Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

Detta manuskript beskriver hur man screena för thermostabilizing mutationer, rena mänskliga serotonintransportören, generera antikroppar med hög affinitet, och kristallisera serotonintransportören-antikroppskomplex bundet till det antidepressiva läkemedlet S -citalopram. Detta protokoll kan anpassas till studier av andra utmanande membrantransportörer, receptorer, och kanaler.

Abstract

Serotonintransportören är en natrium och klorid kopplade transportör som "pumpar" extracellulärt serotonin in i celler. S -citalopram är ett läkemedel som används för behandling av depression och ångest genom att binda till serotonintransportören med hög affinitet, blockerar serotoninåterupptags. Här rapporterar vi ett effektivt förfarande och en uppsättning verktyg för att stabilisera, Express, renar och kristalliserar serotonintransportören-antikroppskomplex bundna till S -citalopram och andra antidepressiva läkemedel. Mutationer som stabiliserar serotonintransportören identifierades med användning av en S -citalopram bindningsanalysen. Serotonintransportör uttryckt i baculovirus-transducerade HEK293S GnTI - celler, rekonstituerades in i proteoliposomer och används för att höja antikroppar med hög affinitet. Vi har utvecklat en strategi för att upptäcka antikroppar som är användbara för strukturstudier. En enkel metod för expression av antikroppsfragment i Sf9-celler har också etablerats.Transporter-antikroppskomplex som renats med hjälp av detta förfarande är väluppfostrade och lätt kristalliserar, vilket ger komplex med S -citalopram som avböja röntgen till 3-4 Å upplösning. De strategier som utvecklats här kan användas för att bestämma strukturen av andra utmanande membranproteiner.

Introduction

Serotonintransportören (Sert) är en integrerad membranprotein som underlättar transporten av serotonin över cellmembran 1. Sert tillhör en familj av Neuro Sodium Symporters (NSSS) som också innehåller dopamin och noradrenalin transportörer 2. SERT är det molekylära målet för allmänt föreskrivna antidepressiva och ångestdämpande läkemedel som verkar för att kompetitivt hämma serotonin transporter 3. Sert utnyttjar energiskt gynnsamma cotransport av natrium för att avlägsna signalsubstans från synaptiska klyftan. Omfattande karaktärisering av det serotonerga systemet har visat att förändringar i serotonin metabolism tycks påverka praktiskt taget alla neurologiska processer inklusive humör, sömn, smärta, kognition, och aggression beteenden 4. SERT funktion kan modifieras genom användning av antidepressiva läkemedel och selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) som S -citalopram, liksom genom psychostimulaNTS och droger av missbruk, såsom amfetamin och 3,4-metylendioxi- N -methylamphetamine eller "extas" 1,2.

SSRI är oerhört viktiga för behandling av affektiva störningar, men den exakta strukturella basen för deras agerande är inte väl förstådd. WT SERT är instabil i detergentmiceller, vilket hindrar utvecklingen mot ett tredimensionellt (3D) struktur Sert 5,6. Nyligen utvecklade vi varianter av Sert som är kraftigt stabil i ett brett spektrum av tvättmedel och behålla SSRI-bindande aktivitet 6. Dessa termo sert varianter valdes med hjälp av en Scintillation Proximity baserad termoanalys. Här beskriver vi ett förfarande för generering av antikroppar med hög affinitet som kan binda SERT, och rening och kristallisation av termostabilt SERT, i komplex med antikropp och S -citalopram.

Detta protokoll förutsätter att Sert och 8B6 gener har varit framgångsriky klonades in i BacMam 7 och insekts expressionsvektorer, respektive. Att generera antikroppar, ades cDNA som kodar för resterna 73-616 av WT SERT klonades in i BacMam vektor med en C-terminal Strep Il-tag (SERT IC). För termo skärmen var Sert resterna 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, och 10-His-taggar (SERT TC) användas. Individuella punktmutationer genererades i Sert TC bakgrunden. För kristallisa protokollet var Sert-GFP-fusionsprotein som används med Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] och 10-his-märkningar, bär termo mutanter, Y110A, I291A och T439S och mutationer av ytan cysteiner C554A, C580A och C622A (SERT CC). Trombin klyvningssekvenser (LVPRGS) var också insatt i SERT CC efter F76 och T618 för att tillåta avlägsnande av den N- och C-terminalerna. Den plasmid som kodar för 8B6 Fab var konstruerad för att uttrycka både tunga och lättakedjor av antikroppen med gp67 utsöndringssekvenser som styrs av två separata polyhedrin-promotorer. C-terminalen av den tunga kedjan av 8B6 antikropp märktes med en 8-His-markör och en trombinklyvningsställe insattes mellan den tunga kedjan och den taggen.

