Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विवो मॉडल में (सीएनएस) रोगों ऐसी दवाओं, रोगजनकों, या exosomes के रूप में exogenous पदार्थ, का एक प्रभावी वितरण, मस्तिष्क में आवश्यकता होती है। इसलिए, एक आदर्श वितरण पद्धति, जानवर के लिए कम से कम आघात का कारण neuronal नेटवर्क की अखंडता की रक्षा, और मस्तिष्क 1 में उच्च सांद्रता पदार्थ को प्राप्त करना चाहिए।
स्थानीय पदार्थ वितरण के कई शल्य चिकित्सा पद्धतियों का वर्णन किया गया है, इंट्रा-म्यान, इन्ट्रासेरेब्रल, और intraventricular इंजेक्शन या प्रत्यारोपण 2, 3, 4, 5 भी शामिल है। इन तरीकों, तथापि, सीएनएस के लिए दर्दनाक माना जाता है, और ब्याज के पदार्थ का केवल कम मात्रा के प्रशासन की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, यह सुझाव दिया गया है कि exogenous पदार्थों तेजी से मस्तिष्कमेरु द्रव 6 से हटाया जा सकता है 7 देखा गया है जब उपर्युक्त तकनीक कार्यरत हैं। इस तरह के मौखिक, फेफड़े, चमड़े के नीचे, और नसों में मार्गों के रूप में प्रणालीगत प्रसव के तरीके, और अधिक सामान्यतः, पशु मॉडल में इस्तेमाल कर रहे हैं, हालांकि वे सीएनएस के लिए पदार्थों के वितरण में कम प्रभाव को दिखा रहे हैं, अन्य अंगों 8, 9 द्वारा तेज की वजह से। इसलिए, प्रसव के इन मार्गों प्रशासित पदार्थों का ऊंचा खुराक की आवश्यकता होती है, दुष्प्रभाव और विषाक्तता 10, 11 का खतरा बढ़ रही है।
यहाँ, हम एक माउस अर्क microsurgery तकनीक है, जो प्रभावी ढंग से सीधे आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से मस्तिष्क में पदार्थों के उद्धार का वर्णन है। सीएनएस को प्रसव को निशाना बनाने के अलावा, इस तकनीक सामान्य शारीरिक बाधाओं को बाईपास नहीं है और इसलिए Biologica के लिए प्रासंगिक हैएल प्रक्रियाओं चिकित्सा विज्ञान या रोगजनकों मस्तिष्क में के मार्ग में शामिल किया गया।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में शामिल प्रक्रियाओं मियामी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है। इसके अलावा, सभी प्रक्रियाओं आकलन और प्रयोगशाला पशु केयर इंटरनेशनल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन (AAALAC) द्वारा अनुमोदित सुविधाओं में आयोजित किया जा रहा है।
1. सर्जरी के लिए चूहे की तैयारी
- ऑक्सीजन के साथ मिश्रित isoflurane के साथ माउस anesthetize, एक प्रयोगशाला संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करते हुए। 2 एल पर 4-5% और ऑक्सीजन का प्रवाह के बीच स्थापित करने पर isoflurane का प्रयोग / मिनट वाणिज्यिक मशीन पर (सामग्री तालिका देखें)। सर्जरी की सतह के लिए जानवर स्थानांतरण, एक stereomicroscope के तहत, और एक नाक शंकु का उपयोग कर संज्ञाहरण बनाए रखने के (- 2 एल / मिनट पर 2.5 और ऑक्सीजन का प्रवाह 1.5 स्थापना isoflurane का उपयोग करें)।
- सुनिश्चित करें कि माउस श्वसन दर लगभग 1 है - हांफते बिना 2 श्वसन / सेक। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि पशु मूंछ उत्तेजना प्रतिक्रिया और पेडल आर प्रदर्शन नहीं करताeflex (पैर की अंगुली चुटकी)। सर्जरी के दौरान श्वसन दर और प्रयास पर नजर रखने, कम से कम हर 5 मिनट। कृंतक संज्ञाहरण की निगरानी के लिए विशेष संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और पशु चिकित्सा के दिशा-निर्देशों का पालन करें।
- आदेश में सूखापन को रोकने के लिए एक बाँझ झाड़ू का उपयोग हर आंख पर नेत्र स्नेहक की एक बूंद लागू करें। विरोधी भड़काऊ और परेशानी को कम करने के लिए एनाल्जेसिक के प्रशासन की सिफारिश की है।
- जानवर अपनी पीठ पर झूठ बोल के साथ, एक नाक शंकु का उपयोग कर संज्ञाहरण बनाए रखें।
- क्षेत्र इथेनॉल 70% और chlorhexidine के साथ तीन बार पोंछते द्वारा जानवर की गर्दन क्षेत्र को साफ। एक रेजर (नीचे विस्तृत) का उपयोग कर पशु की सर्जरी क्षेत्र दाढ़ी।
