 혼합한다. 무 혈청 DMEM 45 μL에 형질 전환 시약 1.6 μL를 추가하고 혼합한다.
    2. 즉시 DNA 용액 희석 형질 감염 시약 용액을 첨가하고 혼합한다. 역순으로 솔루션을 함께 사용하지 마십시오. 15 분, 4 우물에 형질 전환 시약 / DNA 혼합물의 20 μL를 추가 - (10)를 기다립니다.
  6. 모든 우물이 형질 전환 된 후에 조심스럽게 다시 흔들어 판을 혼합차 항 및 37 ° C 배양기로 돌아갑니다.
  7. 24 시간 DMEM 혈청 함유 된 10 mM 소듐 부티레이트로 미디어를 교체 - 16 일 후.
  8. 약 48 시간 후 형질 미디어를 제거하거나 즉시 나중에 사용할 수 있도록 -80 ° C에서 세포를 열 안정성 화면을 진행 또는 동결. 세포는 몇 주 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다.

S의 시탈 로프 람 2. 섬광 근접 기반의 열 안정성 화면

  1. RT에서 5 분 - (20 mM 트리스, pH가 8, 100 mM의 NaCl을 TBS 버퍼) TBS의 25 μL에서 200 nm의 S 시탈 로프 람과 세포를 품어.
  2. 첨가하여 세포를 용해 8 밀리미터 N 도데-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM의 콜레 스테 hemmisuccinate (CHS), 프로테아제 억제제 칵테일 (2 mM 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 0.1 ㎎ / ㎖의 아프로 티닌, 4g 25 μL / ㎖ 펩 스타틴 A, 4 μg의 / ㎖의 류 펩틴)에서 TBS와 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션.
  3. TBS 위스콘신의 50 μL를 추가제 20 nM의 [3 H] 시탈 로프 람 (81.7 CI / mmol)을 0.1 % 소 혈청 알부민, 2 ㎎ / ㎖ 그의 태그 친화 섬광 근접 분석법 (SPA) 각각의 구조에 대한 세 개의 웰 구슬. 마지막으로 잘 나와 같은 솔루션을 추가하지만 비특이적 결합을 결정하기 위해 100 μM의 세르 트랄 린과 보완. 96 웰 플레이트에 추가 할 때 그의 태그 선호도 SPA 비즈 철저하게 혼합되어 있는지 확인합니다.
  4. 측정 [3 H] 시탈 로프 람은 웰 당 1 분 카운트 시간 RT에서 96 웰 신틸레이션 계수기를 사용하여 결합. 총 카운트 (약 36 시간 후) 고원까지 계산 판을 계속합니다.
  5. 33 ° C로 가열 된 뚜껑을 가진 가열 블록에서 15 분 동안 열판. 2.4에 기재된 바와 같이 [3 H] 시탈 로프 람 바인딩 가열 후 다시 측정한다.
  6. 단계를 반복 2.4-2.5, 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, 51 ° C까지 가열 공정을 변경합니다. 외관상의 용융 온도에 따라 가열 온도를 조정 (TM)표적 단백질 가장 안정된 구조의 내열성의. 모든 구조가 낮은 특정 수를 때까지 판을 가열하기 위해 계속합니다.
  7. TM을 값을 결정하기 위해 데이터를 분석한다.
    1. 3 복제 우물을 평균하여 세르 트랄 린을 포함하지 않는 우물을 위해 구축 각각의 평균 총 카운트 분 당 (CPM)을 결정합니다. 하나의 플레이트에 각 웰 포함 세르 트랄 린의 CPM을 평균하여 비특이적 CPM을 결정합니다.
    2. 총 CPM에서 비특이적 CPM을 빼서 특정 CPM을 계산합니다.
    3. 볼트 만 S 자형 함수를 비선형으로 적합 Tm을 계산. RT에서 낮은 특정 CPM (<WT의 10 %) 구축은 일반적으로 정확한 Tm은 값이 없습니다. 가장 내열성 구조에서 돌연변이는 함께 결합 및 열 안정성에 첨가제 증가에 대한 검사를 할 수 있습니다.