Protocol

1. Transfektion av vidhäftande HEK293S GnTI - Celler för Termostabilitet Screen

  1. Förbereda Poly-D-lysin (PDL) -belagda 96-brunnars plattor. Utför allt arbete i en steril laminärt flöde huva.
    1. Filtrera en 25 mikrogram / ml lösning av (PDL), molekylvikt 70,000-150,000 Da, med användning av ett 0,2 | im sterilt filter. Tillsätt 50 mikroliter av PDL till varje brunn i en 96-brunnars vävnadsodlings (TC) plattan och se till botten är jämnt överdragna, och inkubera vid RT i 30 min.
    2. Aspirera PDL-lösning och tvätta med 200 mikroliter sterilt vatten.
    3. Att plattan lufttorka i 2 h före lagring vid 4 ° C. PDL belagda plattorna kan lagras vid 4 ° C under flera veckor.
  2. Trypsinering av adherenta HEK293S celler.
    1. Växa HEK293S till 80% konfluens i en 10 cm skål som hölls vid 37 ° C med 8% CO2. En enda 10 cm maträtt bör ha cirka 10 miljoner HEK293S celler. Använd inte celler efter 30 passager! Aspirera media och tvätta med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 1 mL trypsin-EDTA-lösning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA) till cellerna och inkubera i 2 min vid 37 ° C.
    2. Tillsätt 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och återsuspendera cellerna genom upprepad pipettering upp och ned med hjälp av en serologisk pipett.
    3. Pipettera 10 | il av celler och blanda med 10 mikroliter av Trypan Blue-lösning (0,4%). Bestämma celldensitet med användning av en hemocytometer och ett ljusmikroskop. Räkna inte celler som färgats blå som de är döda. Säkerställa att cellviabiliteten är över 90%.
  3. Grundligt resuspendera trypsineras HEK293S GnTI - celler i DMEM kompletterat med 10% FBS till en densitet av 0,5 x 10 6 celler / ml i en engångspipett reservoar. Cirka 5 miljoner HEK293S celler kommer att behövas för varje platta. Totalt 24 konstruktioner kan transfekteras på varje platta med hjälp av denna protocol.
  4. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 100 | il av celler till varje brunn i en PDL-belagda plattan. Resuspendera cellerna i pipetten reservoaren efter fyllning varje platta för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna. Inkubera cellerna i en 37 ° C inkubator med 8% CO2. Efter 24 timmar, bör cellerna når cirka 80% konfluens.
  5. 1 h före transfektion ersätta media. Förbered DNA-transfektionsreagens komplex för transfektion.
    1. För varje konstruera i SERT TC bakgrund som skall screenas, blanda 450 ng DNA med 45 mikroliter av serumfritt DMEM och blanda. Lägga 1,6 mikroliter av transfektion reagens till 45 mikroliter av serumfritt DMEM och blanda.
    2. Omedelbart lägga utspädd transfektion reagenslösning till DNA-lösningen och blanda. Blanda inte lösningar i omvänd ordning. Vänta 10-15 minuter och tillsätt 20 mikroliter av transfektionsreagens / DNA-blandningen till 4 brunnar.
  6. När alla brunnar har transfekterats, blanda plattan genom att försiktigt gunga fram ennd fram och tillbaka till 37 ° C inkubator.
  7. Efter 16 - 24 timmar ersätta media med DMEM innehållande serum och 10 mM natriumbutyrat.
  8. Ungefär 48 timmar efter transfektion avlägsna media och antingen omedelbart vidare med termo skärm eller frysa celler vid -80 ° C för senare användning. Celler kan förvaras vid -80 ° C under flera veckor.

2. Scintillation Proximity-baserade Termostabilitet Screen med S -citalopram

  1. Inkubera celler med 200 nM S -citalopram i 25 mikroliter av TBS (Tris-buffrad saltlösning - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) under 5 min vid RT.
  2. Solubilisera cellerna genom tillsats av 25 mikroliter av 8 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranosid (C12M), 1 mM kolesteryl hemmisuccinate (CHS), proteashämmare cocktail (2 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinin, 4 g / ml pepstatin A, och 4 | ig / ml leupeptin) i TBS, och inkubering under 1 h vid RT.
  3. Tillsätt 50 | il av TBS with 20 nM [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% bovint serumalbumin, och 2 mg / ml His-tag affinity scintillationsproximitetsanalys (SPA) pärlor till tre brunnar för varje konstrukt. För sista väl lägga till samma lösning listas men komplettera med 100 ^ M sertralin för att bestämma icke-specifik bindning. Säkerställa att His-tag affinity SPA-pärlor blandas noggrant vid tillsats till den 96-brunnar.
  4. Mäta [3 H] citalopram bindning med användning av en 96-brunnars-scintillationsräknare vid RT med en 1 min räkningstid per brunn. Fortsätt räkna plattor tills totalt räknar Plateau (ungefär efter 36 h).
  5. Värmeplattor för 15 minuter i ett värmeblock med en uppvärmd lock vid 33 ° C. Mät [3 H] citalopram bindning igen efter uppvärmning som beskrivs i 2.4.
  6. Upprepa steg 2,4-2,5 och ändra uppvärmningssteget till 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, och 51 ° C. Justera uppvärmningstemperaturer beroende på den skenbara smälttemperaturen (Tm)av målproteinet och termostabiliteten hos den mest stabila konstruktionen. Fortsätt att värma plattorna tills alla konstruktioner har låga specifika räknas.
  7. Analysera data för att bestämma Tm-värden.
    1. Bestäm den genomsnittliga totala räkningar per minut (CPM) för varje konstruktion för brunnar som inte innehåller sertralin genom medelvärdes 3 likadana brunnar. Bestämma den ospecifika CPM som genomsnittet av de CPM av varje brunn innehåller sertralin i en enda platta.
    2. Beräkna specifik CPM genom att subtrahera den ospecifika CPM från total CPM.
    3. Beräkna Tm av en icke-linjär anpassning till en Boltzmann sigmoidal funktion. Konstruktioner med låg specifik CPM vid RT (<10% av WT) i allmänhet inte har korrekta Tm-värden. Mutationer från de flesta termostabila konstruktioner kan kombineras tillsammans och screenas för additiva ökningar av värmestabiliteten.