2. आम मन्या धमनी के विच्छेदन (सीसीए)
- एक stereomicroscope के तहत पूरे microsurgery प्रक्रिया करते हैं। शल्य कैंची का उपयोग और संदंश छाती ऊपर से नीचे टी करने के लिए, गर्दन में एक उथले midline चीरा प्रदर्शनवह (लगभग 3 से 4 सेमी) जबड़ा।
- संदंश ध्यान से अलग वसायुक्त और संयोजी ऊतक का उपयोग श्वासनली बेनकाब करने के लिए।
- माउस की गर्दन की पीठ पर एक तकिया (गोल वस्तु, व्यास में लगभग 0.5 सेमी) गर्दन का विस्तार करने के लिए, आगे क्षेत्र को प्रकाश में लाने रखें।
- ऊतक या तो एक ऊतक प्रतिकर्षक या हुक का उपयोग अलग करें।
- श्वासनली के जानवर के बाईं ओर, ध्यान से छोड़ दिया सीसीए का पर्दाफाश करने के लिए संयोजी ऊतक के अलावा tweeze।
- संदंश का प्रयोग सावधानी से सीसीए विभाजन का पर्दाफाश करने के लिए सभी संयोजी ऊतक, और दोनों के बाह्य और आंतरिक मन्या धमनियों की शुरुआत को हटा दें।
मादक द्रव्यों के निषेचन के लिए सीसीए के 3. तैयारी
- संदंश का प्रयोग, नायलॉन सीवन (लगभग 1 सेमी प्रत्येक) के दो खंडों बाहरी मन्या धमनी के तहत (ईसीए) डालें।
- उच्चतम बिंदु ईसीए के संभावित पर एक स्थायी गाँठ रखें।
- निम्नतम बिंदु ईसीए के संभावित, सीसीए विभाजन के तुरंत बाद के संस्करण, जगह परएक हटाये गाँठ। यह गाँठ ऊपरी गाँठ की तुलना में ढीला होना चाहिए।
- एक पोत क्लिप का उपयोग कर सीसीए बंद करें, संभव सबसे कम बिंदु पर।
- आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) के एक पोत क्लिप का उपयोग बंद कर दें।
- का प्रयोग microdissection वसंत कैंची दो समुद्री मील के बीच, ईसीए (लगभग 2 मिमी) में एक छोटे से कट प्रदर्शन करते हैं।
4. आईसीए के माध्यम से पदार्थ आसव
- एक प्रेरणा प्रणाली को इकट्ठा। केशिका ट्यूबिंग के 6 इंच (आदर्श आयाम: 2.5 मिमी x 1.2 मिमी) संलग्न पदार्थ के 250 μl युक्त एक ट्यूबरकुलीन सिरिंज के लिए संचार हो (ड्रग्स, रोगजनकों, बाह्य पुटिकाओं, दूसरों के बीच में) और धीरे प्रदर्शन किया चीरा में केशिका नोक सम्मिलित 3.6 कदम में।
- केशिका नीचे स्लाइड करने के लिए जब तक यह विभाजन और सीसीए को बंद क्लिप के बीच एक मध्य तक पहुँचता जारी रखें।
- कम ईसीए गाँठ टाई नीचे। सत्यापित करें कि गाँठ केशिका तरलता अनुमति देने के लिए काफी ढीला है और काफी तंग leakin रोकने के लिए हैजी।
- आईसीए से क्लिप निकालें।
- धीरे सिरिंज पिस्टन की इजाजत दी पदार्थ आसव प्रति सेकंड पर लगभग 10 μl करने के लिए दबाव लागू होते हैं।
5. पोस्ट आसव प्रक्रिया
- प्लेस आईसीए पर वापस क्लिप।
- धीरे केशिका ट्यूबिंग हटा दें।
- नीचे कम ईसीए गाँठ बाँध पूरी तरह से।
- आईसीए और सीसीए से क्लिप निकालें।
6. चीरा समापन और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
- प्रतिकर्षक या ऊतक हुक और तकिया निकालें।
- स्वच्छ सीवन क्षेत्र बाँझ खारा का उपयोग कर।
- चीरा नायलॉन सीवन / सुई और संदंश का उपयोग बंद कर दें।
- प्रशासन विरोधी भड़काऊ और एनाल्जेसिक पोस्ट ऑपरेटिव परेशानी को दूर करने के लिए।
- कम से कम 1 घंटा और मॉनिटर वसूली के लिए हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में पशु रखें।
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Representative Results
माउस अर्क microsurgery तकनीक यहाँ वर्णित बहुत बहुमुखी है और सीधे मस्तिष्क में विभिन्न पदार्थों वितरित करने के लिए मस्तिष्क मेटास्टेसिस गठन 1, 12 के एक प्रतिनिधि मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं के वितरण सहित, इस्तेमाल किया गया है।
इस तकनीक को भी सीएनएस में विभिन्न रोगजनकों के रोग पहलुओं का आकलन करने के लिए उपयुक्त है। एचआईवी संक्रमण के एक माउस मॉडल में, संचार सर्जरी वायरल कणों सीसीए में सीधे इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हमने पाया है कि 7 दिन सर्जरी के बाद, सीएनएस सकारात्मक एचआईवी के लिए वास्तविक समय पीसीआर द्वारा किया गया था। इसके अलावा, ipsilateral गोलार्द्ध संक्रमण 6-10 contralateral गोलार्द्ध (चित्रा 2) की तुलना में अधिक सिलवटों था।