감염된 HEK293S GnTI에서 인간의 세로토닌 수송 체 (3) 식

  1. 플라스미드 1 NG 화학적 능력 DH10Bac 세포 변형.
    1. DH10Bac 세포의 50 μL를 추가 한 플라스미드를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
    2. 30 초 동안 42 ° C에서 열 충격 DH10Bac 세포. SOC 매체의 200 μL를 추가하고 진탕 4 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    3. 플레이트를 50㎍ / ㎖의 카나마이신, 7 μg의 / ㎖의 겐타 마이신, 10 μg의 / ㎖ 테트라 사이클린, 100 μg의가 / ㎖의 5- 브로 모 -3- 인돌 릴의 β-D-갈 락토을 함유하는 루리아 브로 쓰 (LB) 판에 세균 모두 및 40 μg의 / ㎖의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG).
  2. lacZ의 격리 - LB 아가 플레이트에서 2 일 동안 37 ℃에서 성장한 콜로니 (흰색 콜로니).
  3. LB 포함하는 항생제의 5 mL에 37 ° C에서 여러 식민지 O / N 성장과 bacmid DNA를 분리.
    1. 5 분 동안 원심 분리기에서 1,000 XG에서 박테리아를 스핀 다운. 폐기 뜨는. 미니 프렙 (R)의 200 μL에 재현 탁 박테리아esuspension 버퍼입니다.
    2. 미니 프렙 용해 완충액 200 μL를 첨가하고, 온화하게 10 배 튜브 반전를 Lyse 박테리아. 중화 버퍼 200 μL를 추가합니다.
    3. 원심 분리기에서 10 분 동안 14,000 XG에서 회전시켜 불용성 부분을 제거합니다. 20 분은 DNA를 침전 -20 ° C에서 뜨는하기 이소프로판올 및 진정의 1 ML을 추가합니다.
    4. 원심 분리기에서 15 분 동안 14,000 XG에 스핀과 상층 액을 버린다.
    5. 워시 DNA는 70 % EtOH로 펠릿을 15 분 동안 14,000 × g으로 다시 스핀. 폐기 뜨는. 모든 EtOH로까지 공기 건조 DNA 증발 및 물 50 μL에 재현 탁하고있다.
      주 : DNA Bacmid 즉시 최상의 결과 Sf9 세포 내로 형질되어야하지만 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  4. 형질은 6 잘 접시에 27 ° C에서 가습 실에서 재배 부착 인 Sf9의 1 × 6 세포로 DNA를 bacmid. 멸균 층류 후드 모든 세포 배양 조작을 수행한다.
      <리> 세포에서 미디어를 제거하고 신선한 인 Sf9 미디어의 2 mL를 넣어. 인 Sf9 미디어의 100 μL (용액 A)에 bacmid DNA의 5 μg의 추가.
    1. 인 Sf9 미디어의 100 μL (솔루션 B)에 양이온 성 지질 인 Sf9 형질 전환 시약의 8 μL를 추가합니다. 5 분간 용액 B를 함유하는 튜브를 부화.
    2. 용액 B와 튜브 함유 용액 A를 혼합하고 실온에서 30 분간 부화 및 Sf9 세포의 해결책 모두 추가.
    3. 0.2 μm의 필터를 통과하여 96 시간, 수확 뜨는 (P1 바이러스) 후. P1 바이러스는 어두운 곳에서 39 ° C에서 몇 달 동안 저장하고 필요에 따라 P2 바이러스하도록 재사용 될 수있다.
  5. 인 Sf9 배지에서 1 × 106 세포 / ㎖의 밀도로 Sf9 세포의 1 L에 100 μL P1 바이러스의 추가. 100 rpm에서 진탕 기에서 27 ° C로 증가하고, 96 시간 동안 세포를 감염.
  6. 15 분, 0.2 ㎛의 필터로 바이러스 입자를 함유하는 필터 상등액 4,000 XG에서 원심 분리기에서 세포를 스핀 다운. 세포 펠렛을 폐기하십시오. Determ바이러스 플라크 분석이나 바이러스 계수기를 사용하여 오프라인 바이러스 밀도. 바이러스 밀도가 밀리리터 당> 1 × 10 8 바이러스 입자이어야한다. P2 바이러스는 어두운 곳에서 39 ° C에서 저장 수개월에 사용될 수있다.
  7. 감염된 HEK293S GnTI의 10 L 감염 - 현탁액에서 성장하는 세포 (7)를 37 ° C에서 8 % CO 2 및 85 % 습도 쉐이커에 2 % FBS로 보충 된 293 발현 배지에서 130 rpm으로 감염 다중도 2의 (MOI)에서 및 / ㎖, 통상적으로 30 3 × 106 세포의 밀도 - 50 ㎖로 2 L의 셀 800 mL의 P2 바이러스는 플라스 당황.
    주 :이 감염된 HEK293S GnTI 때문에 P2 바이러스의 80 mL의 사용을 권장하지 않습니다 - 때문에 pH의 변화로 세포가 서서히 성장하고 생존이 불가능해질 수 있습니다. SF9 미디어는 293 표현 매체보다 더 산성이다.
  8. 12 - 감염 후 16 시간은 1 M 재고에서 10 mm의 농도에 나트륨 부티레이트를 추가합니다. 48-60 시간 후 감염, 원심 분리하여 수확 세포에서15 분 동안 4,000 XG. 뜨는을 제거합니다.
  9. TBS의 150 ㎖에 재현 탁 세포, 2 μM의 S의 시탈 로프 람 또는 다른 SERT 억제제 및 -80 ° C에서 저장 정제를위한 준비가 될 때까지.

예방 접종 및 결정화에 대한 세로토닌 운송업자의 4 선호도 정화

  1. 빠른 속도로 균질해질 때까지 10 mL를 피펫을 통해 전달하여 따뜻한 물 (약 30 ° C) 및 재현 탁 문화의 10 L에서 세포를 해동.
  2. 80 mM 트리스, pH가 8, 40 mM의 C12M, 5 mM의 CHS을 포함 150 mM의 염화나트륨 및 프로테아제 억제제 칵테일 : 가용화 (150 ㎖)에 대한 세제 용액을 준비합니다.
  3. 교반 막대가있는 비커에 모든 셀을 추가하고, 교반하면서 세포에 세제 용액의 전부를 추가한다. 교반하면서 1 시간 동안 4 ℃에서 용해.
  4. 4 ℃에서 15 분 동안 8,000 XG에 해물 스핀. 깨끗한 초원 심 분리기 튜브에 펠릿 및 캔트 상층 액을 버린다. ultracent에서 1 시간 동안 100,000 XG에 스핀rifuge. 0.2 μm의 필터를 통해 펠렛 및 필터 상층 액을 버린다.
  5. 세척 완충액으로 평형화 연동 펌프를 사용하여 칼럼에 충전 10 ㎖ 스트렙토의 친 화성 수지 위에 해물 합격 : 1 mM의 C12M 0.2 mM의 CHS, 5 % 글리세롤, 25 μM 지질 (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero- 1의 몰비로 -3- 포스 포 콜린, 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine, 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoglycerol : 1 : 1) (1) μM S 시탈 로프 람 또는 TBS에서 SSRI.
  6. 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 시스템에 연쇄상 구균 친 화성 컬럼 연결 및 세척 버퍼의 66 ㎖ (6.6 열 볼륨) 2 mL / 분에서 열을 씻는다. 같은 버퍼에 용출 정제 된 단백질은 버퍼의 33 ㎖ (3.3 열 볼륨)를 사용하여 0.5 mL / 분에서 desthiobiotin 5 mM의 보충. 1 ML의 분수를 수집; 피크 분획 ~ 10 ㎖ 될 것입니다. 원하는 경우 3 일 - 정제 된 단백질은 2 4 ℃에서 저장 될 수있다.
    참고 : 총 수율이 3이 될 것이다 -SERT의 CC 4 mg의 및 SERT IC의 1 mg의. 280 nm에서이 AU의 흡광도를 1 ㎎ / ㎖ SERT 같다.