3. Expression av humant Serotonin Transporter i HEK293S GnTI

  1. Transformera kemiskt kompetenta DH10Bac-celler med en ng plasmid.
    1. Lägg plasmid till 50 mikroliter av DH10Bac celler och inkubera på is under 30 min.
    2. Värmechock DH10Bac celler vid 42 ° C under 30 sek. Tillsätt 200 mikroliter av SOC-medium och inkubera vid 37 ° C under 4 h med skakning.
    3. Platta alla bakterierna på en Luria-buljong (LB) platta innehållande 50 | j, g / ml kanamycin, 7 pg / ml gentamicin, 10 mikrogram / ml tetracyklin, 100 | ag / ml 5-brom-3-indolyl β-D-galaktopyranosid, och 40 | ig / ml isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG).
  2. Isolera lacZ - kolonier (vita kolonier) som odlats vid 37 ° C under 2 d på LB-agarplattor.
  3. Växa flera kolonier O / N vid 37 ° C i 5 ml LB innehållande antibiotika och isolera bacmid DNA.
    1. Centrifugera ner bakterier vid 1000 xg i en centrifug under 5 min. Släng supernatanten. Resuspendera bakterier med 200 mikroliter av miniprep resuspension buffert.
    2. Lyse bakterier genom att tillsätta 200 mikroliter av miniprep lysbuffert och vända röret försiktigt 10 gånger. Tillsätt 200 mikroliter av neutralisering buffert.
    3. Avlägsnande av olöslig fraktion genom spinning vid 14000 xg i 10 min i en centrifug. Lägg 1 ml isopropanol till supernatanten och kylning vid -20 ° C under 20 min för att fälla ut DNA.
    4. Snurra vid 14000 x g i 15 min i en centrifug och kassera supernatanten.
    5. Tvätta DNA pelleten med 70% EtOH och snurra igen vid 14000 x g i 15 min. Släng supernatanten. Lufttorka DNA tills all EtOH har avdunstat och återsuspendera i 50 | il vatten.
      OBS: Bacmid DNA ska transfekteras till Sf9-celler omedelbart för bästa resultat, men kan också förvaras vid -20 ° C under flera veckor.
  4. Transfektera bacmid DNA i 1x10 6 celler av vidhäftande Sf9 odlas i en fuktig kammare vid 27 ° C i en 6-bra maträtt. Utför alla cellodlings manipulationer i en steril laminärt flöde huva.
      <li> Ta bort media från celler och tillsätt 2 ml av färskt Sf9 medier. Tillsätt 5 | ig av bacmid DNA till 100 | il av Sf9-media (lösning A).
    1. Tillsätt 8 | il av en katjonisk-lipid Sf9 transfektion reagens till 100 mikroliter av Sf9-media (lösning B). Inkubera rör innehållande lösning B under 5 min.
    2. Blanda rör innehållande lösning A med lösning B och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter och tillsätt alla av lösningen på de Sf9-celler.
    3. Efter 96 h, skörd supernatant (P1-virus) genom att passera genom ett 0,2 pm filter. P1-viruset kan förvaras under flera månader vid 4 ° C i mörker och återanvändas för att göra P2 virus som behövs.
  5. Tillsätt 100 mikroliter av P1-virus till en L av Sf9-celler vid en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i Sf9 medier. Infektera celler under 96 h, växer vid 27 ° C på en skakanordning vid 100 rpm.
  6. Centrifugera ner cellerna i en centrifug vid 4000 xg under 15 min och filter supernatanten innehållande viruspartiklar genom ett 0,2 pm filter. Kassera cellpelleten. Determine viral densitet med hjälp av en viral plackanalys eller ett virus räknare. Viruset Densiteten bör vara> 1 x 10 8-viruspartiklar per milliliter. P2-virus kan förvaras vid 4 ° C i mörker och används i flera månader.
  7. Infektera 10 L av HEK293S GnTI - celler 7 växer i suspension vid 37 ° C med 8% CO2 och 85% luftfuktighet på en skakanordning vid 130 rpm i 293 expressions medium kompletterat med 2% FBS vid en infektionsmultiplicitet (MOI) på två och en densitet av 3 x 10 6 celler / ml, typiskt 30-50 ml av P2 virus per 800 ml av celler i en 2 L bafflad kolv.
    OBS: Det är inte rekommenderat att använda mer än 80 ml av P2-virus sedan HEK293S GnTI - celler växer långsamt och kan bli olönsamma på grund av en förändring i pH. Sf9 media är surare än 293 Expression Media.
  8. 12-16 h efter infektion, tillsätt natriumbutyrat till en koncentration av 10 mM från en 1 M förråds. 48-60 h efter infektion, skörd celler genom centrifugering vid4000 xg under 15 min. Avlägsna supernatanten.
  9. Resuspendera cellerna i 150 ml TBS, 2 ^ M S -citalopram eller andra sert inhibitorer och förvara vid -80 ° C tills redo för rening.

4. affinitetsrening av serotonintransportören för immunisering och kristallisation

  1. Tina celler från 10 liter kultur i varmt vatten (ca 30 ° C) och återsuspendera genom att snabbt passera genom en 10 ml pipett tills homogen.
  2. Förbereda tvättmedelslösning för solubilisering (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl innehållande 40 mM C12M, 5 mM CHS, och proteasinhibitorcocktail.
  3. Lägg alla celler till en bägare med en omrörare och lägga till alla tvättmedelslösning till cellerna under omrörning. Solubilisera vid 4 ° C under 1 h under omröring.
  4. Snurra lysatet vid 8000 xg under 15 min vid 4 ° C. Kasta pellets och dekantera supernatanten i rena ultracentrifugrör. Snurra vid 100.000 xg under 1 h i en ultracentrifuge. Kassera pellet och filtrera supernatanten genom ett 0,2 pm filter.
  5. Passera lysat över 10 ml Strep affinitetsharts packades i en kolonn med användning av en peristaltisk pump jämviktad i tvättbuffert: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glycerol, 25 | iM lipid (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero 3-fosfokolin, en-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin, och 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfoglycerol i ett molärt förhållande av 1: 1: 1), och en iM S -citalopram eller SSRI i TBS.
  6. Ansluta Strep affinitetskolonn till en snabb protein vätskekromatografi (FPLC) -system och tvätta kolonnen med 2 ml / min med 66 ml (6,6 kolonnvolymer) av tvättbuffert. Eluera renat protein i samma buffert kompletterad med 5 mM destiobiotin vid 0,5 ml / min med användning av 33 ml (3,3 kolonnvolymer) av buffert. Samla 1 ml fraktioner; toppfraktionerna kommer att vara ~ 10 ml. Renade proteinet kan förvaras vid 4 ° C under 2-3 d om så önskas.
    OBS: Det totala utbytet blir 3 -4 mg SERT CC och 1 mg SERT IC. En absorbans två AU vid 280 nm är lika med 1 mg / ml SERT.

5. Beredning av Transporter i liposomer för immunisering

  1. Förbereda liposomer innehållande asolectin: kolesterol: lipid A: hjärna polär lipid (molförhållande 60: 17: 3: 20). Upplösa lipider i en ml kloroform och tillsätt 40 mg total lipid till en 100 ml glasrundbottnad kolv vid den indikerade molförhållandet.
    1. Avdunsta kloroform under åtminstone 1 h under vakuum, varvid rundkolv som roterar i varmt vatten, cirka 30 ° C.
    2. Rehydrera lipider genom tillsats av 10 ml av TBS. Inkubera i buffert under 10 minuter.
    3. Frysa lipiden genom att placera kolven i flytande N2.
    4. Tina. Doppa sfärisk botten av kolven i en bägare fylld med varmt vatten, cirka 30 ° C. Sonikera i en badsonikator under 5 min.
    5. Vortex och upprepa steg 5.1.3 - 5.1.4 10 gånger eller tills lipidär helt resuspenderas från botten och bildar en grumlig suspension.
    6. Extrudera hela lipidblandningen två gånger genom 200 nm filter. Lipiden kommer att visas som en mjölkig suspension före strängsprutning; efteråt kommer det att vara genomskinliga. Lägg inte till hela lipidblandningen till extrudern på en gång eftersom det kan bli tilltäppt, vilket resulterar i förlust av prov.
    7. Spin lipider vid 100.000 xg under 20 min och återsuspendera i 0,5 till 1 ml TBS i en koncentration av 40 mg / ml.
  2. Koncentrera renat SERT IC till 250 - 500 mikroliter med hjälp av en 100 kDa MWCO centrifug proteinanrikningsverk till 2-4 mg / ml och mätta liposomer med 5 mM C12M. Lägg renat SERT till tvättmedel: lipidblandningen i 1 ml slutlig volym.
  3. Ta C12M av 3 successiva tillsatser av 80 mg / ml hydrofoba absorption harts. För de första 2 tillägg, inkubera med harts med rotation under 2 h vid 4 ° C. Ta harts genom att passera genom glasull. Utföra den slutliga inkubationen med hartsöver natten.
  4. Koncentrera proteoliposomer genom centrifugering vid 100000 x g under 20 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 250-500 mikroliter TBS.
  5. Tillsätt 10 ^ M slutlig koncentration av S -citalopram till den rekonstituerade proteinet efter det slutliga avlägsnandet av harts.
  6. Solubilisera 2,5 mikroliter av de proteoliposomer i SDS-PAGE-laddningsbuffert (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromfenolblått, 100 mM DTT) och kördes på en SDS-PAGE-gel vid 200 V under 1 h för att säkerställa att Sert framgångsrikt har färdigberedda. Proteoliposomer kan lagras vid -80 ° C i alikvoter för långtidsförvaring och tinades på is före varje immunisering.