आसव सर्जरी यहाँ वर्णित का एक अन्य उपयुक्त दृष्टिकोण देने के लिए है बाह्य पुटिकाओं (ECVs), मुख्य रूप से exosomes, सीएनएस में। चित्रा 3 निषेचन के बाद एक माउस 24 घंटा के ipsilateral मस्तिष्क में CD63, exosomes के लिए एक मार्कर की उपस्थिति, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ लेबल से पता चलता है।
चित्रा 1: आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से निषेचन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डालने में (क) और (ख) के ऊपरी और निचले समुद्री मील, क्रमशः के स्थानीयकरण को दर्शाती; (ग) ईसीए में छोटे कट, जिसके माध्यम से केशिका ट्यूबिंग डाला जाता है (ग्रे लाइन) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2: एचआईवी जांच वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से वायरल आसव के बाद। बार्स मतलब एचआईवी डीएनए चूहों 7 दिन बाईं आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से निषेचन के बाद से काटा स्तरों संकेत मिलता है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन को दर्शाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से माउस ब्रेन धारा चित्रण GFP टैग CD63, एक Exosome मार्कर, ECVs आसव के बाद की इम्यूनोफ्लोरेसेंस। प्रतिनिधि छवि एक माउस मस्तिष्क CD63 व्यक्त ECVs (हरा) के साथ जुड़े microvessel दर्शाया गया है। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन।मिल = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
आसव microsurgery यहाँ वर्णित सीएनएस में विभिन्न जैविक सुविधाओं के बहिर्जात पदार्थों पहुंचाने, शरीर 1, 12 के दौरान अवांछित प्रचार-प्रसार को रोकने में बहुत सफल साबित हुई किया गया है। रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन कई सीएनएस से संबंधित बीमारियों का एक रोग विशेषता है; इसलिए रक्त मस्तिष्क बाधा के साथ बहिर्जात पदार्थों के रिश्ते का आकलन प्रमुख महत्व और ब्याज की है।
यह सर्जरी प्रस्तुत मॉडल जानवरों को सीमित आघात का कारण बनता है और बहुत कम मृत्यु दर 1, 12 के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, प्रक्रिया सीएनएस समारोह या मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह को 1, 12 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू ईसीए में सही कटौती प्रदर्शन करने के लिए है, जो केवल अनुमति चाहिएकेशिका ट्यूबिंग की प्रविष्टि। एक व्यापक कटौती का कारण होगा पदार्थ के लीक संचार हो, विपरीत साइट पर एक और ईसीए सर्जरी की आवश्यकता होती है। आदेश में इस स्थिति को रोकने के लिए, केशिका ट्यूबिंग कटौती की तुलना में एक बड़ा व्यास होना चाहिए, और यह भी आदेश धमनी के माध्यम से अपने प्रवेश द्वार की सुविधा के लिए एक तेज धार होनी चाहिए। तकनीकी पहलू के बारे में, एक पूरी तरह से प्रशिक्षित कर्मियों के लिए 20 मिनट के भीतर इस सर्जरी प्रदर्शन करने में सक्षम है।
इस तकनीक के प्रमुख सीमा ही आईसीए के माध्यम से केवल एक बार लगाने की संभावना है। सीएनएस, एक पोत microport इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है और पहले से वर्णित किया गया है 1 व्याप्ति तकनीक यहाँ वर्णित संभावित BBB के भीतर नई सकारात्मक और नकारात्मक बातचीत पर अध्ययन करने में सहायता करने के लिए, साथ ही रोगजनकों वितरित करने के लिए है में दोहराया पदार्थ वितरण के लिए , दवाओं, और मस्तिष्क में शारीरिक एजेंटों।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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