예방 접종에 대한 리포좀에 수송기의 5에서 재구성

  1. 콜레스테롤 : asolectin 포함 된 리포좀을 준비 지질 A를 : 뇌 극성 지질 (몰비 60 : 17 : 3 : 20). 클로로포름 1 ㎖의 지질을 용해 표시된 몰비 100 mL 유리 둥근 바닥 플라스크에 총 지질의 40 mg을 추가합니다.
    1. 둥근 바닥 플라스크에 약, 따뜻한 물에 30 ° C를 회전 진공에서 최소 1 시간 동안 클로로포름을 증발.
    2. TBS의 10 ㎖를 첨가하여 지질 재수. 10 분 동안 인큐베이션 완충액.
    3. 액체 N 2에 플라스크를 놓고 지질 동결.
    4. 해동. 따뜻한 물이 가득 비커에 약 30 ° C를 플라스크의 구형 바닥을 담가. 5 분 동안 목욕 초음파기에서 초음파 처리.
    5. 소용돌이 반복 단계 5.1.3 - 5.1.4 10 배 지질 때까지완전히 바닥에서 재현 탁시키고, 흐린 현탁액을 형성한다.
    6. 200 nm의 필터를 통해 회 전체 지질 혼합물 돌출. 지질은 압출 전에 우유 서스펜션으로 표시됩니다; 이후 그것은 반투명됩니다. 이 막힐 수있는 시료의 손실이 발생, 한 번 압출기에 전체 지질 혼합물을 추가하지 마십시오.
    7. 40 ㎎ / ㎖의 농도로 1 ㎖ TBS - 0.5에 재현 탁하고, 20 분 100,000 XG에서 지질 스핀.
  2. 2 100 kDa의 MWCO 원심 분리기 단백질 집중을 사용하여 500 μL - - 250 정제 SERT IC를 집중 4 ㎎ / ㎖, 5 mM의 C12M와 리포좀을 포화. 세제로 정제 SERT을 추가 지질 혼합물을 1 mL의 최종 부피에.
  3. 80 ㎎ / ㎖ 소수성 흡수성 수지의 3 연속 추가로 C12M를 제거합니다. 제 2 가산 들어, 4 ℃에서 2 시간 동안 회전 수지 배양한다. 유리 섬유를 통과하여 수지를 제거합니다. 수지를 최종 인큐베이션을 수행밤새.
  4. 20 분 동안 100,000 XG에서 원심 분리하여 테오을 집중한다. TBS의 500 μL - 250에 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기하십시오.
  5. 수지의 최종 제거 다음 재구성 된 단백질 S의 시탈 로프 람의 10 μm의 최종 농도를 추가합니다.
  6. SDS-PAGE 로딩 버퍼 (62.5 mM 트리스, 산도 6.8, 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 0.01 % 브로 모 페놀 블루, 100 mM의 DTT)의 테오의 2.5 μL를 용해 1 200 V에서 SDS-PAGE 젤에서 실행 그 SERT을 보장하기 위해 H 성공적으로 재구성되었다. 테오는 장기간의 분취 량에서 -80 ° C에 보관 각각 접종 전에 얼음 위에서 해동 할 수있다.

3D 에피토프를 인식하는 항체 6. 심사

  1. 웨스턴 블롯에 의해 스크린의 하이 브리 도마 세포주. 웨스턴 블롯에 의해 SERT을 인식 항체 가능성이 선형 에피토프를 결합 가능성 구조 연구에 유용하지 않습니다.
    1. purifi 1 μg의 혼합ED SERT 또는 IC SERT의 CC 및 (4)에 실행 - 한 시간 동안 200 V에서 15 % SDS-PAGE 겔.
    2. Towbin 버퍼를 사용하여 30 분 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 20 % (v / v)의 메탄올, 0.1 % SDS)을 위해 200mA에서 니트로 셀룰로오스 막에 전송합니다. 멤브레인을 건조시키고, 실온에서 무한히 저장 될 수있다.
    3. 습윤 10 % 메탄올로 막하고 PBS로 세척한다 (10 mM의 인산염 pH 7.4의 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을).
    4. RT에서 30 분 동안 PBS 중 5 % 분유로 차단.
    5. PBS로 세척하고 0.1 %의 우유와 PBS에서 항체의 1 μg의 / mL로 품어.
    6. PBS는 0.1 %를 트윈 (20)를 포함하여 광범위하게 씻으십시오.
    7. 0.1 % 트윈 20, 0.1 %의 우유를 PBS로 10,000 : 적외선 염료에 접합 된 염소 항 - 마우스 항체로 인큐베이션 1 희석.
    8. 광범위하게 세척 및 이미징 시스템을 사용하여 스캔.
  2. (SER 2 : 1의 몰비를 사용하여 100 nm의 SERT의 CC 단백질 웨스턴 제외 항체를 함유하는 하이 브리 도마 상등액 믹스T : 1 mM의 C12M, 0.2 mM의 CHS, 1 μM의 S의 시탈 로프 람 200 μL TBS에서 단클론 항체). 20 분 동안 100,000 XG에 원심 분리기. SERT - 단클론 항체 복합체를 포함하는 상층 액을 분석하고 형광 검출 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC) (8)에 의해 분석한다. 펠렛을 폐기하십시오.
    1. TBS 0.4 밀리미터를 포함하는 실행 완충액을 사용하여 (510 내지 : 480 nm의 방출 여진) 형광 검출기를 장착 한 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 시스템을 이용하여 0.5 mL / 분에서 크기 배제 칼럼에 상청액 100 μL를 실행 우릴 말토오스 네오 펜틸 글리콜, 1 μM의 S의 시탈 로프 람. 복합체를 형성 항체는 GFP 융합 단백질이 크기 제외 열에서 무료로 수송 이전 용출하게됩니다.
    2. 1 mM의 C12M 200 μL TBS에서 10, 1, 0.1 nm의, 0.2 mM의 CHS, 1 μM의 S의 시탈 로프 람 다시 실행 FSEC에 단지를 희석. 여전히 낮은 나노 몰 농도의 수송 피크를 전환 할 수 있습니다 항체는선호도가 높은 바인더 및 구조 연구를위한 좋은 후보.
  3. 1 mM의 세로토닌의 존재 FSEC에 의해 바인딩을 다시 테스트합니다. 특히 SSRI 결합 형태를 인식하는 항체는 기판의 존재에 결합하지 않을 것이다. 입체 구조의 결과로서 변경되지 않는 3D 에피토프를 인식하는 항체에 관계없이 존재하는 리간드에 결합한다.
  4. 항체의 페어의 서로 다른 조합을 혼합하고 FSEC에 의해 결합 테스트합니다. 별개의 에피토프를 인식하는 항체는 단일 항체의 결합에 비해 함께 결합 될 때 SERT 이전 용출 원인이됩니다.
  5. 초기 구조 연구를 들면, 3D 에피토프를 인식하고 가장 높은 친 화성 항체를 선택합니다.