6. Screening för antikroppar som känner igen 3D Epitoper

  1. Screen hybridoma cellinjer genom Western blöt. Antikroppar som känner igen Sert genom western blöt sannolikt binder linjära epitoper och kommer sannolikt inte att vara användbar för strukturstudier.
    1. Blanda 1 pg av purified SERT IC eller SERT CC och kördes på en 4-15% SDS-PAGE-gel vid 200 V under 1 h.
    2. Överföring till ett nitrocellulosamembran vid 200 mA under 30 min med användning av Towbin-buffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% (volym / volym) metanol, 0,1% SDS). Membranet kan torkas och lagras på obestämd tid vid rumstemperatur.
    3. Återvätning membran med 10% metanol, och tvätta med PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
    4. Blockera med 5% mjölkpulver i PBS under 30 min vid RT.
    5. Tvätta med PBS och inkubera med ett mikrogram / ml av antikroppen i PBS med 0,1% mjölk.
    6. Tvätta grundligt med PBS innehållande 0,1% Tween-20.
    7. Inkubera med get-anti-mus-antikropp konjugerad till ett IR-färgämne utspätt 1: 10000 i PBS med 0,1% Tween 20 och 0,1% mjölk.
    8. Tvätta omfattande och skanna med ett avbildningssystem.
  2. Blanda hybridom supernatant innehållande västerländska negativa antikroppar med 100 nM SERT CC protein med användning av ett molförhållande av 1: 2 (SERT: mAb) i 200 mikroliter TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, och en iM S -citalopram. Centrifugera vid 100.000 xg under 20 min. Analysera supernatanten innehållande sert-mAb-komplex och analysera genom fluorescensdetektering Size Exclusion Chromatography (FSEC) 8. Kassera pellet.
    1. Springa 100 mikroliter av supernatanten på en storleksuteslutningskolonn vid 0,5 ml / min med användning av en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) system utrustat med en fluorescensdetektor (Excitation: 480 nm, Emission: 510 nm) med användning av en körningsbuffert innehållande TBS, 0,4 mM lauryl maltos neopentylglykol, och en iM S -citalopram. Antikroppar som bildar komplex kommer att orsaka GFP-fusionsprotein för att eluera tidigare än den fria transportören från storleksuteslutningskolonn.
    2. Späd komplex till 10, 1, 0,1 nM i 200 mikroliter TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, och 1 ^ M S -citalopram och repris FSEC. Antikroppar som fortfarande kan förskjutas transportören toppen vid låga nanomolära koncentrationer ärhög affinitet bindemedel och goda kandidater för strukturstudier.
  3. Testa bindning genom FSEC i närvaro av 1 mM serotonin. Antikroppar som specifikt känner igen den SSRI bundna konforma kommer inte att binda i närvaro av substratet. Antikroppar som känner igen en 3D epitop som inte ändras som ett resultat av konforma binder oberoende av närvarande ligand.
  4. Blanda parvisa olika kombinationer av antikroppar och testa bindning genom FSEC. Antikroppar som känner igen distinkta epitoper kommer att orsaka SERT att eluera tidigare när de kombineras tillsammans, jämfört med bindning av en enda antikropp.
  5. För inledande strukturstudier, väljer den högsta affiniteten antikroppar som känner igen 3D epitoper.

7. Redovisning av antikroppsfragment i Sf9-celler

  1. Klon variabla och konstanta domänerna av Fab genom PCR in i insektsexpressionssystem för uttryck i Sf9-celler med användning av standardprotokoll.
  2. Transfektera 1 x 10 6 Sf9-celler med 5 ^ g av Bacmid DNA som kodar för de lätta och tunga kedjorna av 8-His-märkta 8B6 Fab med en gp67 utsöndringssekvens (enligt avsnitt 3.4).
  3. Harvest P1-virus 96 h posttransfection och tillsätt 500 | il av P1-virus till en L av Sf9-celler vid en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i en 2 L kolv för att göra P2 virus. Infektera celler under 96 h vid 27 ° C.
  4. Harvest P2-virus (enligt avsnitt 3.6).
  5. Infektera 6 L av Sf9-celler vid en densitet av 2 - 3 x 10 6 celler / ml med en MOI på 2 med P2-virus, typiskt 40 - 50 ml per kolv med ett L av Sf9-celler i varje 2 L kolv.
  6. Harvest celler ungefär 96 timmar efter infektion. Tillsätt 50 ml av fosfatbuffert, pH 8 vid en slutlig koncentration av 50 mM till cellerna och centrifugering vid 4000 xg under 20 min. Kassera cellpelleten och filter supernatanten genom ett tangentiellt flödescell 0,2 pm filter. Supernatanten och förvara vid 4 ° C under 2 - 3 dagar om så önskas.