Sf9 세포에서 항체 조각 7. 식

  1. 표준 프로토콜을 사용하여 Sf9 세포에서 발현을위한 곤충 발현 시스템으로 PCR에 의한 팹의 복제 변수와 상수 도메인.
  2. 형질 1 × 1(3.4 절에 따라)는 GP67 분비 서열과 8 그의 태그 8B6 팹의 경쇄 및 중쇄를 인코딩 Bacmid DNA의 5 μg의와 공 6 Sf9 세포.
  3. 수확 P1 바이러스 96 시간 posttransfection 및 P2 바이러스를 만드는 2 L 플라스크에 1 × 106 세포 / ㎖의 밀도로 Sf9 세포의 1 L에 P1 바이러스의 500 μL를 추가한다. 27 ° C에서 96 시간 동안 세포를 감염.
  4. 수확 P2 바이러스 (3.6 절에 따라).
  5. 각각의 2 L 플라스크에 Sf9 세포의 1 L 플라스크 당 50 ㎖ - P2 바이러스 통상 40 (2)의 MOI 3 × 106 세포 / ㎖ - 2의 밀도로 Sf9 세포의 6 L 감염.
  6. 수확 세포 약 96 시간 postinfection. 20 분 동안 4,000 XG에서 세포 스핀 50 mM의 최종 농도로 인산 완충액, pH가 8을 50 mL를 넣고. 0.2 μm의 필터 접선 흐름 세포를 통해 세포 펠렛 및 필터 상층 액을 버린다. 원하는 경우 3 일 - 2 4 ℃에서 뜨는 및 저장소를 수집합니다.

  1. 800 mL의 - 약 400에 30 kDa의 분자량 컷 오프 (MWCO) 접선 흐름 세포를 사용하여 인 Sf9 상층 액을 집중한다.
  2. 10 mM의 그의 태그 친 화성 수지의 10 ㎖의 최종 농도 이미 다졸, pH가 8을 추가합니다. 4 ℃에서 1 시간 동안 비커에 약동하십시오.
  3. 5 분 2,000 XG에서 원심 분리하여 그의 태그 친 화성 수지를 수집합니다. 폐기 뜨는.
  4. 컬럼에 그의 태그 친 화성 수지를 포장하고 FPLC에 연결합니다.
  5. 50 mM의 인산의 pH 8, 150 mM의 염화나트륨, 25 mM의 이미 다졸 66 ㎖ (6.6 열 볼륨) 2 mL / 분에서 그의 태그 친 화성 수지를 씻으십시오.
  6. 50 mM의 인산의 pH 8, 150 mM의 NaCl을, 250 mM의 이미 다졸 33 ㎖의 용출 8B6 팹. 1 ML의 분수를 수집합니다.
  7. 빙냉 20mM의 ​​아세트산의 pH 5로 10 배 용량의 정제 된 Fab 친화력 희석.
  8. 1 mL / 분에서 연동 펌프를 사용하여 1 mL의 양이온 교환 컬럼에 팹을 결합한다.
  9. 30 mL의 린을 사용하여 별도의 팹FPLC를 사용하는 20 mM 아세트산의 pH 5.5 - (500 밀리미터 0) 염화나트륨의 귀 기울기. 팹 ~ 300 mM의 NaCl을에서 단일 피크로 용출된다.
  10. 100 mM의 DTT를 함유하는 시료 완충액을 사용하여 12.5 % SDS-PAGE 겔상에서 분석한다. 8B6 팹의 중쇄 및 경쇄는 감소 SDS-PAGE 겔에 각각 27 및 25 kDa의 실행됩니다.
  11. 3,000 × g으로 스윙 버킷 원심 분리기에서 30 kDa의 단백질 MWCO 농축기를 사용하여 15 ㎎ / ㎖ - 팹 함유 분획을 풀과 적어도 10 농축시킨다.
  12. 4 ° C에서 장기 팹 정제 최종 50 mm의 농도와 저장소에 1 M 트리스 산도 (8)을 첨가하여 pH를 8로 조정합니다. 30 mg의 - 총 수율은 25 것이다. 280 nm에서 1.4 AU의 흡광도를 1 밀리그램 / 8B6 팹 ㎖의 동일하다.

크기 배제 크로마토 그래피에 의한 수송기 항체 착물 형성 제의 분리

  1. 이전 (4 절)에 설명 된 바와 같이 결정화를 들어, C12M에서 패 혈성 친 화성 크로마토 그래피에 의해 SERT의 CC를 정화.
  2. (1)의 몰비 팹 농축 SERT 믹스 : 1.2 500 μL 미만의 부피. 20 분 동안 4 ° C에서 10 만 XG에 원심 분리기. SERT 팹 복합체를 포함하는 상층 액을 수집합니다. 취소 펠렛.
  3. TBS에서 평형화 크기 배제 칼럼 상에 FPLC를 이용하여 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)에 의한 분리는 n- 옥틸 β-D-말토 40 밀리미터 (C8M), 0.5 mM의 CHS, 5 % 글리세롤, 25 μM 지질 (동일 보충 단계 4.5), 0.5 mL / 분에서 1 μM의 S의 시탈 로프 람있다.
  4. 0.5 ML의 분수를 수집하고 4 분석 - 15 % SDS-PAGE 젤뿐만 아니라 삼성 전자 트립토판 형광에 의해. GFP는 SERT는 SDS-PAGE 젤에 약 80 kDa의를 실행합니다 태그. 말단의 제거 및 N 연결 당 후에는 45 kDa 단백질로 실행됩니다.
  5. DETE분수 트립토판 형광 SEC에 의해 분수의 분석에 의해 판단으로 단 분산 만 분수 풀링에 의해 결합하는 rmine (인가 전압을 : 280, 방출 : 335 ㎚).
  6. 쇼핑몰까지 1 주일 동안 4 ° C에서 SERT-8B6 복합체를 정제 하였다.

드롭을 교수형에 의해 수송기 항체 단지의 10 결정화

  1. 결정에 앞서, 100 kDa의 MWCO 원심 분리기 단백질 집중을 사용하여 2 ㎎ / ㎖로 SERT-8B6 복합체의 SEC 분리에서 피크 분수를 집중한다. 280 nm에서이 AU의 흡광도를 1 ㎎ / ㎖와 동일하다.
  2. 1의 비율로 추가 팹 추가 : 0.05 복잡한 : 무료 팹을. 10 μM 무료 S의 시탈 로프 람을 추가합니다.
  3. 20 분 동안 4 ° C에서 10 만 XG에 원심 분리기. SERT 팹 복합체를 포함하는 상층 액을 수집합니다. 취소 펠렛.
  4. 표 1에 따라 4 ° C에서 매달려 드롭 24 잘 화면을 설정합니다. 저장 솔루션을 통해 회절 품질 결정을 성장125 mM의 KCl을 32.5 - - 34 % PEG 400, 0.5 %, 6- 아미노 헥산 산 100 mM 트리스 - 수산화 나트륨, pH가 8.5, (25)을 포함.
    참고 : 버퍼로 pH를 8.5로 NaOH로 조정을 사용 트리스. HCl로 조정 트리스베이스를 사용하지 마십시오. 화면 2 ㎖의 튜브에 준비 완료 될 때까지 사용될 수있다. 정확하게는 매우 점성으로 긍정적 인 변위 피펫을 사용하여 PEG (400) 피펫주의하십시오!
    1. 각 웰에 적용 실란트와 로우 프로파일 24 웰 플레이트의 각 저장 솔루션의 피펫 500 μL. 피펫 1.5, 1.75, 및 18mm 실리콘 처리 된 유리 커버 슬립 상 SERT-8B6 복합체의 2 μL. 단백질 시료의 상단에 저장 솔루션의 피펫 1 μL.
      참고 : 판은 이미 우물의 가장자리에 적용 밀봉으로 구입했다.
    2. 저장 솔루션 직면 한 방울과 24 웰에 커버 슬라이드를 적용하고 밀봉이 잘 각각에 미리 적용에 커버 슬립을 눌러 즉시 밀봉.
    3. 모든 24 우물이 설정 될 때까지 계속합니다. 4 ℃에서 잘 절연 방에 완성 된 접시를 남겨주세요. 최소 3 일 동안 접시를 방해하지 마십시오
      참고 : 단일 결정이 약 3 일 내에 표시, 14 일 후 100-175 μm의 성장할 것입니다.
  5. 수확 cryoloops에서 결정 전에 X 선 회절 데이터 수집에 액체 N 2에 직접 플래시 멋진.
  6. 필요한 경우, 매달려 방울과 폭 넓은 심사에 의해 추가로 결정화 조건을 찾을 수 있습니다. 이 침전제의 비율 : 1, 1.5 : 1, 1 : 단백질 세 방울을 사용 하나. 로봇을 사용할 경우, 100 ~ 150 거리 nL 96 웰 플레이트에 저장 솔루션의 70 μL 방울을 설정합니다. 큰 차원 결정을 24 웰에서 배양 할 수있다.
  7. 드롭의 모양에 따라 점수 : 0, 분명; 1, 먼지; 2, 세분화 된 침전물; 3 상 분리; 4, 미세; 5, 바늘; 6, 접시; 7 3D 결정.
  8. 새로 확인 된 콘드 주위 상술 한 바와 같이 24 우물에 드롭 방법을 매달아 결정화를 설정itions.

Representative Results

SERT TC 배경에 하나의 점 돌연변이의 라이브러리는 돌연변이를 thermostabilizing위한 화면으로 만들어졌습니다. 각각의 돌연변이 체는 표준 돌연변이 유발을 이용하여 생성 하였다. 그림 1A에 설명 된대로 선별 프로토콜은 일시적으로 빠르게 정체성 결정에 유용한 돌연변이에 감염된 HEK293S 세포와 섬광 근접 기반의 열 안정성 화면을 형질 사용한다. 플로팅 Tm은 값을 바운드 [3 H] RT에서 시탈 로프 람은 높은 열 안정성과 표현 수준에 적합한에게와 구조를 보여준다 대 단백질 정제 용 (그림 1B). 세 돌연변이 (Y110A, I291A 및 T439S)은 매우 안정한 구조체 (도 1C)를 생성하기 위해 결합시켰다. 내열성도 SERT 팹 복합체의 결정화에 필요한 단쇄 세제 증가 된 안정성과 관련된다.

배큘-TR을 사용하여 SERT 인간의 대규모 발현ansduced 감염된 HEK293S GnTI는 - 세포는 2 주 미만 걸릴 수 있으며,도 2a에 도시 된 바와 같이, 밀리그램 양을 생산할 수있다. GFP의-태그 SERT의 CC 단백질의 사용은 SERT 편리 형광 (그림 2B)에 의해 발현 및 정제하는 동안 다음에 할 수 있습니다. ; 안정화 지질 등 CHS의 존재 C12M 셀 - 우리의 정제 전략은 1) 감염된 HEK293S GnTI에서 S의 시탈 로프 람에 결합 SERT의 가용화를 포함 2) 연쇄상 구균 친 화성 기질에 SERT의 결합; 광범위한 세정하여 오염 단백질 3) 제거; 4) 버퍼 포함 desthiobiotin (그림 2C)와 기능 SERT의 용출. FSEC (그림 2D, E)에 의해 판단으로 용출 된 단백질은 크게 쿠마 블루 염색에 의해 다른 검출 가능한 단백질의 자유 단 분산이다.