  1. Koncentrera Sf9 supernatant med hjälp av en 30 kDa molekylvikt Cut Off (MWCO) tangentiellt flödescell till cirka 400-800 ml.
  2. Lägg imidazol, pH 8 vid en slutlig koncentration av 10 mM och 10 ml His-tag affinitetsharts. Rör om i en bägare under 1 timme vid 4 ° C.
  3. Samla His-tag affinitetsharts genom centrifugering vid 2000 x g under 5 min. Släng supernatanten.
  4. Packa His-tag affinitetsharts i en kolonn och ansluta till en FPLC.
  5. Tvätta His-tag affinitetsharts vid 2 ml / min med 66 ml (6,6 kolonnvolymer) av 50 mM fosfat, pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol.
  6. Eluera 8B6 Fab i 33 ml 50 mM fosfat pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazol. Samla 1 ml fraktioner.
  7. Späd affinitetsrenat Fab med en 10-faldig volym av iskall 20 mM acetat, pH 5.
  8. Binda Fab till en 1 ml katjonbytarkolonn med hjälp av en peristaltisk pump med en ml / min.
  9. Separat Fab med hjälp av en 30 ml linöra gradient av NaCl (0-500 mM) i 20 mM acetat pH 5,5 med hjälp av en FPLC. Fab kommer att elueras som en enda topp vid ~ 300 mM NaCl.
  10. Analysera på en 12,5% SDS-PAGE-gel med användning av provbuffert innehållande 100 mM DTT. De tunga och lätta kedjorna av 8B6 Fab kommer att köras på 27 och 25 kDa, respektive, på en reducerande SDS-PAGE-gel.
  11. Pool av fraktioner innehållande Fab och koncentrera till åtminstone 10 till 15 mg / ml med användning av en 30 kDa MWCO-protein koncentrator i en svängande hink centrifug vid 3000 x g.
  12. Justera till pH 8 genom tillsats av 1 M Tris pH 8 till en slutlig koncentration av 50 mM och lagra renade Fab för lång sikt vid 4 ° C. Totalt utbyte kommer att vara 25 - 30 mg. En absorbans av 1,4 AU vid 280 nm är lika med 1 mg / ml av 8B6 Fab.

9. Bildande av Transporter-antikroppskomplex och Separation genom Size Exclusion Chromatography

  1. För kristallisation, rena SERT CC by Strep affinitetskromatografi i C12M som beskrivits tidigare (avsnitt 4).
  2. Blanda koncentrerad SERT med Fab vid ett molförhållande av 1: 1,2 i en volym mindre än 500 mikroliter. Centrifugera vid 100.000 xg vid 4 ° C under 20 min. Samla supernatanten innehållande Sert-Fab komplex. Släng pellet.
  3. Separat genom storleksexklusionskromatografi (SEC) med användning av en FPLC på en storleksuteslutningskolonn ekvilibrerad i TBS kompletterat med 40 mM n-oktyl-β-D-maltosid (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glycerol, 25 | iM lipid (samma som i steg 4,5), och 1 ^ M S -citalopram vid 0,5 ml / min.
  4. Samla in 0,5 ml fraktioner och analysera på 4-15% SDS-PAGE-geler liksom av tryptofan-fluorescens genom SEC. GFP-märkt SERT kommer att köras vid ca 80 kDa på en SDS-PAGE-gel. Efter avlägsnande av termini och N-kopplade sockerarter det kommer att köras som ett protein 45 kDa.
  5. Determine vilka fraktioner för att kombinera genom att samla endast de fraktioner som är monodispersa såsom bedömdes genom analys av fraktionerna genom tryptofan fluorescens SEC (Excitation: 280, Emission: 335 nm).
  6. Store renat SERT-8B6 komplexet vid 4 ° C i upp till en vecka.

10. Kristallisation av Transporter-antikroppskomplex genom hängning Drop

  1. Före kristallisering, koncentrera toppfraktionerna från SEC separation av Sert-8B6 komplexet till 2 mg / ml med hjälp av en 100 kDa MWCO centrifug protein anrikningsverk. En absorbans av 2 AU vid 280 nm är lika med 1 mg / ml.
  2. Lägga till ytterligare Fab vid ett förhållande av 1: 0,05 komplex: fri Fab. Tillsätt 10 | iM fria S -citalopram.
  3. Centrifugera vid 100.000 xg vid 4 ° C under 20 min. Samla in supernatanten innehållande den SERT-Fab-komplexet. Släng pellet.
  4. Inrätta en droppe 24 brunnar skärm vid 4 ° C enligt tabell 1. Grow diffraktion kvalitet kristaller över reservoarlösningarinnehållande 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25-125 mM KCl, 32,5-34% PEG 400, och 0,5% 6-aminohexansyra.
    OBS: Använd Tris justerad med NaOH till pH 8,5 som en buffert. Använd inte Tris-bas justeras med HCl. Skärmen kan framställas i 2 ml rör och används till färdigt. Var noga med att exakt pipett PEG 400 med hjälp av en positiv förskjutning pipett eftersom det är extremt trögflytande!
    1. Pipettera 500 mikroliter av varje reservoar lösning i en låg profil 24-brunnar med tätningsmedel appliceras till varje brunn. Pipett 1,5, 1,75 och 2 mikroliter av Sert-8B6 komplex på en 18 mm silikontäckglas. Pipettera 1 mikroliter av reservoarlösningen på toppen av proteinprovet.
      OBS: Plattan köptes med tätningsmedel redan tillämpas på kanten av brunnarna.
    2. Applicera locket till 24 brunnar med dropparna vända behållaren lösning och försegla omedelbart genom att trycka på locket glida på tätningsmedel i förväg appliceras på varje brunn.
    3. Fortsätt tills alla 24-brunnar har satts upp. Lämna den färdiga plattan i ett välisolerat rum vid 4 ° C. Stör ej plattorna under minst 3 dagar
      OBS: En kristall visas inom cirka tre dagar och växa till 100-175 um efter 14 dagar.
  5. Skörd kristaller i cryoloops och direkt flash-cool i flytande N2 före samlingen diffraktion uppgifter röntgen.
  6. Om det behövs, hitta ytterligare kristallisationsbetingelser med bred screening med hängande droppar. Använd tre droppar med protein: fällningsförhållanden av 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Om en robot är tillgänglig, sedan ställa upp 100-150 nL droppar över 70 mikroliter av reservoarlösningen i en 96-brunnar. Större 3D kristaller kan odlas i 24-brunnar.
  7. Betyg baseras på utseendet av droppen: 0, klar; 1, damm; 2, granulär fällning; 3, fasseparation; 4, mikrokristallin; 5, nålar; 6, plattor; 7, 3D kristaller.
  8. Ställ in kristallisering genom att hänga droppe metoder i 24-brunnar som beskrivits ovan runt nyligen identifierade diritions.