유사한 전략 reconstitutio에 사용 된 연쇄상 구균 II 태그 SERT를 정화 찍은n 및 예방 접종 (그림 3A, B). 테오으로 SERT의 설립은 SERT의 혈청 반감기과 안정성을 향상 높은 친 화성 항체의 분리 가능성을 향상시킨다. 또한, 지질 A의 포함은 세균 세포벽의 성분은 유력한 보조제 구로서 기능한다. 다중 층 리포좀 유리 튜브에 건조 된 지질의 혼합물에 완충액을 첨가하여 제조하고, 완충액에 재현 탁 하였다. 200 nm의 공극 크기의 필터를 통해 리포좀 압출 단 분산 단층 라멜라 리포좀 현탁액을 생성한다. 리포좀이어서 세제 정제 SERT 첨가 한 후 세제로 포화된다. 세제 액 : 마지막으로, 세제 지질 소수성 흡착 수지의 첨가에 의해 제거된다. 추가 리간드는 항우울제 결합 된 형태를 인식하는 항체를 선택하기 위해 재구성 된 샘플에 추가해야합니다. 테오 SERT에서의 존재가 확인되어야SDS-PAGE 로딩 염료 또는 C12M와 작은 샘플을 용해 및 SDS-PAGE 및 FSEC (그림 3C, D)에서 실행.

SERT 항체를 발현하는 하이 브리 도마 세포주는 3D 에피토프를 인식 고친 화성 바인더에 대해 스크리닝 할 수있다. 항체가 완전히 균일 한, 잘 정렬 된 도메인의 크리스탈 포장을 촉진하기 위해 구조화 된 영역에 결합되어 있어야 이러한 특성은 결정의 궁극적 인 성공에 매우 중요하다. 첫 번째 단계에서는, 비 구조화 영역을 인식하는 항체가 식별된다. SERT 변성하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏; 변성 SERT을 결합하는 항체는 서쪽 긍정적 가능성 선형 에피토프를 인식합니다. 도 4a에서, 우리는 서부 양성 및 crystallogenesis을 촉진 할 가능성이 유용하지 않습니다 항체의 2 예를 보여줍니다. 도 4b에서, 나머지 웨스턴 음성 항체가 100 nM의 SERT-GFP와 인큐베이션에 의해 구분FSEC. SERT가 이전 위치로 GFP 양성 피크를 이동합니다 결합하는 항체. SERT - 항체 복합체가 FSEC에 의해 분석 한 다음 나노 몰 친화력으로 결합 할 수 있는지 확인하기 위해 추가로 세제를 희석 할 수있다. 구조적 운반체 변화하므로 항체 세로토닌 결과의 첨가가 특히 SSRI 바인딩 형태를 인식 할 수 있는지 확인 rescreened 수있다. 도 4C에서, 상기 항체는 항원 (S)이 결합 된 상태로 기판에 SSRI로 변경하지 않는 것이 도시 세로토닌의 존재 SERT 바인딩 나타낸다. 마지막으로,도 4d에 항체의 조합은 상기 좌측 시프트의 결과로, 고유의 에피토프에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 다음은 15B8 또는 8A11 항체 8B6 다른 에피토프를 인식하고 있습니다.

8B6 항체를 파파인 누와 예비 결정 심사에 따라 추가 구조 분석을 위해 선택되었다테드 팹. 8B6 팹의 유전자를 곤충 세포 발현 벡터에 클로닝 하였다. 팹 표현 및 정지에서 성장 Sf9 세포에서 분비 될 수있다. 8B6 팹은 그의 태그 친 화성 (그림 5A, B) 및 SDS-PAGE 젤에 오염 물질이 나타납니다 단백질의 결과 양이온 교환 크로마토 그래피 (그림 5C, D)에 의해 인 Sf9 세포 상층 액에서 정제 할 수있다. 도 5E에서, 재조합 8B6 팹은 SERT 바인딩 도시되고 후속 생화학 및 생물 물리학 실험에 사용된다.

친화도 정제 SERT의 CC는 트롬빈과 EndoH로 분해 및 S의 시탈 로프 람의 존재 복합체를 형성 8B6 팹와 혼합된다. 운반체 - 항체 복합체는 C8M (도 6A)에 SEC에 의해 분리하고 SDS-PAGE (도 6b)로 도시 된 바와 같이 피크 분획 SERT 팹을 모두 포함한다. C8M의 사용은 결정 형성 아마 때문에 매우 중요하다단쇄 세제는 결정 격자에서 분자간 잘 포장 할 수있다. FSEC 결정화를위한 풀링되어야하는 분획을 확인하기 위해 사용된다 (도 6c); 단 분산되지 않고 / 또는 자유 SERT 또는 팹의 많은 양을 함유하는 분획을 결합되어서는 안된다.

프리즘 형상 SERT 항체 결정 드롭 증기 확산 (도 7A)를 매달아이 프로토콜을 이용하여 S의 시탈 로프 람의 존재 하에서 성장시킬 수있다. 생성 된 결정을 3.15 10 (도 7b)의 해상도에 X 선을 회절.

그림 1
그림 1 :. 섬광 열 안정성 분석을 근접 기반. [3 H] 시탈 로프 람. B의 존재 내열성 스크리닝 프로토콜의 개요. 최대 바인딩 [3 (Tm)이 대 SUP> H] 시탈 로프 람. 점선은 WT 수송에 대한 값을 나타냅니다. 3 가장 내열성 돌연변이가 표시되어 있습니다. 회색 영역은 낮아 신호대. WT C에 따라서 Tm은 부정확 한 값에 대하여 결합 [3 H] 시탈 로프 람의 10 % 미만이 돌연변이 체를 나타낸다. WT SERT TC 및 상위 3 돌연변이에 대한 열 안정성 곡선. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 포유 동물 이종 단백질 식 (A)의 개요. 감염된 HEK293S GnTI에서 BacMam 바이러스 발생 및 SERT의 표현의 도식화 개요 -. 세포 B. 그K293S GnTI -. SERT의 CC (GFP의 형광) C를 발현하는 세포. 패 혈성 친 화성 수지에 SERT의 CC의 용출 프로파일. 100 % (0 - - 5 mM)을 D. 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 15 % SDS-PAGE 젤 E -. 4에 친 화성 정제 SERT의 CC의 분석. GFP의 형광 검출 친 화성 정제 SERT의 CC의 FSEC (여진 : 480 nm의, 방출 : 510 ㎚). 15 mL의에서 용출 피크는 SERT (#)이며, 18 mL의 무료 GFP (*)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. SERT IC (A)의 대표 선호도 정화와에서 재구성. 항체 생성의 도식 개요. <강한> B. 용출 프로파일은 패 혈성 친 화성 수지에 SERT IC의 친화력 정화의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 5 mM)을 C 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 친화도 분석 정제와 4 SERT를 재구성 - 15 % SDS-PAGE 겔 D.. 재구성 다음 가용화 SERT의 FSEC. 트립토판 잔기의 형광 SERT (: 280 nm의, 방출 : 여진 335 nm의)를 감지하는 데 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 대표 SERT 항체 분석를했다. 웨스턴 블롯에 의한 항체 검사. 약 1 μg의 GFP 유무에 관계없이 SERT의 CC의는 4인가 - 15 % SDS-PAGE 겔 및 니트로 셀룰로오스 막 상에 블 롯팅. 바인딩은 IR 염료에 접합 된 염소 항 - 마우스 항체를 사용하여 검출 하였다. 2G4 및 10F2 서부 긍정적. B입니다. FSEC 100 나노 GFP - 태그 SERT 및 검출에 대한 항체의 결합 GFP의 형광을 이용하여 검출. C를. 1 mM의 세로토닌. D의 존재에서 100 나노 미터 GFP - 태그 SERT에 선정 된 Fab의 결합. 8A11 또는 15B8 팹의 바인딩 르트-8B6하는 팹을. 18 mL의에서 용출 작은 피크가 무료 GFP입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : Sf9 세포에서 8B6 팹의 대표적인 정제를했다.. 용출 프로파일은 그의 태그 친 화성 chromatograp하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰 HY. 50 % (0 - - 250 밀리미터) B. 녹색 추적은 이미 다졸의 농도, 0을 나타냅니다. 비 감소 및 그의 태그 친 화성 정제 한 후 SDS-PAGE 젤을 줄일 수있다. 50 kDa의 단백질 근처 실행 비 환원 팹 (#)와 kDa의 팹 (*). C를 감소 부 25 종이다. 용출 프로파일은 선형 염화나트륨 구배 용출 하에서 단일 대칭 피크를 표시 양이온 교환하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 500 밀리미터) D 녹색 추적 염화나트륨의 농도, 0을 나타냅니다. 양이온 교환. E 그래피 다음 12.5 % SDS-PAGE 겔상의 8B6 된 Fab의 분석. GFP의 형광을 이용하여 검출, 10 나노 GFP - 태그 SERT에 8B6 팹의 결합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6 :. 임재 S의 시탈 로프 람 A의 SERT-8B6 단지의 대표 젤 여과 크로마토 그래피. 정제 SERT-8B6 단지의 젤 여과 용출 프로파일. 11.5 용액에 용출 주 피크는 SERT-8B6의 복잡합니다. 15에서 피크 -. 17 mL를 GFP 및 팹 B가 포함되어 있습니다. 15 % SDS-PAGE 젤 - 4에 정제 된 SERT-8B6 복합체의 분석. SERT 및 팹의 중쇄 및 경쇄의 위치는 대시. C에 의해 도시된다. 크기 구분 분수의 FSEC. SERT-8B6 단지는 트립토판 형광을 사용하여 검출 하였다. 분수 (17)는 팹으로 복잡하지 않았다 SERT의 더 큰 금액이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7 그림 7 :. S 시탈 로프 람 (A)에 바운드 SERT-8B6 단지의 결정화. 성장 2 주 후 SERT-8B6 단지의 평행 모양의 결정의 광학 현미경. 스케일 바는 200 μm의. B와 동일합니다. SERT-8B6 결정은 3.15 Å으로 X 선을 회절. 블루 링은 3.15 Å를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 :. S의 시탈 로프 람에 바인딩 SERT-8B6 단지에 대한 결정화 화면 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

생물 리 학적 기술에 의해 세포막 단백질 구조의 결정은 많은 심각한 의학적 수송 수용체 및 채널 (11) 발굴 사업 남아있다. 여기에서 우리는 S의 시탈 로프 람 바인딩 인간의 세로토닌 수송 체의 구조 결정을 위해 개발 된 상세한 전문 지식을 공유 할 수 있습니다. 우리는 이러한 방법은 다른 구조적 상태뿐만 아니라 다른 어려운 막 단백질의 구조에 SERT의 구조를 결정하기 유용 할 것으로 기대. 또한, 여기에 설명 된 기술들은 생화학 세제 정제 SERT 및 가까운 천연 지질 환경의 기능을 연구하는데 사용될 수있다.

SERT 결정화 여러 도구와 방법의 개발에 힌지. 첫째, 수송 열 안정성 개선은 막 6에서 수송의 추출 다음과 같은 다양한 세제 미셀에 잘 행동했다 SERT의 변종을 생산했다. 둘째, 사용정제 및 결정화에 걸쳐 높은 친 화성 리간드 S의 시탈 로프 람 더욱 향상된 안정성 및 감소 된 구조적 이질성. 셋째, 접종 결정화 양을 용이하게 이주 단기간에 SERT 대량 생산에 허용 BacMam 발현 시스템 (7)의 발전. 마지막으로, 전략의 개발이 결정에 SERT - 항체 복합체의 잘 정렬 된 포장을 촉진 8B6 항체의 발견 허용 3D 에피토프를 인식 높은 친 화성 항체를 선택합니다.