Representative Results

Ett bibliotek av enstaka punktmutanterna i Sert TC bakgrunden skapades för att screena för thermostabilizing mutationer. Individuella mutanter genererades med användning av standardmutagenes. Screeningsprotokollet utnyttjar transient transfekterade HEK293S celler och en scintillations-närhetsbaserad termostabilitet skärmen för att snabbt identiteten användbara mutationer för kristallisation som beskrivs översiktligt i fig 1A. Plotting Tm-värden kontra bunden [3H] citalopram vid RT avslöjar konstruktioner med hög termostabilitet och expressionsnivåer som är lämpliga för proteinrening (Figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, och T439S) kombinerades för att generera en mycket stabil konstruktion (Figur 1C). Termostabilitet är också korrelerad med ökad stabilitet i kortkedjiga detergenter som är nödvändiga för kristallisering av SERT-Fab-komplexet.

Den storskaliga uttryck av humant Sert användning av baculovirus-transduced HEK293S GnTI - celler kan ta mindre än 2 veckor och kan producera milligramkvantiteter, såsom illustreras i figur 2A. Användning av GFP-märkta SERT CC-protein tillåter SERT att enkelt följas under expression och rening genom fluorescens (figur 2B). Vår reningsstrategi involverade 1) solubilisering av SERT bundet till S -citalopram från HEK293S GnTI - celler i C12M i närvaro av CHS som stabiliserande lipid; 2) bindning av Sert till en Strep affinitetsmatris; 3) avlägsnande av kontaminerande proteiner genom omfattande tvättning; och 4) eluering av den funktionella SERT med buffert innehållande destiobiotin (figur 2C). Det eluerade proteinet är i stort sett fri från andra detekterbara proteiner genom Coomassie blåfärgning och monodispersa som bedöms av FSEC (figur 2D, E).

En liknande strategi togs för att rena SERT med en Strep Il-tag, som användes för reconstitution och immunisering (Figur 3A, B). Inkorporering av SERT i proteoliposomer ökar serumhalveringstiden och stabiliteten hos SERT och förbättrar sannolikheten för isolering av antikroppar med hög affinitet. Vidare inkludering av lipid A, en komponent i bakteriecellväggen, tjänar som en potent adjuvans 9. Multilamellära liposomer framställdes genom tillsats av buffert till en torkad lipidblandning i glasrör och återsuspenderades i buffert. Extrudering av liposomerna genom 200 nm porstorlek filter ger monodispersa unilamellära liposomala suspensioner. Liposomerna därefter mättades med detergent, följt av tillsats av renat SERT i tvättmedel. Slutligen tvättmedel avlägsnas genom tillsats av hydrofoba absorption harts till lipid: tvättmedelsblandning. Ytterligare ligand bör läggas till det rekonstituerade provet för att selektera för antikroppar som känner igen den antidepressiva bundna konformation. Närvaron av Sert i proteoliposomer bör bekräftas genomsolubilisering ett litet prov med SDS-PAGE-laddningsfärg eller C12M och körs på SDS-PAGE och FSEC (figur 3C, D).

Hybridom-cellinjer som uttrycker SERT antikroppar kan screenas med avseende på hög affinitet bindemedel som känner igen 3D-epitoper. Dessa egenskaper är avgörande för en eventuell framgång kristall som antikroppen måste förbli fast bundna till en strukturerad regionen för att främja kristall förpackning av homogena, välordnade domäner. I det första steget, är antikroppar som känner igen ostrukturerade regioner identifieras. Sert är denaturerad och blottades på ett nitrocellulosamembran; antikroppar som binder denaturerad Sert kommer att vara västerländsk positiv och sannolikt känner igen linjära epitoper. I figur 4A, visar vi 2 exempel på antikroppar som är western-positiv och sannolikt inte lämpligt att främja crystallogenesis. I figur 4B, är de återstående väst negativa antikroppar inkuberades med 100 nM SERT-GFP och åtskilda avFSEC. Antikroppar som binder Sert kommer att förskjuta GFP-positiva topp till ett tidigare läge. De sert-antikroppskomplex kan spädas ytterligare i rengöringsmedel för att avgöra om de kan binda med nanomolar affinitet följt av analys av FSEC. Tillsats av serotonin resulterar i konformationsförändringar i transportören och därmed de antikroppar kan återscreenades för att bestämma om de specifikt kan känna igen SSRI-bunden konformation. I figur 4C är antikropparna visade sig binda SERT i närvaro av serotonin, som visar att epitopen (er) inte ändrar från SSRI till substrat bundet tillstånd. Slutligen, i figur 4D kombinationer av antikroppar testas med avseende på deras förmåga att binda distinkta epitoper, vilket resulterar i en ytterligare vänstervridning. Här den 15B8 eller 8A11 antikroppar känner igen en epitop som skiljer sig från 8B6.

Den 8B6 antikropp valdes för ytterligare strukturanalys baserad på preliminära kristall screening med papain treaTed Fab. Generna enligt 8B6 Fab klenades in i en insektscell-expressionsvektor. Fab kan uttryckas och utsöndras från Sf9-celler som växer i suspension. Den 8B6 Fab kan renas från Sf9-cell supernatanten genom His-tag affinitet (fig 5A, B) och katjonbyteskromatografi (Figur 5C, D) som resulterar i protein som förefaller fri från föroreningar på SDS-PAGE-geler. I fig 5E, är den rekombinanta 8B6 Fab visades binda SERT och används i efterföljande biokemiska och biofysiska experiment.

Det affinitetsrenade SERT CC spjälkas med trombin och EndoH och blandades med 8B6 Fab att bilda ett komplex i närvaro av S -citalopram. Transportören-antikroppskomplexet separeras sedan genom SEC i C8M (figur 6A) och toppfraktionerna innehåller både SERT och Fab, såsom visas genom SDS-PAGE (Figur 6B). Användning av C8M är avgörande för kristallbildning troligen på grundden kortkedjiga detergent medger bättre packning mellan molekyler i kristallgittret. FSEC används för att bestämma vilka fraktioner bör slås samman för kristallisation (figur 6C); fraktioner som inte är monodispersa och / eller innehåller stora mängder av fri Sert eller Fab bör inte kombineras.

Prism formade sert-antikropp kristaller kan odlas i närvaro av S -citalopram användning av detta protokoll genom att hänga droppångdiffusion (figur 7A). De resulterande kristallerna diffrakterar röntgenstrålar till en upplösning på 3,15 Å 10 (Figur 7B).

Figur 1
Figur 1: Scintillation Proximity-baserade Termostabilitet analys A.. Översikt över protokoll för screening termo i närvaro av [3H] citalopram. B. Maximal bunden [3 (Tm). Streckade linjerna representerar värden för WT-transportören. De 3 mest termo mutanter är märkta. Grå området representerar mutanter som har mindre än 10% av [3H] citalopram bindande i förhållande till WT och därmed felaktiga Tm-värden på grund av en låg signal-till-brus. C. Termokurvor för WT SERT TC och de bästa 3-mutanter. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Översikt över Mammalian heterologt protein Expression A.. Schematiskt översikt över BacMam virusgenerering och uttryck av SERT i HEK293S GnTI -. Celler B. HANK293S GnTI - celler som uttrycker SERT CC (GFP fluorescens) C.. Elueringsprofilen för SERT CC på Strep affinitetsharts. Grön spår representerar koncentrationen av destiobiotin, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Analys av affinitetsrenat SERT CC på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel E.. FSEC av affinitetsrenat SERT CC detekteras av GFP fluorescens (excitation: 480 nm; Emission: 510 nm). Elueringstoppen på 15 ml är Sert (#) och 18 ml är fri GFP (*). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Representant Affinitetsrening och Rekonstituering av SERT IC A.. Schematisk översikt av antikroppsgenerering. <strong> B. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av affinitetsrening av Sert IC på Strep affinitetsharts. Grön spår representerar koncentrationen av destiobiotin, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analys av affinitetsrenat och rekonstituerades SERT på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel D.. FSEC av solubiliserat Sert efter beredning. Fluorescensen hos tryptofan rester användes för att detektera Sert (excitation: 280 nm; Emission: 335 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. Analys av representativa Sert antikroppar A. Screening av antikroppar med Western blöt. Cirka 1 pg av SERT CC med eller utan GFP applicerades på en 4 - 15% SDSPAGE-gel och blottades på ett nitrocellulosamembran. Bindning detekterades med användning av en get-anti-mus-antikropp konjugerad till IR Dye. 2G4 och 10F2 är västra positiv. B. Bindning av antikroppar till 100 nM GFP-märkta Sert och upptäckt av FSEC detekteras med hjälp av GFP fluorescens. C. Bindning av utvalda Fabs till 100 nM GFP-tagged SERT i närvaro av 1 mM serotonin. D. Bindning av 8A11 eller 15B8 Fabs att sert-8B6 Fab. Mindre toppar som eluerade vid 18 ml är gratis GFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Representant Rening av 8B6 Fab från Sf9 celler A.. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av rening av 8B6 Fab av His-tag affinitet chromatograp hy. Grön spår representerar koncentrationen av imidazol, 0-50% (0-250 mM) B.. Icke-reducerande och reducerande SDS-PAGE-gel efter His-tag affinitetsrening. Protein som löper nära 50 kDa är icke-reducerad Fab (#) och mindre arter på 25 kDa reduceras Fab (*). C. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av rening av 8B6 Fab genom katjonbyte visar en enda symmetrisk topp som eluerar i en linjär natriumkloridgradient. Grön spår representerar koncentrationen av NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analys av 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel efter rening genom katjonbyte. E. Bindning av 8B6 Fab till 10 nM GFP-märkta Sert, detekteras med hjälp av fluorescens av GFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

e 6 "src =" / filer / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Figur 6: Representant Gelfiltreringskromatografi av SERT-8B6 komplexet i närvaro av S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen för renat Sert-8B6 komplex. Huvudtopp som eluerade vid 11,5 ml är Sert-8B6 komplex. Peak på 15-17 ml innehåller GFP och Fab B.. Analys av det renade SERT-8B6-komplexet på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Positionerna för SERT och de tunga och lätta kedjorna av Fab visas med ett streck. C. FSEC av storleksseparerade fraktioner. SERT-8B6 komplex detekterades med användning av tryptofan fluorescens. Fraktion 17 innehåller en större mängd Sert som inte komplex med Fab. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7 Figur 7: Kristallisation av Sert-8B6 Complex Bound S -citalopram A.. Ljusmikroskopi av parallellepipedformade formade kristaller av Sert-8B6 komplexet efter 2 veckors tillväxt. Skala bar är lika med 200 nm. B. SERT-8B6 kristaller diffrakterar röntgenstrålar till 3,15 Å. Blå ringen representerar 3,15 Å. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: a. Kristallisebilden för den Sert-8B6 Complex Bound S -citalopram Klicka här för att ladda ned den här tabellen.

Discussion

Bestämning av membranproteinstruktur genom biofysiska tekniker fortfarande en skrämmande företag för många medicinskt viktiga transportörer, receptorer, och kanaler 11. Här delar vi detaljerad kunskap som utvecklats för strukturbestämning av den mänskliga serotonintransportören bunden till S -citalopram. Vi räknar med att dessa metoder kommer att vara användbart för att bestämma strukturer av Sert i andra konformationstillstånd samt strukturer för andra svåra membranproteiner. Vidare kan de biokemiska metoder som beskrivs här också användas för att studera funktionen av renat SERT i diskmedel och en nästan infödda lipid miljö.

SERT kristallise gångjärn på utvecklingen av flera verktyg och tekniker. Först, förbättringar i transportören termo producerade sert varianter som hjälpsökande i olika detergentmiceller efter extraktion av transportören från membranen 6. För det andra, användningenav high-affinitetsligand S -citalopram hela rening och kristallisation ytterligare förbättrad stabilitet och minskad konforma heterogenitet. Tredje, utveckling av BacMam expressionssystemet 7 tillåtna för produktion av stora mängder av SERT i en kort period av 2 veckor, vilket underlättar både immunisering och kristallisation. Slutligen, för utvecklingen av strategier för att välja för hög affinitet antikroppar som känner igen 3D-epitoper tillåts för upptäckten av 8B6 antikropp som främjar välordnad förpackning av sert-antikroppskomplex i kristaller.