종종 프로토콜에 걸쳐 발생할 중요한 단계 및 시약뿐만 아니라 공통의 문제점이있다. 먼저, 높은 역가 SERT P2 바이러스의 발생이 문제가 될 수있다. 이 프로토콜에 기재된 P2 바이러스를 생성 P1 바이러스의 낮은 농도를 추가하는 것은 일반적으로 이러한 문제를 완화하고, P2 바이러스 역가가 낮은 경우에, P3 바이러스 날기하게 할 수있다0.0001의 MOI에서 g 바이러스. 1 × 10 8 바이러스 입자 미만의 역가와 바이러스 / mL를 사용할 수 없습니다 거의 항상 낮은 단백질 수율가 발생합니다. 표현의 경우, 감염된 HEK293S GnTI은 - 그들은 N 복잡한 N의 -glycans를 합성 할 수 없습니다, 따라서 내가 활동을 -acetylglucosaminyltransferase 및 부족하기 때문에 세포 대신 만 높은 만노스의 N의 -glycans 생산, 선택되었다. EndoH의 절단은 N은 아스파라긴에 부착 된 N의 -acetylglucosamine을 떠나, 세포 외 루프 2 (EL2)의 두 사이트에서 높은 만노스 글리 칸의 글리코 실화를 -linked. N의 소화는 설탕이 결정화 가능성이 중요하다 EL2의 표면 엔트로피를 감소 -linked. 항체의 생성을 위해 상기 IC SERT 예방 접종에 사용되어야한다. GFP 12 고도로 면역 원성이고 완전히 SEC에 의해 제거하는 것이 곤란하기 때문에 항체를 생성하는 융합 태그로서 사용되어서는 안된다. SERT의가요 N- 및 C- 말단은 없었다이들 영역에 대한 항체를 방지하기 위해 구조물에 포함. 마우스는 재구성 된 단백질의 30 μg의와 예방 접종을 할 수있다; 항체의 높은 혈청 농도를 검출 할 수있을 때까지 면역화 된 마우스를 계속 설명 (13) 하이 브리 도마 세포를 생성한다. thermostabilized 구조는 일반적으로 예방 접종을위한 최선의 선택; 반송 장치가 바르게 행동이며, 정제 다음의 생물학적 활성을 유지한다면, 이것은 종종 항체를 발생하기에 충분하다. 8B6 항체는 WT SERT에 대해 제기되었다. 결정화, FSEC 판단으로 단 분산 복합체를 함유 SEC 만 피크 분획을 합치고 농축한다. SERT-8B6 결정은 조건의 좁은 범위에서 성장하고 구체적으로 SERT의 결정 성장과 관련된 문제를 해결하기 위해주의해야 단계가 있습니다. HCl로 조정 트리스 염기의 버퍼가 결정 성장을 지원하지 않기 때문에, 저류 액에 사용되어서는 안된다; 그것은 따라서 CRI입니다광 케이블 (optical) 대신 NaOH로 조정 트리스를 사용합니다. 결정이 성장하지 않거나 많은 작은 결정이 관찰되면, PEG 400 농도도 작은 증감이 의뢰 될 것인지 결정하도록 SERT은 PEG 400의 좁은 농도 범위로 성장한다. 또한, 첨가제 -6- 아미노 헥산 산 또한 핵을 향상시키기 위해 최적화 된 스크린에 사용되었다. 단백질의 감소 비율 : 웰 용액은 결정 성장 인자를 결정하는 핵심이다. 일반적으로 큰 3 차원 결정의 성장을 지원하는 1 : 2에 가까운 드롭 비율로, 권장 1 : 2-1.5의 비율을 삭제합니다. 마지막으로, 낮은 프로파일 24- 웰 플레이트의 사용은 아마도 때문에 증기의 확산 속도 수정을 또한 결정 성장 방향으로 중요하다.

인민 방법으로 다른 방법이 시험 5를 결합하는 필터를 사용하여 코카인 - 결합 된 형태로 래트 세로토닌 전달체를 안정화 변이체 스크리닝하기 위해 개발되었다. 대조적으로, SPA 바SED 분석은 리간드에 결합 남아 SERT의 비율의 결정에 의해 다음과 같은 순서 가열 단계 수 있습니다. 따라서,이 샘플의 소수의 용융 온도의 신속한 측정을 허용한다. 스파 방법은 방사성 표지 높은 친 화성 리간드의 가용성에 의존하고 더 리간드가 submicromolar 선호도와 결합되는 알려져 있지 않은 경우 다음 다른 방법이 필요합니다. 많은 다른 방법이 일반적으로 형광 염료 및 열량 (14)의 결합으로 단백질 안정성을 측정하는 데 사용되어 있지만 낮은 처리량을 직접 측정 기능 또는 단백질을 다량 필요로하거나없는된다. SPA에 법을 사용할 수없는 경우, 하나의 대안 높은 처리량 방법은 샘플을 수송 잔여 분획을 분리 하였다 가열 FSEC 계 열 안정성 분석 15 (FSEC-TS)이다. FSEC-TS는 크로마토 동작 및 올리고머 상태에 액세스하기위한 유용한 방법이며 AP 인인민 방법과 함께 사용할 수 있습니다 owerful 보완적인 도구입니다.

다양한 일반적인 단백질 발현 시스템의 비교도 SERT 식 (16)에 대한 포유 동물 세포의 사용을 선호하는 것으로하고, 당연히이 가능성 포유류 기원의 다양한 단백질에 대한 경우이다. 우리는 표현을 위해 사용한 방법은 SERT에 맞게 조정하지만 가능성이 쉽게 적응할 수있다. 발현의 높은 수준을 선호하는 조건은 신중 나트륨 부티레이트 히스톤 데 아세틸 라제 억제제의 발현 온도 바이러스 농도, 및 현재의 시간 변화에 의해 식별되어야한다.

우리는 일반적으로 이전 바인딩 높은 친 화성 리간드를 유지하기 위해 재구성하는 CHS와 함께 같은 C12M 같은 가벼운 긴 사슬 세제의 선호도 정화를 선호. 소수성 흡수를 사용하여 재구성은 우리가 여러 가지 다른 운송 및 수용체에 대한 효과적인 것으로 나타났습니다 가벼운 기술이다. 이 경우투석, 희석, 또는 SEC에 의해 높은 임계 미셀 농도 세제의 제거 (17)가 항원은 세제 충분히 안정 제공 성공적으로 이용 될 수 없습니다. 더 적합한 항체가 발견되지 않는 경우에, 우리는 거의 항상 문제가 기능 또는 항원의 변성의 손실에 기인하며 이러한 경우 우리가 성공적으로 단백질의 생화학에 특별한주의를 지불하는 새로운 예방 접종을 실시 찾을 수 있습니다. 마지막으로 높은 친화 도로 결합 리간드 및 항체를 합리적으로 계획된 정석 실험을위한 기초를 형성해야하며, 내열성 변형을 이용하여, 하나는 다른 계면 활성제의 성질을 변화시킴으로써 조건의 넓은 범위를 선별 할 수있다. 또한, 지질 메소 18 bicelles 결정화 또는 19을 사용하여 항상 미셀 결정화 대안으로 고려되어야한다.

이러한 원리 및 방법은 약간의 후 변형과 함께 사용될 수있다표현하고 다른 표현 호스트에서 정화, 높은 친 화성 약물의 표적의 구조 결정에 특히 유용하기 어려운 다른 많은 횡단 단백질 양이온.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

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References

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Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

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