Det finns ett antal kritiska steg och reagens samt vanliga problem som ofta förekommer i hela protokollet. För det första kan alstringen av hög titer SERT P2-virus vara problematisk. Lägga låga koncentrationer av P1-virus för att generera P2 virus som beskrivs i detta protokoll minskar vanligtvis detta problem, och i de fall där P2 virus titer är låg, kan P3 virus göras using-virus vid en MOI av 0,0001. Virus med en titer mindre än 1 x 10 8 viruspartiklar / ml bör inte användas och kommer nästan alltid att resultera i låga proteinutbyten. För expression, HEK293S GnTI - celler valdes eftersom de saknar N -acetylglucosaminyltransferase I-aktivitet och kan därför inte syntetisera komplexa N-glykaner, istället producerar endast hög mannos N-glykaner. EndoH klyver N-kopplad glykosylering av hög mannos glykaner på två platser i extracellulära slingan 2 (EL2), vilket ger en N -acetylglucosamine fäst vid asparagin. Nedbrytning av N-kopplade socker minskar ytan entropi EL2 som sannolikt viktigt för kristallisation. För genereringen av antikroppar, bör den SERT IC användas för immunisering. GFP är höggradigt immunogent 12 och bör inte användas som ett fusions tagg för att generera antikroppar eftersom det är svårt att helt ta bort genom SEC. Den flexibla N- och C-terminalen av SERT var också inteingår i konstruktionen i syfte att undvika antikroppar mot dessa regioner. Möss kan immuniseras med 30 mikrogram färdigberedd protein; fortsätta immunisering av möss tills höga serumkoncentrationer av antikroppar kan detekteras och producera hybridomceller som beskrivits 13. En thermostabilized konstruktion är oftast det bästa valet för immunisering; om transportören är uppfört sig väl och bibehåller biologisk aktivitet efter rening, är detta ofta tillräckligt för att framkalla antikroppar. Den 8B6 antikropp höjdes mot WT SERT. För kristallisation, bör endast de toppfraktionerna från SEC innehållande monodispersa komplex som bedöms av FSEC kombineras och koncentreras. SERT-8B6 kristaller växa i ett snävt intervall av villkor och det finns ett antal steg som bör vidtas för att felsöka problem specifikt relaterade till SERT kristalltillväxt. Tris-bas justerades med HCl bör inte användas i reservoarlösningen, eftersom denna buffert inte stöder kristalltillväxt; är det således critisk att istället använda Tris justerad med NaOH. SERT kristaller växa i ett smalt koncentrationsintervall av PEG 400, så om kristaller inte växer eller om många små kristaller observeras, skulle även en liten ökning eller minskning i PEG 400 koncentrationen rådas. Vidare har tillsatsen 6-aminohexansyra används också i den optimerade skärmen för att förbättra kärnbildning. Nedgången förhållandet protein: väl lösningen är också en avgörande faktor för kristalltillväxt. Drop-förhållanden på 1,5 - 2: 1 rekommenderas, med drop-förhållanden närmare 2: 1 typiskt stödja tillväxten av större 3-dimensionella kristaller. Slutligen är också avgörande mot kristalltillväxt användningen av lågprofil 24-brunnars plattor, förmodligen beroende på modifiering av hastigheten för ångdiffusion.

Ett alternativt tillvägagångssätt till SPA metoden har utvecklats för att skärmen för mutanter som stabiliserar råtta serotonintransportören i en kokain bunden konforma med hjälp av en filterbindningsanalys 5. Däremot SPA baSED analysen möjliggör sekventiella upphettningssteg följt av bestämning av den fraktion av Sert som är bundet till ligand. Således tillåter detta för snabb bestämning av smälttemperaturen från ett litet antal prover. SPA metod förlitar sig på tillgängligheten av en radiomärkt med hög affinitetsligand och om inga ligander är kända, vilka binder med submicromolar affinitet sedan ett alternativt tillvägagångssätt kommer att bli nödvändigt. Många andra metoder används allmänt för att mäta proteinstabilitet såsom bindning av fluorescerande färgämnen och kalorimetri 14 men är låg genomströmning och är antingen oförmögna att direkt mäta funktionen eller kräver stora mängder protein. Om SPA metoden inte kan användas, är ett alternativ med hög genomströmning tillvägagångssätt en FSEC-baserade Termostabilitet analys 15 (FSEC-TS), där provet värms följt av separation av den fraktion av resterande transportör. FSEC-TS är en användbar metod för att komma åt kromatografiska beteende och oligomera tillstånd och är apowerful kompletterande verktyg som kan användas tillsammans med SPA-metoden.

En jämförelse av olika gemensamma proteinexpressionssystem konstaterades också att främja användningen av däggdjursceller för SERT uttryck 16 och förvånande detta sannolikt är fallet för många proteiner av däggdjursursprung. De metoder som vi har använt för uttryck har skräddarsytts för SERT men sannolikt lätt anpassningsbar. Betingelser som gynnar höga nivåer av uttryck ska identifieras noggrant genom att variera tiden för uttryck, temperatur, viruskoncentration, och närvaron av histondeacetylas hämmare såsom natriumbutyrat.

Vi föredrar i allmänhet affinitetsrening i en mild lång kedja rengöringsmedel såsom C12M tillsammans med CHS före beredning för att behålla hög affinitet ligandbindning. Rekonstitution med användning av hydrofob absorption är en mild teknik som vi har funnit vara effektiva för flera andra transportörer och receptorer. Om det härär inte lyckas, avlägsnande av tvättmedel med hög kritisk micellkoncentration genom dialys, utspädning eller SEC kan användas 17 förutsatt att antigenet är tillräckligt stabil i sådana rengöringsmedel. I de fall där inga lämpliga antikroppar påträffas, vi nästan alltid hitta problemet beror på förlust av funktion eller denaturering av antigenet och i sådana fall vi framgångsrikt utfört nya vaccinationer med särskild uppmärksamhet på proteinbiokemi. Slutligen bör ligander och antikroppar som binder med hög affinitet ligger till grund för en rationellt planerad kristallisa experimentet och genom att dra fördel av ett termostabilt variant kan man screena ett bredare spektrum av betingelser genom att variera egenskaperna hos olika detergenter. Dessutom bör kristallisation i en lipidisk mesofas 18 eller med hjälp av bicelles 19 alltid betraktas som ett alternativ till kristallisation i miceller.

Dessa principer och metoder kan användas med viss modifikatjon för många andra transmembranproteiner, som är svåra att uttrycka och rena från andra expressionsvärdar, och kommer att vara speciellt användbara för strukturbestämning av måltavlor för hög affinitet droger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Tags

Biokemi strukturbiologi kristallisering membranprotein antikropp immunisering beredning serotonintransportören signalsubstans antidepressiva selektiva serotoninåterupptagshämmare termo
Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coleman, J. A., Green, E. M.,… More

Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter